Name: 在果蝇中结合定量食物摄入量测定和强迫激活神经元研究食欲 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解定量食物摄入量测定方法，用于研究黑腹果蝇食欲调控的神经机制。该方法结合热遗传学和光遗传学技术，可同时分析多组果蝇的进食行为，为高通量筛选异常进食模式的遗传背景提供有效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作部分得到了中国国家重点基础研究发展计划（2012CB825504）、国家自然科学基金（91232720 和 9163210042）、中国科学院（CAS）（GJHZ201302 和 QYZDY-SSW-SMC015）、比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1119434）以及中国科学院百人计划（Y. Zhu）的资助。

1. 准备饲喂室
注意：用于染料标记摄食实验的摄食室由两部分组成：外部容器（作为盖子）和内部容器（作为食物来源）。
<ol>
	<li>将外部容器改为用于培养黑腹果蝇（Drosophila）的玻璃小瓶（内径为31.8 mm，高度为80 mm）（图1A，1C）。在容器底部覆盖一层1%琼脂糖（5 mL），以保持喂养装置的适当湿度，并为果蝇提供柔软的行走基质（图1B）。该容器由此提供一个受控但接近自然的环境，使果蝇所受压力和干扰最小化。
	<ol>
		<li>准备外部容器：将0.5 g琼脂糖悬浮于50 mL双蒸水中，频繁搅拌并加热，在带加热板的磁力搅拌器上煮沸至完全溶解。</li>
		<li>当1%琼脂糖冷却至约60 °C时，取5 mL倒入空的外部容器中（图1B），保持容器敞开直至冷却至室温，形成琼脂糖垫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备染料标记食物。染料标记食物的成分根据不同的实验目的而变化。以下为仅含蔗糖的染料标记食物的制备示例：
	<ol>
		<li>将0.5 g琼脂糖加入50 mL双蒸水中，频繁搅拌并加热，在带加热板的磁力搅拌器上煮沸至完全溶解。</li>
		<li>当上述1%琼脂糖冷却至约60 °C时，向其中加入1.71 g蔗糖，得到100 mM蔗糖溶液。</li>
		<li>向琼脂糖溶液中加入0.25 g蓝色染料（二钠盐依柔红），得到0.5%（w/v）的染料标记食物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备内部容器。将空的内部容器置于平坦的水平面上，然后向每个食物容器中加入750 µL蓝色染料标记食物，静置至少5分钟使其凝固。 
	注意： 内部容器为小型塑料培养皿，内径为13.6 mm，高度为7.5 mm（图1A，1C）。其内填充染料标记食物后，置于外部容器中琼脂糖垫的中央位置。</li>
	<li>将装有食物的内部容器转移至已准备好的外部容器中，并置于琼脂糖垫的中央。让喂养室在室温下保持敞开状态40分钟，直至外部容器壁上无冷凝水珠。 
	注意： 容器壁干燥是必要的，以防止果蝇接触水滴后粘附在壁上。</li>
	<li>准备不含染料的食物喂养室（成分相同但不加染料），用于背景校正。</li>
</ol>
2. 果蝇的准备
注意：通常使用羽化后5至10天的成年雌蝇进行喂养实验。建议准备不同基因型的果蝇（包括遗传对照），并平行开展测试。20只果蝇（来自一个喂养室）产生一个数据点。
<ol>
	<li>考虑饲养成虫果蝇时的种群密度。通常根据果蝇品系及培养瓶的尺寸，通过调整亲代果蝇的数量来控制种群密度。例如，将15只雄性与30只雌性Canton-S果蝇转移至一个培养瓶（直径31.8 mm，高度80 mm）中，让雌蝇产卵一天后移除成虫。</li>
	<li>准备果蝇用于热遗传学激活。
	<ol>
		<li>使用 Gal4/UAS 系统38 表达 dTRPA133 通过将 UAS-dTrpA1 果蝇与不同的 GAL4 驱动子品系杂交，在多种神经元中图2B).</li>
		<li>将成虫置于标准培养基中，在22 °C、60%相对湿度及12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养。</li>
		<li>在取食实验前两天，使用CO₂麻醉果蝇并进行分选和收集。2 在体视显微镜下将果蝇转移至新鲜食物小瓶中，每瓶保持20只果蝇的密度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备果蝇以进行光遗传学激活。
	<ol>
		<li>使用Gal4/UAS系统38 表达CsChrimson36 通过将UAS-CsChrimson果蝇与不同的GAL4驱动品系杂交，实现在不同神经元中的表达。</li>
		<li>收集羽化后24小时内新羽化的果蝇，并将其转移至含有400 µM全反式视黄醛的标准食物小瓶中。</li>
		<li>为防止过早激活，用铝箔纸包裹培养管，然后将其放入暗盒中，以保护果蝇免受不必要的光照刺激。将果蝇置于25 °C、60%湿度的黑暗环境中培养4至6天。</li>
		<li>在进食实验开始前两天，用 CO₂ 麻醉后对雌性果蝇进行分选2 在体视显微镜下将果蝇转移至培养皿中。收集20只果蝇至一个培养瓶内，并在进食测试前置于黑暗环境中。</li>
		<li>在弱光条件下尽快完成所有操作，以避免环境光造成的影响。使用放置在远离工作区域的LED灯，工作区域的光强为5 µW/cm2. 
		注意： 使用饥饿处理的 以Canton-S果蝇作为摄食实验的阳性对照。在摄食测试前24小时，将这些果蝇置于1%琼脂糖上饥饿处理。这些果蝇的食物摄入水平有助于评估每日实验的波动情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 热遗传学激活
<ol>
	<li>每天在同一时间进行所有喂养实验，大约在授时因子时间4 - 631,32，以尽量减少昼夜节律带来的差异。</li>
	<li>准备一个培养箱（或带有温控加热器的小型房间）作为加热环境。</li>
	<li>在行为实验前，将准备好的 feeding chambers 在实验温度（30 °C）下平衡 2 小时，以确保 feeding chamber 内温度相对均匀。</li>
	<li>开始喂食过程时，轻轻敲击，将20只果蝇从其原培养管中转移到预热的喂食室中。在30 °C条件下继续喂食60 min。 图3A) . 
	注意： 频繁开启和关闭培养箱门等扰动会不利地影响进食行为，因此应尽量减少。</li>
	<li>在60分钟时停止喂食，将喂食室于-80 °C（或-20 °C）冷冻30分钟。 
	注意： 冷冻有助于同时停止所有腔室中的喂食。将果蝇在 -80 °C 下冷冻有两个目的：一是安乐死果蝇，二是保存样本直至匀浆，可保存长达一周。</li>
	<li>对于温度对照组，将20只果蝇转移至室温下的摄食室，其中放置染色食物，于22 °C开始摄食过程，持续60 min。</li>
	<li>通过将培养室在 -80 °C（或 -20 °C）下冷冻 30 分钟，停止温度对照组的喂养。</li>
</ol>
4. 光遗传学激活
<ol>
	<li>每天在同一时间进行所有喂食实验，大约在昼夜节律时间 4 - 631,32，以尽量减少因昼夜节律引起的变异。</li>
	<li>通过轻柔敲击，将 20 只果蝇从一个试管小心转移至喂食室，然后将喂食室侧向放置于照明装置上（图 4A，4B）。
	<ol>
		<li>进行光遗传学操作时，使用橙色 LED 阵列（607 nm）作为光刺激源，并在 LED 上方固定一块水平的有机玻璃板，用于在照明期间支撑喂食室。将整个装置置于 25 °C、60% 湿度的培养箱中（图 4A，4B）。</li>
		<li>将遗传对照果蝇与 Taotie&#62;CsChrimson 果蝇平行进行刺激，但置于不同的喂食室中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用橙色背光持续照射 60 分钟，以维持喂食过程。
	<ol>
		<li>通过实验确定光遗传学实验的最佳光照强度36。对于 Taotie&#62;CsChrimson 果蝇，2.2 mW/mm2 的强度会引发麻痹（运动停止和姿势控制丧失），因此在喂食测试期间，应使用 0.1 mW/mm2 的中等强度刺激 Taotie&#62;CsChrimson 果蝇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将喂食室在 -80 °C（或 -20 °C）冷冻 30 分钟，以终止喂食过程。</li>
</ol>
5. 食物消耗量的视觉评估
注意： 视觉评分法可对食物消耗量进行半定量估算。尽管该方法的客观性不如光学方法，但它能够及时检测大量果蝇品系，适用于遗传筛选的初筛阶段，可快速缩小候选范围，以便进行后续实验。
<ol>
	<li>饲喂过程结束后，在体视显微镜下，于 CO2 麻醉垫上对果蝇进行麻醉并评分。根据每只果蝇腹部内染料标记食物的体积和着色强度，分别给予评分（图2A）。 
	注：视觉评估标准：评分系统共分为4个等级，对应腹部内染色食物的不同体积和着色强度。
	<ol>
		<li>腹部未检测到染料标记食物的果蝇记为0分；腹部染料着色微弱（ barely detectable）或染色食物体积占腹部总体积不足三分之一的果蝇记为1分。</li>
		<li>腹部一半区域充满明显着色食物的果蝇记为2分。</li>
		<li>腹部超过一半区域充满明显染色内容物的果蝇记为3分（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算各实验条件下不同评分果蝇所占的比例（图2B）。</li>
</ol>
6. 食物摄取量的比色定量分析
<ol>
	<li>停止喂食后，将喂食室中的全部20只果蝇倒入一张称量纸上，然后用软毛刷将其转移至1.5 mL离心管中。 
	注意：不要同时将所有喂食室从-80 °C冰箱中取出，以免因低温容器壁上产生冷凝水而导致果蝇粘附在容器壁上。</li>
	<li>向离心管中加入500 µL PBST，使用研磨仪在60 Hz条件下匀浆5秒。
	<ol>
		<li>通过观察确认匀浆是否充分：当无法检测到明显的组织碎片时，即视为匀浆完全。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有匀浆液的离心管在13,000 rpm条件下离心30分钟，以去除细胞碎片。</li>
	<li>离心结束后，将100 µL上清液转移至96孔板的一个孔中。</li>
	<li>所有样品加样完成后，将96孔板放入酶标仪中，于630 nm波长下测定各样品的吸光度。</li>
	<li>为消除背景吸光度，需从摄食蓝色染料食物果蝇的上清液吸光度中减去摄食无染料食物果蝇上清液的吸光度。 
	注意：此步骤为可选，具体取决于所用食物的成分。当未添加染料的果蝇食物在630 nm处产生吸光度时，必须执行此步骤以消除背景干扰。</li>
</ol>

<ol><li>Gao, Q., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+feeding+and+energy+expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of feeding and energy expenditure.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).</li>
<li>Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+amino+acids+in+a+dopaminergic+circuitry+promotes+rejection+of+an+incomplete+diet+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila.</a> Cell. 156 (3), 510-521 (2014).</li>
<li>Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+feeding+behavior+in+adult+Drosophila+melanogaster+varies+with+feeding+regime+and+nutritional+state%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state.</a> J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).</li>
<li>Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fructose+receptor+functions+as+a+nutrient+sensor+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain.</a> Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).</li>
<li>Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+control+of+food+intake+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Central nervous system control of food intake and body weight.</a> Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).</li>
<li>Pool, A. H., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeding regulation in Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).</li>
<li>Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Producing+Cells+in+the+Drosophila+Brain+also+Express+Satiety-Inducing+Cholecystokinin-Like+Peptide%2C+Drosulfakinin%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109(2012).</li>
<li>Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+taste+and+calorie+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integration of taste and calorie sensing in Drosophila.</a> J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).</li>
<li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li>
<li>Itskov, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+monitoring+and+quantitative+analysis+of+feeding+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila.</a> Nat Commun. 5, 4560(2014).</li>
<li>Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calories+do+not+explain+extension+of+life+span+by+dietary+restriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila.</a> PLoS Biol. 3 (7), e223(2005).</li>
<li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CApillary+FEeder+Assay+Measures+Food+Intake+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (121), (2017).</li>
<li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J Vis Exp. (3), e193(2007).</li>
<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+feeding+assay+in+adult+Drosophila+reveals+rapid+modulation+of+food+ingestion+by+its+nutritional+value%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value.</a> Mol Brain. 8, 87(2015).</li>
<li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-+and+nutrient-dependent+effects+of+dietary+restriction+on+Drosophila+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Food+pH+Increases+Palatability+and+Consumption+and+Extends+Drosophila+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan.</a> J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).</li>
<li>Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste-independent+detection+of+the+caloric+content+of+sugar+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).</li>
<li>Shen, P., Cai, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuropeptide+F+mediates+integration+of+chemosensory+stimulation+and+conditioning+of+the+nervous+system+by+food%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food.</a> J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+mediates+starvation-induced+hyperactivity+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).</li>
<li>Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenetics+of+group+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster.</a> J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).</li>
<li>Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensory+receptor+required+for+food+texture+detection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila.</a> Nat Commun. 8, 14192(2017).</li>
<li>Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taotie+neurons+regulate+appetite+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Taotie neurons regulate appetite in Drosophila.</a> Nat Commun. 7, 13633(2016).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Wood, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).</li>
<li>Inagaki, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Neuromodulation+In+Vivo%3A+TANGO-Mapping+of+Dopamine+Signaling+Reveals+Appetite+Control+of+Sugar+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing.</a> Cell. 148 (3), 583-595 (2012).</li>
<li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+food+intake+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), e6063(2009).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonwalker+Descending+Neurons+Mediate+Visually+Evoked+Retreat+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila.</a> Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).</li>
<li>Ewing, L. S., Ewing, A. W. <a target="_blank" href="http://booksandjournals.brillonline.com/content/journals/10.1163/156853987x00477">Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state.</a> Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).</li>
<li>Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gustatory+physiology+and+appetitive+behavior+by+the+Drosophila+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock.</a> Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).</li>
<li>Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+feeding+and+metabolism+by+neuronal+and+peripheral+clocks+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila.</a> Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v423/n6942/full/423822a.html">Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+starvation-induced+hyperactivity+by+insulin+and+glucagon+signaling+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opposite thermosensor in fruitfly and mouse.</a> Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+short+neuropeptide+F+regulates+food+intake+and+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size.</a> J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).</li>
<li>Marella, S., Mann, K., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Modulation+of+Sucrose+Acceptance+Behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila.</a> Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).</li>
<li>Albin, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Subset+of+Serotonergic+Neurons+Evokes+Hunger+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila.</a> Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).</li>
<li>Ro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+signaling+mediates+protein+valuation+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Serotonin signaling mediates protein valuation and aging.</a> eLife. 5, e16843(2016).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本报告重点介绍在利用热遗传学和光遗传学激活手段操控摄食相关神经元的背景下，对食物摄入进行染料标记摄食实验的技术流程。这一简单且可靠的实验方案将有助于阐明候选神经元在摄食调控中的功能，测量果蝇的食物偏好，并通过基于摄食行为的遗传筛选鉴定摄食调控回路中的新参与者24。
染料标记策略可用于研究短期摄食行为。将染料——二钠盐酸性蓝（erioglaucine disodium）溶解于食物中并随食物摄入，是检测食物摄取的关键指标。Deshpande 等人证明，通过 CAFE 法和放射性同位素标记食物摄入法测定，蓝色染料本身对摄食行为无显著影响17。同样，我们的 PER 实验结果（使用染料标记或无染料的 100 mM 蔗糖溶液刺激果蝇腿部）表明，果蝇对染料标记食物与无染料食物的反应无显著差异。然而，目前仍缺乏明确数据说明该染料在Drosophila中是否无味。
除了方案中指出的关键步骤外，还需特别注意待测果蝇的整体状态。果蝇应饲...

量化摄入食物的量对于评估大脑在响应内部需求（如饥饿状态）和外部因素（如食物质量和适口性）时对摄食行为的多种调控机制至关重要1,2,3,4,5,6,7,8,9。近年来，解析果蝇（Drosophila）摄食调控神经基础的研究推动了多种实验方法的发展，这些方法可用于直接量化摄入的食物量，或作为摄食动机的指标10,11,12,13,14,15,16。
CApillary FEeder（CAFE）实验法12,13 被开发用于测量果蝇在玻璃微毛细管中摄取的液态食物量。CAFE 实验法具有高度敏感性和可重复性17，简化了摄食量的测定过程，尤其适用于长期摄食的定量分析18。然而，该实验要求果蝇爬至微毛细管尖端并倒挂取食，这一行为限制使其不适用于所有品系。此外，由于用于 CAFE 实验的果蝇必须在液态食物上培养，这种培养条件对代谢状态的影响或潜在的营养不良问题仍有待明确。
Proboscis Extension Response（PER）实验11,14通过统计果蝇对食物液滴轻触产生吻部伸展反应的频率来进行检测。该实验已被证实是评估单只果蝇摄食动机以及食物适口性和成分影响的有效方法18,19。然而，该方法并不能直接定量摄食量。
最近开发了一种半自动方法——手动喂食实验（manual feeding assay, MAFE）15。在MAFE中，通过微毛细管手动喂食一只固定不动的果蝇。由于可以同时监测喙伸展反应和食物摄入情况，MAFE适用于评估营养物质的价值以及药理学干预的影响。然而，固定果蝇可能会对其行为表现（包括摄食行为）产生负面影响。
此外，果蝇喙管与活动检测器（FlyPAD）10 被开发用于自动量化摄食行为。利用机器视觉方法，FlyPAD 记录果蝇与食物之间的物理接触，以喙管伸展的频率和持续时间作为摄食动机的指标。FlyPAD 提供了一种高通量的方法来监测自由活动果蝇的摄食行为，但该系统的灵敏度和稳健性仍有待更多研究进一步验证12。
标记策略常用于估算果蝇的食物摄取量。通常使用化学示踪剂对食物进行标记，果蝇取食后，通过检测摄入示踪剂的量来计算食物摄入量。放射性示踪剂16,17,20,21,22,23,24,25可在不均质化果蝇个体的情况下透过体壁进行检测。该方法具有极低的变异性和高灵敏度18，适用于长期的食物摄入研究。然而，使用该检测方法时，需考虑可用放射性同位素的可获得性以及不同物质在吸收和排泄速率上的差异。
使用无毒食用色素对食物摄入进行标记和追踪是一种更安全、更简便的替代方法2,3,26,27,28。果蝇在摄食含有可溶性且不可吸收染料的食物后被匀浆化，随后使用分光光度计定量测定摄入染料的量3,24,28,29。该标记策略操作简便且效率高，但存在局限性。由于果蝇在开始进食后15分钟内即开始排泄，因此根据摄入染料估算的食物摄入体积小于实际体积17。此外，该检测通常在60分钟内评估食物摄入情况，仅适用于短期摄食行为的研究24,28。而且，多种内外部因素，如基因型17、性别17、交配状态17、饲养密度30、昼夜节律31,32以及食物质量3,8,16，均会影响食物摄入量。因此，可能需要根据具体的实验条件调整摄食持续时间。除了有助于量化食物摄入外，食用色素还被用于评估食物选择行为2,19,27，以及在CAFE实验中可视化微毛细管中的弯月面12。
本文介绍了一种将神经元活性操控与染料标记方法相结合的实验方案。该策略已在我们针对成年果蝇摄食调控的神经遗传学研究中被证明具有实用价值24。视觉评分法可快速估算食物摄入量，因此适用于在短时间内对大量品系进行筛选。筛选获得的候选品系随后可通过比色法进行详细分析，以在后续研究中提供客观且精确的定量结果。
除了摄食实验外，我们还描述了热遗传学方法27,33,34,35 光遗传学36 强行激活目标神经元的方法 果蝇通过热遗传学操作激活神经元简单且便捷 果蝇 瞬时受体电位锚蛋白1（dTRPA1），是一种温度和电压门控阳离子通道，当环境温度升至23 °C以上时可增加神经元兴奋性33,37；然而，在高温下测试动物可能会对行为产生不良影响。另一种有效激活神经元的方法是 果蝇 使用CsChrimson进行光遗传学实验36，这是一种通道视紫红质的红移变体，可在光照下增加神经元的兴奋性。与热遗传学相比，光遗传学具有更高的时间分辨率，且对动物行为的干扰更小。将摄食量的定量测量与神经元活动的调控相结合，是研究摄食神经机制的有效方法。
我们详细描述了取食室的制备以及待测果蝇的准备。以Taotie-Gal4果蝇为模型24，介绍了通过热遗传学和光遗传学方法激活神经元的操作。本方案还描述了两种使用染料标记食物来定量检测摄食量的实验方法。

<table><tbody><tr><td>UAS-CsChrimson</td><td>Bloomintoon</td><td>55135</td><td></td></tr><tr><td>UAS-dTrpA1</td><td>Bloomintoon</td><td>26263</td><td></td></tr><tr><td>TDC1-GAL4&amp;nbsp;</td><td>Bloomintoon</td><td>9312</td><td></td></tr><tr><td>TDC2-GAL4</td><td>Bloomintoon</td><td>9313</td><td></td></tr><tr><td>sNPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>由 Z. Zhao 提供</td></tr><tr><td>NPF-GAL4</td><td></td><td></td><td>由 Y. Rao 提供</td></tr><tr><td>TH-GAL4</td><td></td><td></td><td>由 Y. Rao 提供</td></tr><tr><td>5-HT-GAL4</td><td></td><td></td><td>由 Y. Rao 提供</td></tr><tr><td>AKH-GAL4</td><td></td><td></td><td>由 Y. Rao 提供</td></tr><tr><td>dip2-GAL4</td><td></td><td></td><td>由 Y. Rao 提供</td></tr><tr><td>Taotie-GAL4</td><td></td><td></td><td>由 J. Carlson 提供</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>二钠盐亮蓝</td><td>Sigma</td><td>861146</td><td></td></tr><tr><td>全反式视黄醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>R2500</td><td>避光保存</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Amresco</td><td>9002-93-01</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养基</td><td></td><td>1 L 培养基包含：77.7 g 玉米粉，32.19 g 酵母粉，5 g 琼脂，0.726 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，31.62 g 蔗糖，63.2 g 葡萄糖，2 g 山梨酸钾，pH&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;1× PBS 缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td>1 L 1× PBS 包含：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 7.4</td><td></td></tr><tr><td>PBST 缓冲液</td><td></td><td>含 1% Triton X-100 的 1× PBS</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;研磨仪</td><td>上海精新</td><td>Tissuelyser-24</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>宁波江南</td><td>HWS-80</td><td></td></tr><tr><td>带加热板的磁力搅拌器</td><td>常州博源</td><td>CJJ 78-1</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>Thorlabs</td><td>CCS200/M</td><td></td></tr><tr><td>微孔板分光光度计</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Multiskan GO 型号：1510，货号 51119200</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>&amp;nbsp;M205FA</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>外容器</td><td>江苏海门</td><td>内径为 31.8 mm、高 80 mm 的玻璃小瓶（内尺寸）</td><td></td></tr><tr><td>内容器&amp;nbsp;</td><td>北京怡然机械厂</td><td>内径为 13.6 mm、高 7.5 mm 的塑料培养皿（内尺寸）</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>海门宁蒙</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;96 孔板</td><td>Corning Incorporated</td><td>&amp;nbsp;Costar 3599</td><td></td></tr><tr><td>LED 灯</td><td>新兴源光电</td><td>607 nm，3 W&amp;nbsp;</td><td>https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058</td></tr></tbody></table>

结合定量摄食检测与神经元强制激活技术研究食欲 果蝇

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

食物摄入受到大脑的严格调控，大脑会整合机体的生理状态、食物的适口性以及营养成分，并发出指令以启动或停止进食。解析适时且适量进食决策过程的机制，对于我们理解与摄食调控相关的生理及心理障碍具有重要意义。在实验干预（例如强制增强特定靶向神经元的活性）后，需要采用简单、定量且可靠的定量方法来测量动物的食物摄入量。本文介绍了基于染料标记的摄食检测方法，以促进对成年果蝇摄食调控的神经遗传学研究。我们综述了现有的摄食检测方法，随后逐步阐述从实验设置到数据分析的具体操作流程，该方法结合了对摄食动机相关神经元的热遗传学与光遗传学操控，以及染料标记食物摄入检测技术。此外，我们还讨论了本方法相较于其他摄食检测手段的优势与局限性，以帮助读者选择合适的实验方案。

热遗传学筛选。
异常增加的食欲会导致食物摄入量升高，无论生理需求如何。我们利用这一方案设计了一种高通量行为筛选方法，以获得与饥饿和饱食状态相关的神经元的遗传学工具（图1）。该筛选获得了Taotie-Gal424。当在30 °C条件下强制激活Taotie-Gal4神经元时，Taotie&gt;TrpA1果蝇的食物摄入量高于对照组（图2，图3）。
通过视觉评估食物消耗量。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

使用染色食物进行定量摄食检测，为评估摄食动机提供了一种可靠且高通量的方法。将食物消耗检测与热遗传学和光遗传学筛选相结合，是研究成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）食欲相关神经环路的有力手段。

食物摄入受到大脑的严格调控，大脑会整合机体的生理状态、食物的适口性以及营养成分，……

本实验的总体目标是定量测量成年果蝇的食物摄入量，从而为评估基因操作（如神经元的热遗传学和光遗传学激活）的影响提供手段。这些测量方法有助于回答摄食领域的关键问题，例如饥饿、饱腹感和食欲的神经机制。该技术的主要优势在于能够同时定量多个果蝇群体的食物摄入量，因此在基因筛选中特别适用于识别摄食异常的果蝇。首先，准备外容器所需的材料。称取0.5克琼脂糖，加入50毫升双蒸水。使用磁力搅拌器和加热板，频繁搅拌并加热至沸腾，使其完全溶解。当1%琼脂糖冷却至约60摄氏度时，将五毫升转移至一个空的外部容器中，并保持容器敞开，直至琼脂糖冷却至室温，以制备琼脂糖垫。接着，将0.5克琼脂糖加入50毫升双蒸水中。使用带加热板的磁力搅拌器频繁搅拌并加热至沸腾，以彻底溶解。当1%琼脂糖冷却至约60摄氏度时，向琼脂糖中加入1.71克蔗糖，以获得100毫摩尔的蔗糖。向琼脂糖溶液中加入0.25克蓝色染料，以获得0.5%（重量/体积）染色标记的食物。然后准备内层容器。将空的内层容器置于平坦的水平表面上。然后向各个食品容器中加入 750 µL 标记为食品用的蓝色染料。静置至少五分钟，使其凝固。将装满的内层容器转移至已准备好的外层容器中，并将其置于琼脂糖垫的中央。使用无染料食物制备饲喂室，以进行背景扣除。将饲喂室在室温下敞口放置40分钟，直至外层容器壁上无冷凝水。在进行行为学实验之前，将准备好的取食室在30摄氏度的实验温度下平衡两小时，以确保取食室内的温度相对均匀。开始取食过程时，通过轻轻敲击，将20只果蝇从其原培养管小心转移至预热的取食室中。随后在30摄氏度下继续取食过程，持续60分钟。通过将饲喂室在负80摄氏度下冷冻30分钟来停止饲喂。通过轻轻敲击，将20只果蝇从一个试管小心转移至饲喂室中。然后将饲喂室侧向放置在照明装置上。进行光遗传学操作时，使用橙色LED阵列作为光刺激光源，并在LED上方固定一块水平的有机玻璃板，以在光照期间支撑取食室。将装置置于25摄氏度、60%湿度的培养箱中。将遗传对照果蝇与Taotie-GAL4 UAS CsChrimson果蝇平行进行刺激，但需置于不同的取食室中。在橙色背光照射下继续饲喂过程60分钟。然后将饲喂室在负80摄氏度下冷冻30分钟。停止饲喂后，将饲喂室中的全部20只果蝇倾倒至一张称量纸上。然后用软毛刷将样品转移至1.5毫升离心管中。向管中加入500 µL PBST，使用研磨仪在60赫兹条件下匀浆5秒。随后通过观察确认匀浆是否充分，若无明显的组织碎片存在，即表示匀浆充分。将含有匀浆的离心管在1300 RPM条件下离心30分钟，以去除碎片。离心结束后，将100微升上清液转移至96孔板的一个孔中。为避免因碎片导致吸光度计算错误，需轻柔地从离心机中取出离心管，并小心地吸取上清液，切勿扰动沉淀物。所有样品加样完成后，将酶标板放入酶标仪中，于630纳米波长下测定各样品的吸

combining-quantitative-food-intake-assays-forcibly-activating-neurons

Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

在果蝇中结合定量食物摄入量测定和强迫激活神经元研究食欲

同时记录黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中已鉴定神经元的钙信号与摄食行为

Drosophila 幼虫的趋性关联性嗅觉学习

本视频介绍了味觉偏好检测法，这是一种行为学方法，通过检测果蝇摄取偏好物质后腹部的颜色变化，来衡量其对不同味道的有色溶液的趋向性或回避性。本方案展示了用于测定果蝇对不同蔗糖浓度溶液偏好的实验操作流程。...

味觉偏好实验：一种测量摄食行为的方法 黑腹果蝇

本视频介绍了毛细管饲喂（CApillary...

Drosophila 中食物摄取与偏好检测的毛细管饲喂（CAFE）实验方法

在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila...

一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

我们描述了一种利用果蝇（Drosophila...

一种利用简易方法测量奖赏寻求行为变化的方式 黑腹果蝇

毛细管饲喂（CAFE）实验是一种简单、经济且高度可靠的用于研究摄食机制的方法。该方法结合高度多能的遗传模式生物Drosophila...

毛细管饲喂实验测定食物摄入量 黑腹果蝇

本文描述了一种实验方案，可用于对暴露于不同宏量营养素质量食物的黑腹果蝇（Drosophila...

使用 Drosophila 幼虫进行热遗传神经元筛选时宏量营养素摄入量的定量分析

我们介绍一种果蝇的双选进食实验方案。该进食实验操作快速简便，不仅适用于小规模实验室研究，也适用于果蝇的高通量行为筛选。...

一种快速的食物偏好检测方法 果蝇

微孔板喂食实验提供了一种经济、高通量的方法，用于定量果蝇（Drosophila）的液体食物摄入量。该方法使用一个3D打印装置，将饲养果蝇的96孔微孔板与另一个含有含示踪染料喂食溶液的1536孔微孔板连接。通过分光光度法测量溶液的体积减少量。...

一种用于定量摄食行为的高通量微孔板饲喂检测法 果蝇

钙成像方法能够记录在向喙器施加溶液时清醒果蝇大脑中由味觉诱导的反应。以黑腹果蝇（Drosophila...

体内 钙成像技术用于研究成年 Drosophila 味觉诱导的神经反应

了解定量食物摄入量测定方法，用于研究黑腹果蝇食欲调控的神经机制。该方法结合热遗传学和光遗传学技术，可同时分析多组果蝇的进食行为，为高通量筛选异常进食模式的遗传背景提供有效工具。

结合定量摄食检测与神经元强制激活技术研究食欲果蝇

探索更多视频

结合定量摄食检测与神经元强制激活技术研究食欲 果蝇

探索更多视频

结合定量摄食检测与神经元强制激活技术研究食欲果蝇