结合定量摄食检测与神经元强制激活技术研究食欲 果蝇

本实验的总体目标是定量测量成年果蝇的食物摄入量，从而为评估基因操作（如神经元的热遗传学和光遗传学激活）的影响提供手段。这些测量方法有助于回答摄食领域的关键问题，例如饥饿、饱腹感和食欲的神经机制。该技术的主要优势在于能够同时定量多个果蝇群体的食物摄入量，因此在基因筛选中特别适用于识别摄食异常的果蝇。

首先，准备外容器所需的材料。称取0.5克琼脂糖，加入50毫升双蒸水。使用磁力搅拌器和加热板，频繁搅拌并加热至沸腾，使其完全溶解。

当1%琼脂糖冷却至约60摄氏度时，将五毫升转移至一个空的外部容器中，并保持容器敞开，直至琼脂糖冷却至室温，以制备琼脂糖垫。接着，将0.5克琼脂糖加入50毫升双蒸水中。使用带加热板的磁力搅拌器频繁搅拌并加热至沸腾，以彻底溶解。

当1%琼脂糖冷却至约60摄氏度时，向琼脂糖中加入1.71克蔗糖，以获得100毫摩尔的蔗糖。向琼脂糖溶液中加入0.25克蓝色染料，以获得0.5%（重量/体积）染色标记的食物。然后准备内层容器。

将空的内层容器置于平坦的水平表面上。然后向各个食品容器中加入 750 µL 标记为食品用的蓝色染料。静置至少五分钟，使其凝固。

将装满的内层容器转移至已准备好的外层容器中，并将其置于琼脂糖垫的中央。使用无染料食物制备饲喂室，以进行背景扣除。将饲喂室在室温下敞口放置40分钟，直至外层容器壁上无冷凝水。

在进行行为学实验之前，将准备好的取食室在30摄氏度的实验温度下平衡两小时，以确保取食室内的温度相对均匀。开始取食过程时，通过轻轻敲击，将20只果蝇从其原培养管小心转移至预热的取食室中。随后在30摄氏度下继续取食过程，持续60分钟。

通过将饲喂室在负80摄氏度下冷冻30分钟来停止饲喂。通过轻轻敲击，将20只果蝇从一个试管小心转移至饲喂室中。然后将饲喂室侧向放置在照明装置上。

进行光遗传学操作时，使用橙色LED阵列作为光刺激光源，并在LED上方固定一块水平的有机玻璃板，以在光照期间支撑取食室。将装置置于25摄氏度、60%湿度的培养箱中。将遗传对照果蝇与Taotie-GAL4 UAS CsChrimson果蝇平行进行刺激，但需置于不同的取食室中。

在橙色背光照射下继续饲喂过程60分钟。然后将饲喂室在负80摄氏度下冷冻30分钟。停止饲喂后，将饲喂室中的全部20只果蝇倾倒至一张称量纸上。

然后用软毛刷将样品转移至1.5毫升离心管中。向管中加入500 µL PBST，使用研磨仪在60赫兹条件下匀浆5秒。随后通过观察确认匀浆是否充分，若无明显的组织碎片存在，即表示匀浆充分。

将含有匀浆的离心管在1300 RPM条件下离心30分钟，以去除碎片。离心结束后，将100微升上清液转移至96孔板的一个孔中。为避免因碎片导致吸光度计算错误，需轻柔地从离心机中取出离心管，并小心地吸取上清液，切勿扰动沉淀物。

所有样品加样完成后，将酶标板放入酶标仪中，于630纳米波长下测定各样品的吸光度。通过肉眼观察并评分肠道内可检测到染料的果蝇，以量化摄食反应。激活Taotie神经元后，约58%的Taotie dTRPA1果蝇表现出强烈的摄食行为。

其中23%表现出轻微的摄食行为。通过TRPA1急性激活Taotie-GAL4神经元可显著增加食物摄入量，表明Taotie-GAL4标记的神经元参与成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）摄食行为的调控。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在操控神经元活性后定量分析成年黑腹果蝇的食物摄入量，以研究其摄食调控的神经机制。