单细胞微流控芯片分析枯草芽孢杆菌

这种微流体实验装置的总体目标是能够在恒定、高度受控的环境条件下长期观察单个细菌细胞。这种方法可以帮助回答细菌生理学领域的关键问题，例如单个细胞对压力的长期反应模式是什么，或者群体中的异质表型如何随时间变化。这项技术的主要优点是，我们可以在恒定、均匀和高度受控的环境条件下观察单个细胞谱系数十代甚至数百代。

根据文本方案制备 PDMS 聚合物后，将硅胶母版放在聚苯乙烯培养皿中的一块未破损的铝箔上。将脱气的 PDMS 混合物倒在母版上，深度约为 5 毫米。然后将培养皿脱气至少 10 分钟。

将 PDMS 在 60 摄氏度的烘箱中固化至少 1 小时，然后冷却至室温。然后从板上取下包含母版和固化 PDMS 的铝箔。小心地划线，然后从母版后面撕下铝箔。

然后小心地从母版上剥离 PDMS。作为晶圆，通常包括几个尺寸略有不同的微流体器件。使用干净、锋利的手术刀将单个装置切割成合适的尺寸。

在设备的图案侧放置一条半透明的办公胶带，以增强图案特征的可见性。入口和出口被标识为可见流路相对端的圆形区域。翻转 PDMS 设备，图案面朝下，并使用 0.75 毫米活检打孔器穿过设备到达标记的点。

然后丢弃打孔。可能需要镊子从设备上去除穿孔。将清洁并干燥的盖玻片和 PDMS 设备插入氧气等离子清洁器中，然后按照此处显示的设置对设备进行等离子处理。

等离子体处理完成后，立即从等离子清洁器中取出设备和盖玻片。反转 PDMS 并将其放在盖板玻璃的中央，使图案侧接触玻璃。确保进料通道与盖玻片的长通道对齐。

非常轻柔地按下以确保 PDMS 密封在玻璃上。将组装好的设备放入 60 摄氏度的烤箱中烘烤至少一小时。烘烤后，轻轻推动设备的一个角，手动验证 PDMS 是否粘合到玻璃上。

根据文本协议切割聚合物管后，通过切割 2 厘米长的柔性硅胶管并将其连接到 Y 轴的顶部倒钩，将 1 厘米长的硅胶管连接到 Y 轴的底部倒钩，组装用于夹管阀的 Y 形接头。接下来，切割 10 厘米长的聚合物管，然后将它们插入 1 厘米长的硅胶管段中，将它们从一端连接到开关接头Y 型的底部倒钩将另一端的管子长度连接到 21 号针头上，这些针头已从塑料注射器适配器上取下，并从针头末端弯曲约 90 度约 9 毫米。通过将针头插入管路，将 21 号钝针连接到从注射器到开关装置的管段的一端。将每根管路的另一端插入 Y 形接头入口倒钩上的硅胶管段中。

用补充有 BSA 的细菌生长培养基填充注射器后，根据文本方案，将加载的注射器连接到准备好的 21 号针头，连接到入口管并将注射器装入注射泵。通过以高流速运行注射泵并垂直调整注射泵的方向，敲击注射器以将气泡带到顶部，从入口管道中吹扫空气。从注射器中吹出空气后，将注射泵水平放置，然后逐渐敲击或轻弹注射器上的聚合物管路，通过开关装置向上去除和吹扫任何气泡。

如果切换介质，请对第二组注射器重复此过程。吹扫气泡后，将第二阶段注射泵设置为每分钟 1.5 微升，然后暂停流路。将小活页夹放在对应于第二介质相的 Y 形液络部分支上的柔性管段上，并继续运行第一阶段泵以吹扫 Y 形液络部下游的第二种介质。

要加载 PDMS 设备，首先将空的薄凝胶加载微量移液器吸头轻轻放入微流体设备的出口孔中。使用 P200 微量移液器的薄凝胶加载吸头，通过将含有 1 毫克/毫升 BSA 的培养基注入入口孔中来钝化设备，观察吸头和出口孔以监测微流体通道的填充。在室温下孵育设备约 5 分钟。

接下来，使用类似的提示，使用出口通道中的提示将重新悬浮的细胞加载到每个通道中，以监测细胞通过设备的进度。从出口孔中轻轻取下凝胶上样头，一次取出一个，以防止损坏设备。在台式微量离心机中，在合适的转子适配器中以大约 6， 000 次 g 的速度离心设备 10 分钟。

在显微镜下验证成功加载，但未将设备固定到载玻片支架载物台插件上。将 PDMS 两侧的盖玻片贴在载物台插件的底部，小心地将加载的设备安装到载物台插件上。倒置载物台插件设备组件，使 PDMS 朝上，并将其放在柔软的表面上，例如无尘擦拭布。

将第一阶段注射泵的流速调整为每分钟 35 微升。然后一次使用一条通道，插入入口针，然后插入流向废液烧杯的出口针。目视检查设备是否有泄漏后，检查出口管是否有多余的细胞，这些细胞在培养基弯液面中表现为浑浊条纹，这些细胞会慢慢地向废液烧杯移动。

设备运行约 15 分钟后，将第一阶段注射泵设置为每分钟 1.5 微升，然后暂停流速。将整个泵和设备装置带到倒置荧光显微镜中，并以每分钟 1.5 微升的速度重新启动第一阶段介质流速。小心地将装有设备的载物台插件安装到显微镜上，根据需要使用胶带布置入口和出口管路。

在设备上找到合适的成像位置，然后根据需要开始成像。请注意，细胞通常需要几个小时来读取稳态、指数期生长，并且图像采集的开始可能会根据需要延迟，以便在平衡期后开始成像。要在连续几轮成像之间切换介质，请暂停第一阶段注射泵的流动，小心地从第二阶段硅胶管上解开粘合剂夹，将每个夹子移动到 Y 型液络部第一阶段分支上的硅胶管上，然后取消暂停第二阶段注射泵的流动并继续成像。

根据相差显微镜的评估，在将微流体管道连接到设备之前，如果所有或几乎所有微流体侧通道都包含一个或多个细菌细胞，则认为初始细胞加载成功。一旦装置初始加载，它就会以相对较高的流速进行平衡。如此处所示，对平衡装置的显微镜检查应显示大多数侧通道中限制在单个文件中的几个细胞。

一旦将平衡装置在 37 摄氏度下以每分钟 1.5 微升的流速置于显微镜上，细胞将在大约两个小时内恢复均匀和恒定的指数期生长。对于恢复指数期生长的细胞，可以使用明场或荧光显微镜进行至少 24 小时的可靠成像。引入培养基切换扩大了可以进行的实验范围，但也增加了灾难性细胞死亡事件的频率，因为入口处存在气泡或细胞簇，这些气泡或细胞簇脱落并通过进料通道。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约五个小时内完成。通过使用该程序，使用不同的荧光报告基因、菌株和环境条件，可以检查各种生理现象，包括非常罕见或短暂的事件。