X 射线辐照 Caco-2 细胞与 PBMC 间串扰的共培养方法研究

该共培养方案的总体目标是在存在或不存在外周血单核细胞的情况下测量电离辐射对 Caco-2 上皮细胞单层通透性和紧密连接功能的影响。这种方法可以帮助回答放射生物学和放射免疫治疗领域关于电离辐射暴露和免疫细胞功能之间可能的协同作用的关键问题。该技术的主要优点是可以测试不同的刺激和细胞群，并通过临时互补测量来观察解耦的现象。

放射程序旨在考虑 Caco-2 细胞单层，因为肿瘤体积用适当的光束和准确的剂量测定法照射，就像对患者进行放疗一样。照射前一周，将 5 次 10 至 5 个 Caco-2 细胞在 2 毫升完全培养基中接种到一个无菌的 1 微米孔径细胞培养小室中，每孔放入 6 孔细胞培养板中。将 3 毫升新鲜完全培养基加入每个孔的底部隔室中，并将细胞置于 37 摄氏度和 5%CO 2 的加湿细胞培养箱中 7 天。

在孵育的最后一天，将 25 毫升 Ficoll 添加到 50 毫升锥形管中。并小心地将 25 毫升新鲜采集的全血铺在 Ficoll 上。通过密度梯度离心分离细胞。

并使用巴斯德移液器将界面处的外周血单核细胞或 PBMC 转移到新的 15 毫升锥形管中。然后在两次 10 ml PBS 洗涤液中洗涤分离的 PBMC。在细胞培养箱中，在新鲜完全培养基中培养 PBMC 不超过 3 至 5 小时。

将光子 X 射线能量设置为 6 兆伏峰值。并将 Caco-2 细胞培养物放在 X 射线轨迹内且距离辐射源 100 厘米的 1.4 厘米厚的有机玻璃板上。然后在每个样品上放置一个 0.57 厘米厚的推注，以保证背向散射辐射分量和带电粒子的平衡。

并使用平坦对称的 20 x 20 平方厘米辐射野和每分钟 3 戈瑞的剂量率照射细胞。为了评估 Caco-2 细胞代谢活性和活力，在 24 孔板的每个孔中接种 2 次 10 次，然后用 1.25 毫升完全培养基照射第 2 个 Caco-2 细胞。然后将细胞放回细胞培养箱中 21 小时。

第二天，向每个孔中加入 100 微升每毫升 5 毫克的 MTT 溶液，并将细胞再孵育 3 小时。用 1 毫升 PBS 洗涤细胞后，向每个孔中加入 500 微升二甲基亚砜以溶解 Caco-2 细胞释放的任何甲臜晶体，并使用多孔板读数器在 570 纳米的 lambda 下评估吸光度。为了评估 Caco-2 细胞活力，用每孔 1 毫升 PBS 洗涤细胞，然后用 100 微升胰蛋白酶-EDTA 溶液在 37 摄氏度和 5% CO2 下分离细胞 2 分钟。

用 500 μL 完全培养基终止反应，并将细胞转移到单独的 1.5 mL 微量离心管中进行离心。将沉淀重悬于每管 50 微升 PBS 中，并将所得细胞悬液与等体积的台盼蓝活力染料溶液混合。在室温下 3 分钟后，在血细胞计数器中计数活的未染色和无活力染色细胞的数量。

为了评估 Caco-2 细胞的跨上皮电阻或 TEER，照射后立即将一半的 Caco-2 细胞培养物插入物转移到新板中，每个孔中加入 3 毫升新鲜完全培养基，将一半插入培养物转移到新板中，每 3 毫升完全培养基中接种 2 倍 10 至第 6 个 PBMC。然后在前 6 小时内每小时将 TEER 筷子电极放入细胞培养插件中，然后每 3 小时一次，直到照射后 48 小时。对于蛋白质印迹分析，照射后 48 小时，以 40 微升/1 乘以 10 裂解 Caco-2 细胞和 PBMC 至细胞裂解缓冲液的第六个细胞。

裂解和刮擦 Caco-2 细胞时，注意不要将多孔膜从插入片段上分离，否则可能导致细胞裂解物损失和结果偏差。将裂解的细胞样品储存在零下 20 摄氏度。通过二辛可宁酸法定量每个细胞裂解样品中的总蛋白量后，向单个微量离心管中的每个总蛋白样品中加入等体积的补充有 β-巯基乙醇的 Laemmli 样品缓冲液。

将样品在 95 摄氏度下加热 5 分钟。然后通过离心收集变性蛋白质，并将相等总体积的每个样品加载到 4% 至 20% 的预制凝胶中。在 120 伏电压下运行样品 1 小时。

然后使用半干式电转印系统将蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜上。接下来，将膜放入容器中，用 5% 脱脂奶粉的 PBS 溶液和补充 0.2% 吐温 20 的 PBS 封闭非特异性结合位点，在室温下轻轻搅拌 60 分钟。封闭孵育结束时，用 10 mL 0.2% PBS Tween 20 洗涤膜 3 次，每次洗涤 5 分钟，并在室温下用适当的目标一抗标记膜 1 小时，轻轻搅拌。

在 4 摄氏度下轻轻搅拌孵育过夜后，如前所述，用 0.2% PBS 吐温 20 洗涤膜 3 次，并在室温下用适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育 60 分钟，轻轻搅拌。3 次 PBS 洗涤后，用增强型化学发光溶液试剂盒孵育膜。然后使用适当的扫描系统对生成的胶片进行成像，并使用合适的图像分析程序对结果进行量化。

高达 10 戈瑞不会改变照射后 24 或 48 小时的 Caco-2 细胞代谢活性，尽管两种剂量的细胞活力都会随着时间的推移而降低。暴露于两种戈瑞辐射后未共培养的 Caco-2 细胞的 TEER 评估显示，在照射后长达 48 小时内，TEER 值一致。然而，在 10 戈瑞照射后，细胞在照射后 3 小时开始表现出 TEER 的长期下降。

与 PBMC 共培养导致 TEER 降低，从两种剂量的照射后 3 小时到照射后 30 小时都很明显，此时 TEER 值似乎保持相对一致。紧密连接蛋白的 Western blot 分析显示，响应照射和/或 PBMC 共培养的 Claudin-1 或 Occludin 表达没有差异，而在各种支架蛋白中观察到较大的波动。此外，NF-kappa B 总蛋白在任一剂量的照射下均不受影响，而 XIAP 蛋白水平在两种剂量下均上调四倍。

使用该程序，可以添加其他生物刺激（如肠杆菌）来回答有关不同生物刺激如何改变良好的单层对电离辐射暴露的响应的其他问题。观看本视频后，您应该对如何测量电离辐射和免疫细胞对 Caco-2 细胞通透性和紧密连接复合物表达的影响有很好的了解。