Name: X 射线辐照 Caco-2 细胞与 PBMC 间串扰的共培养方法研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 了解X射线辐照Caco-2细胞与PBMC共培养方法，通过测量跨上皮电阻和蛋白质印迹分析评估肠道上皮屏障功能变化。该技术为放射生物学和放射免疫治疗研究提供重要实验框架。

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本工作部分得到了意大利核物理研究所（INFN）通过 INFN-MERIDIAN 项目提供的资助。作者感谢意大利的里雅斯特大学物理系 Edoardo Milotti 教授在 INFN-MERIDIAN 项目协调方面所做的工作；感谢意大利维罗纳大学生物技术系 Roberto Chignola 博士提供 Caco-2 细胞和欧姆计，并给予宝贵的技术帮助与培训。我们还感谢 Agnese Solari 提供的技术协助。

以下方案涉及从健康志愿者体内采集血液。捐献者在入组前已签署书面知情同意书。该程序符合《赫尔辛基宣言》的要求，血液采集由专业医疗辅助人员完成。
1. 细胞培养与共培养体系的建立
<ol>
	<li>照射前一周，制备含有 2.5 × 10⁵ 个细胞的 Caco-2 细胞悬液5 细胞/mL，置于新鲜的RPMI1640培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。</li>
	<li>将2 mL细胞悬液接种于无菌的6孔板用细胞培养小室（孔径1 µm）中，并将小室放入6孔板内。 
	注意：细胞培养小室在接种细胞前可能需要先用无菌完全培养基孵育活化。在此情况下，应弃去培养基，并更换为细胞悬浮液培养基。</li>
	<li>在每个下室中加入 3 mL 新鲜的 RPMI1640 培养基，培养基中添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素，并将细胞置于含 5% CO₂ 的湿润化气氛培养箱中，于 37 °C 培养2.</li>
	<li>在Caco-2细胞照射当天，使用市售的锂-肝素涂层6 mL采血管（管尺寸：13 x 100 mm）采集人全血。</li>
	<li>随后，使用Ficoll密度梯度法分离外周血单个核细胞（PBMC）。分离PBMC时，将25 mL Ficoll加入50 mL锥形离心管中，然后将等体积用RPMI1640按1:1稀释的全血缓慢铺加在Ficoll液面上。 
	注意：一名正常的健康供体通常含有约 4 - 10 × 106 PBMC/mL</li>
	<li>将50 mL离心管在室温下以400 x g离心30分钟。</li>
	<li>用巴氏吸管轻轻吸取位于Ficoll与血浆界面处的外周血单个核细胞（PBMC），并将其转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬PBMC，250 × g离心10 min，重复洗涤两次。</li>
	<li>将PBMC在T25 cm²培养瓶中培养，时间不超过3 - 5小时2 在含5% CO₂的湿润环境中，于37 °C下，用完全RPMI1640培养基培养锥形瓶中的细胞，具体方法如前所述2. 
	注意：在实验当天采集外周血单个核细胞（PBMC），并接种 2 × 106 细胞/孔，悬浮于3 mL完全RPMI1640培养基中，置于共培养系统的下室。Caco-2细胞插入板在照射后30分钟转移至含有PBMC的孔中。若未进行刺激，自全血中分离的PBMC在体外培养中存活时间通常不超过约72小时。 例如植物血凝素（PHA），之后细胞活力丧失。 
	注意：必须在整个过程中确保所有血液和血液制品的质量与安全。</li>
</ol>
2. 照射装置设置
注意：Caco-2 细胞的照射在意大利帕维亚的圣毛杰里科学治疗护理研究所（IRCCS S. Maugeri）放射治疗科进行，使用的是常规用于治疗多种癌症类型的直线加速器。
<ol>
	<li>将X射线光子能量设置为6 MV峰值。直线加速器以脉冲模式运行（两个连续脉冲之间的时间间隔约为4 ms；单个脉冲持续时间约为5 µs，剂量率可达1 × 10-3 Gy/p）。</li>
	<li>将含有Caco-2细胞的6孔板置于X射线路径上，放置在距离辐射源100 cm处、厚度为1.4 cm的有机玻璃板上（该厚度对应的距离略大于所用辐射的建成区）。</li>
	<li>在照射前，在每个样品上覆盖一层厚度为0.5 cm的组织等效材料（bolus），以确保反向散射辐射成分及带电粒子达到平衡。</li>
	<li>使用平坦且对称（± 2%）的20 × 20 cm2辐射野和3 Gy/min的剂量率对细胞进行照射（剂量范围为2 – 10 Gy）。 
	注意：对照组&#34;假&#34;照射细胞接受与照射组相同的处理流程，但不进入辐照室（接收剂量：0 Gy）。 
	警告：电离辐射产生装置仅可由专业人员操作。</li>
</ol>
3. 细胞活力检测（MTT 检测）
注意：通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测Caco-2细胞的代谢活性14。
<ol>
	<li>在照射前24小时，于24孔板中每孔接种2 × 105个Caco-2细胞，每孔加入1.25 mL完全培养基。</li>
	<li>按照步骤2.1 - 2.4所述方法对细胞进行照射，随后将细胞置于含5% CO2的湿润环境中，37 °C培养。</li>
	<li>照射后21小时，每孔加入100 µL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，于含5% CO2的湿润环境中37 °C继续孵育3小时。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL PBS洗涤细胞一次。</li>
	<li>每孔加入500 µL二甲基亚砜（DMSO）以溶解甲臜结晶，使用多孔板读数仪在波长λ = 570 nm处测定吸光度。</li>
	<li>在照射后45小时重复步骤3.3 - 3.4 - 3.5 - 3.6。 
	注意：结果以相应假照组（归一化为100%）的偏差形式表示。 
	警告：DMSO易燃，对皮肤、眼睛和呼吸系统具有刺激性（GHS07, GHS08）。若接触眼睛，应立即用大量清水冲洗，并寻求医疗建议。MTT对皮肤、眼睛和呼吸系统具有刺激性（GHS07, GHS08）。若接触眼睛，应立即用大量清水冲洗，并寻求医疗建议。</li>
</ol>
4. 活细胞百分比测定（台盼蓝染料排斥法）
注意：通过台盼蓝染料排斥法检测活细胞百分比。
<ol>
	<li>在照射前24小时，将2 × 105个Caco-2细胞接种于24孔板中，每孔加入1.25 mL完全培养基。</li>
	<li>用0 - 10 Gy剂量范围的射线照射细胞，随后将细胞置于含5% CO2的湿润环境中，于37 °C孵育24 - 48小时（参见步骤2.1 - 2.4）。</li>
	<li>在选定的两个时间点后，用PBS洗涤细胞，弃去PBS，然后加入100 µL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。将细胞置于含5% CO2的湿润环境中37 °C孵育2分钟，随后加入完全培养基以终止酶反应。</li>
	<li>将细胞收集至1.5 mL离心管中，在500 × g下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于50 µL PBS中。</li>
	<li>将细胞悬液与50 µL台盼蓝染色液混合，在室温下孵育3分钟。</li>
	<li>使用布雷克计数板（Bürker chamber）计数染色（非活细胞）和未染色（活细胞）的细胞数量。</li>
</ol>
5. 跨上皮电阻（TEER）
<ol>
	<li>在照射前一周，于6孔板共培养小室（聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），2 × 106 孔/cm2）中接种5 × 105 个Caco-2细胞。</li>
	<li>照射前1小时，使用伏特计/欧姆计测量跨上皮电阻（TEER）。</li>
	<li>按照步骤2.1 - 2.4所述条件对细胞进行照射。</li>
	<li>将Caco-2细胞在37 °C、含5% CO2 的湿润气氛中培养，培养时可选择是否与PBMC共培养。</li>
	<li>照射后最初几小时内每小时测量一次TEER，之后每3小时测量一次，直至48小时。</li>
</ol>
6. 紧密连接蛋白-1、闭合蛋白、Afadin、ZO-1、ZO-2、NF-κB 和 XIAP 的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>在6孔板共培养小室（PET，2 × 106 孔/cm2）中，于X射线照射前1周接种&#160;5 × 105 个细胞，并按照步骤2.1 - 2.4所述进行细胞照射。</li>
	<li>将Caco-2细胞在37 °C、含5% CO2的湿润环境中，与或不与PBMC共培养条件下孵育。</li>
	<li>照射后48小时，使用细胞裂解缓冲液制备Caco-2和PBMC的细胞裂解液，并将样品储存于-20 °C。 
	注意：此处可暂停实验流程。</li>
	<li>采用二辛可宁酸（BCA）法测定总蛋白含量。 
	注意：此处可暂停实验流程。</li>
	<li>取等量总蛋白与含β-巯基乙醇的Laemli上样缓冲液混合（β-巯基乙醇终浓度为5%），95 °C加热5分钟，然后以10,000 × g离心。</li>
	<li>将样品上样至4 - 20%预制胶，于120 V电压下电泳1小时，随后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
	<li>用含0.2% Tween-20的PBS（PBT）配制的5%脱脂奶粉（NFDM）在室温下孵育PVDF膜，以封闭非特异性结合位点。用10 mL 0.2% PBT洗涤膜三次，每次5分钟。</li>
	<li>室温下轻柔振荡孵育膜1小时后，加入以下一抗于4 °C过夜孵育：抗claudin-1抗体、抗ZO-1抗体、抗ZO-2抗体、抗afadin抗体、抗occludin抗体、抗NF-κB抗体、抗XIAP抗体及抗actin抗体。用10 mL 0.2% PBT洗涤膜三次，每次5分钟。</li>
	<li>室温下轻柔振荡孵育膜1小时，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。用10 mL 0.2% PBT洗涤膜三次，每次5分钟。</li>
	<li>室温下使用增强型化学发光试剂盒孵育膜，显影X光胶片。</li>
	<li>使用扫描系统获取X光胶片图像，并采用合适的图像分析软件对条带进行定量分析。 
	注意：Claudin-1、Occludin、Afadin、ZO-1和ZO-2的检测在Caco-2细胞中进行；NF-κB和XIAP的检测在PBMC中进行。 
	警告：β-巯基乙醇有毒（GHS05、GHS06、GHS08、GHS09），请勿吸入蒸气，避免释放至环境中，操作时应佩戴个人防护装备和呼吸防护装置。如误吞食，应立即寻求医疗建议。</li>
</ol>
7. 统计分析
<ol>
	<li>为确定辐射暴露和共培养是否引起具有统计学显著性的扰动，对重复测量数据进行双因素方差分析（ANOVA）检验，并采用多重比较方法（通过Bonferroni事后检验比较重复测量的均值）。</li>
	<li>若无特别说明，采用双尾Student's t检验计算统计学显著性（p值）。每个数值均为≥3次独立实验的均值±均值标准误（SEM）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

结直肠癌在发达国家发病率较高，是人群中导致发病和死亡最常见的原因之一。该病通常采用手术、化疗和放疗进行治疗1。在放疗治疗的框架下，必须特别关注健康组织暴露于辐射所造成的影响4；此外，开展辐射暴露与免疫系统之间关系的系统性研究，对于开发放疗-免疫联合治疗策略至关重要3。
本研究中采用的方法针对Caco-2细胞与PBMC之间相互作用的探究进行了优化。我们重点关注了X射线照射肿瘤细胞所产生的效应，但该相同方案亦可适用于药理学试剂的相关研究。相较于标准的细胞培养条件，该方法更接近生理状态，其显著优势在于能够对复杂系统进行完整解析，即可同时分析不同细胞类型以及信号分子在共培养体系两个区室中的释放情况。通过这种方式，常规的生物学方法有助于深入理解细胞间相互作用的相关机制。
对X射线诱导的Caco-2细胞效应的初步表征基于两项互补的测量方法， 即 MTT比色法和台盼蓝染料排斥试验。这两种方法结果看似不一致，可能是由于它们的检测重点不同所致。MTT法检测的是氧化还原酶的活性，而台盼蓝染料则基于活细胞排斥染料的原理。
研究Caco-2与PBMC相互作用需要构建一层完整的上皮细胞单层，以实现共培养体系中两个腔室之间的完全分隔。将Caco-2细胞接种于共培养小室中，可确保仅对该细胞群体进行辐照。由于共培养在辐照之后才开始，因此可避免PBMC意外暴露所导致的偏差。该实验装置在操作过程中需格外小心，以防止在将小室从一个6孔板转移至另一个6孔板时对细胞单层造成损伤或污染。若操作得当，跨上皮电阻（TEER）测量是一种简单且非侵入性的方法，可用于评估细胞单层的通透性。该检测方法与共培养装置密切相关，并非评估单层通透性的唯一选择。只要使用新鲜完全培养基进行良好校准，该方法可实现较高的测量重复性。常规检测通常聚焦于化学染料从上室 &#34;顶端的&#34; 隔室至底部 &#34;基底外侧&#34; 一（例如 异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖检测16然而，由于本研究中PBMC存在于基底外侧区室，我们决定避免在实验中引入化学试剂。
在本研究采用的各种技术中，跨上皮电阻（TEER）测量是唯一需要共培养体系的技术17,18。然而，其他常见的实验室技术在应用于共培养细胞时可提供更具信息量的结果，因为这些技术能够研究更接近生理条件的实验体系，所得数据具有更强的生物学意义。另一方面，需要注意的是，使用生长在多孔支撑膜上的细胞可能在样品制备操作过程中带来一些困难，例如在制备用于Western blot分析的细胞裂解物时的细胞裂解步骤。
本研究采用的系统具有进一步改进的潜力，e.g. 可通过应用能够重建细胞外基质微环境的物质来实现。然而，这也将导致系统的复杂性增加，从而更难对整个体系进行完全解析。
细胞共培养体系无疑是推动研究进展的有力工具 体外 研究以及对复杂系统的理解。该技术有望增进对基本机制的认识，为分子信号传导的基础研究提供新的依据，并可能应用于肿瘤学临床患者管理中免疫系统活性的调控。

本研究采用的方法旨在探究结直肠癌细胞与免疫系统之间的相互作用，相较于常规的二维细胞培养，该实验体系更接近生理条件。
结直肠癌（CRC）是全球第三常见的癌症类型，全球每年病例超过一百万例（全球癌症观察站，国际癌症研究机构，世界卫生组织，http://gco.iarc.fr）。结直肠癌的常规治疗手段包括手术、化疗或放疗1。与手术或化疗等侵入性治疗相比，放疗通过局部递送辐射剂量，可在很大程度上避免这些临床方法引起的典型全身性不良反应。然而，辐射可能对周围正常组织产生副作用，引发炎症，直接损伤健康细胞，并通过非靶向效应介导组织损伤2,3,4。针对结直肠癌治疗过程中放疗引起的不良反应，需重点关注两个方面。首先，辐射可能改变导致肠道屏障功能受损的机制，从而影响肠道对细菌群体的正常屏障作用，并促进分子和溶质的旁细胞通透，进而引发副作用。其次，肠道相关淋巴组织（GALT）作为免疫系统的重要前哨，具有控制细菌增殖和调节整体免疫应答的功能5,6,7。为实现上述功能，肠道屏障的完整性依赖于细胞膜间连接复合体的功能。基于上述原因，本研究探讨了不同剂量X射线单独作用于Caco-2细胞以及Caco-2细胞与PBMC共培养体系时所诱导的有害效应。
尽管在生物医学研究中，细胞培养研究是首要的初步研究手段，但在研究器官、系统和器官组的生理学时，由于难以在实验室中轻易重现这些复杂结构，人们对驱动细胞生物学及不同类型细胞之间相互作用的机制缺乏深入了解，这可能成为研究中的关键限制因素。因此，我们决定采用共培养体系，以便同时研究两种细胞群体，并解析与细胞间和细胞外机制相关的各个方面。
共培养技术常用于研究上皮细胞功能以及不同类型细胞之间的相互作用。在我们的研究中，尤其必须采用这种技术，因为上皮组织由具有极性的细胞构成。以肠道屏障为例，肠上皮细胞表现出明确的极性特征，其顶端和基底外侧端通常因紧密连接黏附分子的存在而被分隔开。这种区室化结构对组织生理功能至关重要，可防止分子通过细胞旁路途径跨膜转运，并仅允许特定分子选择性通过。显然，这种特性无法通过常规的细胞培养体系重现。此外，采用共培养体系可模拟免疫细胞仅存在于基底外侧表面的情况，而顶端表面（相当于肠腔）则不直接与其他细胞接触。
近年来，Caco-2细胞系作为体外模型的重要性日益增加 体外 肠道屏障模型。尽管源自人结肠腺癌，Caco-2 细胞仍具有分化能力，并可形成具有功能的极化单层细胞结构8，可在细胞于共培养小室中生长时用于研究细胞膜特性。
由于在多孔膜上培养Caco-2细胞是一种成熟的方法 体外 肠道单层模型的一个改进是Caco-2细胞与其他细胞的共培养体系。该体系已被广泛用于检测不同类型细胞之间的相互作用。9 并可用于揭示在共培养条件下Caco-2细胞对外源刺激的扰动反应，相对于单独培养的Caco-2细胞。
许多研究探讨了Caco-2细胞在与非致病性细菌及外周血单个核细胞共培养时的行为，尤其旨在阐明其与免疫系统之间的相互作用10。Pozo-Rubio et al.11 研究了在双歧杆菌刺激Caco-2细胞的Caco-2/PBMC共培养体系中多种细胞因子的表达情况。他们的工作表明，细胞因子表达谱的改变显著依赖于是否存在PBMC条件下的细菌刺激。研究结果表明，PBMC的存在使Caco-2细胞对双歧杆菌更为敏感。
不同的研究团队已评估了Caco-2细胞对非致病性和致病性细菌的不同反应。Parlesak et al.12 证明了Caco-2细胞对大肠杆菌（Escherichia coli）刺激的外周血单个核细胞（PBMC）具有免疫抑制作用。此外，Haller et al.13 研究了Caco-2细胞在受到肠致病性大肠杆菌（E. coli spp.）或非肠致病性细菌（即E. coli spp.、Lactobacillus spp.）脂多糖（LPS）刺激后的反应，进一步支持了Caco-2细胞的反应严格依赖于共培养体系中白细胞存在的推论。
通过开展多种互补的实验室检测例如 western blot，跨上皮电阻，MTT 等等。），此外，在分析共培养条件下生长的不同细胞类型时，该整体方法学所获得的结果更能代表实际发生的情况 体内此外，该装置能够分离不同的共培养区域，不仅便于研究所涉及的细胞类型，还可分析在上层释放的细胞间信号分子 与 下室或存在情况下 与 无共培养

<table><tbody><tr><td>ThinCert&lt;br/&gt; 6 孔细胞培养插件（用于多孔板）</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657610</td><td>设备</td></tr><tr><td>细胞培养多孔板，6 孔&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td>塑料</td></tr><tr><td>细胞培养多孔板，24 孔&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td>塑料</td></tr><tr><td>RPMI 1640（不含 L-谷氨酰胺）</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>试剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>DE14-801</td><td>试剂</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605C</td><td>试剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp; 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>试剂</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Heal Force</td><td>HF240</td><td>设备</td></tr><tr><td>Ficoll Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>试剂</td></tr><tr><td>离心管，50 mL，聚丙烯（PP），锥底</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>塑料</td></tr><tr><td>离心管，15 mL，聚丙烯（PP），锥底</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>塑料</td></tr><tr><td>离心机</td><td>ThermoScientific</td><td>CL31R</td><td>设备</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>试剂</td></tr><tr><td>细胞培养瓶，25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，聚苯乙烯（PS）</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690175</td><td>塑料</td></tr><tr><td>Clinac 2100 直线加速器</td><td>Varian</td><td>CLINAC 2100C/D</td><td>设备</td></tr><tr><td>3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td>试剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>试剂</td></tr><tr><td>多孔板读数仪</td><td>GDV</td><td>DV990BV6</td><td>设备</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液 0.4 %&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>K940</td><td>试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>试剂</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030125150</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Millicell-ERS 电压表/欧姆表</td><td>Millipore</td><td>MERS 00001</td><td>设备</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液（10x）</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#9803</td><td>试剂</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker 血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520</td><td>设备</td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab102536</td><td>试剂</td></tr><tr><td>2x Laemmli 样品缓冲液&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610737</td><td>试剂</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610710</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Accublock 数字干浴器</td><td>Labnet International Inc.</td><td>D1100</td><td>设备</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX 免染蛋白凝胶，10 孔，30 &amp;micro;L</td><td>BioRad</td><td>#4568093&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;Tetra 垂直电泳槽（用于小型预制胶），可同时运行 4 块胶</td><td>BioRad</td><td>#1658004</td><td>设备</td></tr><tr><td>PowerPac HC 高电流电源</td><td>BioRad</td><td>#1645052&amp;nbsp;</td><td>设备</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC 印迹标准蛋白</td><td>BioRad</td><td>#1610385&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS 电泳缓冲液</td><td>BioRad</td><td>#1610732&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Trans-Blot&amp;nbsp;Turbo Mini PVDF 转膜试剂盒</td><td>BioRad</td><td>#1704156</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Trans-Blot&amp;nbsp;Turbo 转膜系统</td><td>BioRad</td><td>#1704150</td><td>设备</td></tr><tr><td>印迹封闭剂&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1706404</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Claudin-1 (D5H1D) XP&amp;nbsp;兔单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#13255</td><td>试剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>试剂</td></tr><tr><td>ZO-1 (D7D12) 兔单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#8193</td><td>试剂</td></tr><tr><td>ZO-2 抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#2847</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Afadin (D1Y3Z) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>&amp;nbsp;#13531</td><td>试剂</td></tr><tr><td>抗 Occludin 抗体</td><td>Millipore</td><td>ABT146</td><td>试剂</td></tr><tr><td>抗 NF-κB p65 抗体 [E379]</td><td>Abcam</td><td>ab32536</td><td>试剂</td></tr><tr><td>抗 XIAP 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab21278</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Amersham ECL 小鼠 IgG，HRP 标记全抗体（来源于羊）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Amersham ECL 兔 IgG，HRP 标记全抗体（来源于驴）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 显色底物，200 mL</td><td>BioRad</td><td>#1705060&amp;nbsp;</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Carestream&amp;nbsp;Kodak&amp;nbsp;放射自显影 GBX 显影液/补充液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Carestream&amp;nbsp;Kodak&amp;nbsp;放射自显影 GBX 定影液/补充液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Carestream&amp;nbsp;Kodak&amp;nbsp;BioMax&amp;nbsp;感光胶片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z370401</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ 成像系统</td><td>BioRad</td><td>#1708270&amp;nbsp;</td><td>设备</td></tr></tbody></table>

一种共培养方法用于研究x射线照射的caco-2细胞与pbmc之间的相互作用

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

本研究采用的实验方案旨在揭示X射线如何干扰肠道屏障功能，重点关注结直肠肿瘤细胞与免疫系统之间的相互作用。结直肠癌是最常见的癌症类型之一，通常采用手术、化疗和放疗进行治疗。放疗在靶向肿瘤方面的优势已被广泛认知。然而，即使健康组织受到有限剂量的照射也令人高度关注，尤其是其对肠道屏障和免疫系统的影响。本研究所采用的实验装置使得在相较于常规细胞培养更接近生理条件的情况下，研究两种细胞群体之间的相互作用成为可能。为此，我们采用了多种技术，并使用了 体外 共培养模型，基于分化为单层的Caco-2细胞与PBMC在相同培养基中共同培养。该方案旨在同时研究宏观效应， 即 细胞活力和跨上皮电阻（TEER），并通过蛋白质印迹检测分子改变， 即 免疫细胞中炎症通路的激活以及Caco-2细胞中紧密连接蛋白的表达。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）和台盼蓝染色法初步评估辐射对Caco-2细胞活力的影响，同时使用专为共培养系统设计的欧姆计在固定时间间隔测量跨上皮电阻（TEER）。通过该方法，可展示辐射、外周血单个核细胞（PBMC）的存在以及二者可能的协同作用所产生的影响。借助这些互补技术，我们观察到Caco-2细胞在2–10 Gy X射线照射范围内具有较高的放射抗性，且当加入PBMC后，Caco-2单层细胞的通透性增加。特别是，PBMC的存在与紧密连接支架蛋白表达水平的变化相关。

实验前一周，将细胞接种至插入式培养皿的多孔膜上，并在随后的数天中使其生长。可通过倒置显微镜观察或通过测量跨上皮电阻（TEER）值来评估细胞汇合程度。事实上，在细胞生长过程中，TEER值持续上升，直至多孔膜表面完全被细胞覆盖，形成分化良好的单层细胞。若细胞增殖速度较快或较慢，可在接种后较早或较晚的时间点启动实验。当细胞达到汇合状态后，应将其尽快转移至辐照设施，以尽量减少环境因素（如温度或pH值）带来的应激，随后开始与/不与外周血单个核细胞（PBMC）共培养（PBMC接种于底部腔室，图1A），或评估Caco-2细胞的增殖情况。根据初始接种密度，第0天时细胞应达到100%汇合，并形成分化的上皮细胞单层，该现象可通过TEER值趋于平稳得到证实（图1B）。一旦细胞达到此状态，在持续更换新鲜培养基（每周至少一次）的条件下，TEER值在接下来的一周内将保持相对稳定（图1B）。如图1C所示，MTT法检测结果显示，无论接受的辐射剂量如何（最高达10 Gy），Caco-2细胞的增殖状态在24小时和48小时均未出现具有统计学意义的改变。
关于Caco-2细胞的短期死亡率，观察到了不同的结果。在两个时间点，台盼蓝染色均显示细胞死亡率呈剂量依赖性增加。这些结果表明辐射暴露具有明显效应，尽管死亡细胞的比例似乎非常低，尤其是考虑到最高给予剂量（10 Gy）仅导致约20%的细胞死亡（图1D）。
样品在下层室中与或不与外周血单个核细胞（PBMC）共培养。鉴于PBMC未接受任何外部刺激以促进增殖，因此选择48小时的实验时长被认为较为理想，可避免因PBMC开始死亡而引入偏差。因此，从照射前即刻开始，持续定期测量经内皮电阻（TEER）达48小时，以追踪照射方案可能引起的短暂效应。如图1 E-F所示，TEER值以相对于处理前状态的相对变化形式呈现（处理前数值约为1200 - 1500 Ω·cm2），以便更清晰地突出X射线照射和/或共培养体系中PBMC存在与否所诱导的扰动。在两种情况下，辐射暴露后的第一个时间点均可明显观察到一个初始的短暂峰值，该峰值可归因于照射操作本身。
当未与PBMC共培养时（图1E），在X射线照射10 Gy后，细胞的TEER值在照射后3小时开始持续下降，而未照射组的TEER值在48小时内几乎保持恒定。外周血单个核细胞（PBMCs）的存在完全改变了TEER的时间动态特征（图1F）。对于所有剂量，从照射后3小时开始至约30小时期间，TEER值的下降均明显可见，此后TEER似乎趋于稳定并维持在恒定水平（图1F).
通过蛋白质印迹实验检测了Caco-2细胞裂解物中紧密连接复合体的表达水平。Caco-2细胞接受电离辐射处理（剂量分别为0、2和10 Gy），随后单独培养或与外周血单个核细胞（PBMCs）在下层室中共培养48小时（如图2A-F所示）。Claudin-1和Occludin的表达水平（图2A, 2B）在X射线照射和/或与PBMC共培养条件下均未发生显著改变。而支架蛋白ZO-1、ZO-2和Afadin的表达则出现较大波动（图2C, 2D, 2E）。特别是ZO-2的表达水平，在与PBMC共培养时，仅2 Gy照射后即出现下降；而单独培养的Caco-2细胞则需10 Gy照射才观察到该变化。Afadin的表达水平仅在10 Gy X射线照射后受到影响，且当Caco-2与PBMC共培养时，其下降程度进一步加剧。
针对炎症状态，分析了与Caco-2细胞共培养的外周血单个核细胞（PBMCs），特别是核转录因子kB（NF-kB）和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的水平（图2 G-I）。与经不同辐射剂量处理的Caco-2细胞共培养后，NF-kB的总量未受到影响（图2G）。相反，在2 Gy和10 Gy辐射剂量的共培养条件下，XIAP水平均上调了4倍，但较大的变异幅度提示需要增加样本量以减少波动，提高统计效能。
如图所示 图2F 和 2I，目的蛋白预期分子量附近可能会出现一些非特异性条带。如果特异性条带与非特异性条带不易区分，则应考虑更换不同的抗体和/或调整BSA或NFDM的浓度。
<img alt="Caco-2 细胞辐照装置、TEER 曲线、代谢活性和细胞活力图表、剂量反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1．辐射暴露和/或PBMC共培养的整体实验设置及宏观效应。 A）共培养模型的示意图。B）从Caco-2细胞初始接种开始每日测定的TEER值，用于评估单层细胞的正常生长与分化状态。C）细胞活力和D）暴露于X射线（0、2、5和10 Gy）的Caco-2细胞的死亡率。E）经0、2和10 Gy X射线辐照后，在无PBMCs或F）有PBMCs条件下培养的Caco-2细胞的TEER测定结果。每个数值均为≥3次独立实验的平均值±标准误（SEM）。* p值 &lt;0.05；** p值 &lt;0.01；*** p值 &lt;0.001。图表改编自Morini et al.15。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="辐射剂量-反应分析、表达图谱和蛋白质印迹、蛋白质表达研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. Caco-2细胞和PBMC裂解物的蛋白质印迹结果。 在0、2和10 Gy X射线照射后，以及在与PBMC共培养存在或不存在的情况下，Caco-2细胞中紧密连接蛋白（Claudin-1（A）、Occludin（B）、ZO-1（C）、ZO-2（D）和Afadin（E））的表达水平。数值已根据肌动蛋白（Actin）水平进行归一化处理。各紧密连接蛋白及实验条件的代表性条带图像见图（F）。与Caco-2细胞共培养的PBMC中NF-κB（G）和XIAP（H）的表达水平。NF-κB、XIAP和Actin的代表性条带图像见图中所示。每个数值均为≥3次独立实验的平均值±标准误（SEM）。图表改编自Morini et al.15。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提出了一种研究X射线照射后的Caco-2细胞与外周血单个核细胞（PBMC）之间相互作用的实验方案。该方案首先对Caco-2细胞进行X射线照射，随后建立其与PBMC的共培养体系；在48小时内定期检测跨上皮电阻，并对Caco-2细胞和PBMC分别进行蛋白质印迹分析。

一种共培养方法用于研究X射线照射的Caco-2细胞与PBMC之间的相互作用

本研究采用的实验方案旨在揭示X射线如何干扰肠道屏障功能，重点关注……之间的相互作用

本共培养方案的总体目标是，在存在或不存在外周血单个核细胞的情况下，检测电离辐射对Caco-2上皮细胞单层通透性及紧密连接功能的影响。该方法有助于解答辐射生物学和放射免疫治疗领域中的关键问题，即电离辐射暴露与免疫细胞功能之间可能存在的协同效应。该技术的主要优势在于，可测试不同的刺激因素和细胞群体，并通过特异性互补检测手段对观察到的现象进行解耦分析。放射处理的目的是将Caco-2细胞单层视为肿瘤体积，在与患者放射治疗相同的情况下，使用适当的射线束并进行精确的剂量测定。在照射前一周，将5 × 10⁵个Caco-2细胞接种于2毫升完全培养基中，加入到6孔细胞培养板的每个孔中一个无菌的、孔径为1微米的细胞培养小室插件内。在每个孔的底部腔室中加入3毫升新鲜完全培养基，并将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润细胞培养孵育箱中培养7天。在孵育的最后一天，向一个50毫升的锥形管中加入25毫升Ficoll。然后小心地将25毫升新采集的全血叠加在Ficoll上层。通过密度梯度离心法分离细胞。使用巴斯德移液管将界面处的外周血单个核细胞（PBMC）转移至新的15毫升锥形管中。随后用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤分离得到的PBMC，共洗涤两次。将PBMC置于细胞培养孵育箱中，用新鲜完全培养基培养，培养时间不超过3至5小时。将光子X射线能量设置为六兆伏峰值。将Caco-2细胞培养物置于X射线路径中，放置在距离辐射源100厘米处的一块1.4厘米厚的有机玻璃板上。然后在每个样品上放置一块0.57厘米厚的组织等效材料，以确保背向散射辐射成分和带电粒子达到平衡。使用一个平坦且对称的20厘米×20厘米辐射野，剂量率为每分钟3戈瑞，对细胞进行照射。为评估Caco-2细胞的代谢活性和存活率，在照射前24小时，将2×10⁵个Caco-2细胞接种于24孔板的每孔中，每孔含1.25毫升完全培养基。随后将细胞放回细胞培养孵育箱中培养21小时。第二天，向每个孔中加入100微升浓度为5毫克/毫升的MTT溶液，将细胞再孵育3小时。用1毫升PBS洗涤细胞后，向每个孔中加入500微升二甲基亚砜，以溶解Caco-2细胞释放的甲臜结晶，并在570纳米波长下使用多孔板读数仪测定吸光度。为评估Caco-2细胞的活力，每孔用1毫升PBS洗涤细胞，随后在37摄氏度、5%CO2条件下，加入100微升胰蛋白酶-EDTA溶液孵育2分钟使细胞脱离。 加入500微升完全培养基终止反应，并将细胞转移至各自的1.5毫升微量离心管中进行离心。每管用50微升磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀，再与等体积的台盼蓝活率染液混合。室温孵育3分钟后，在血细胞计数板中计数未染色的活细胞和染色的非活细胞数量。为了评估Caco-2细胞的跨上皮电阻（TEER），在照射后立即将一半的Caco-2细胞培养小室转移至新的培养板中，每孔加入3毫升新鲜的完全培养基；将另一半培养小室转移至预先接种了每3毫升完全培养基中含2×10⁶个PBMC的新培养板中。随后在照射后的前6小时内每小时将TEER棒状电极插入细胞培养小室一次，之后每3小时插入一次，直至照射后48小时。对于Western blot分析，在照射后48小时，使用每1×10⁶个细胞40 µL的细胞裂解缓冲液裂解Caco-2细胞和PBMC。裂解并刮取Caco-2细胞时，需注意不要将多孔膜从插入物上脱落，以免导致细胞裂解液丢失并产生偏差结果。将裂解后的细胞样品在-20摄氏度下保存。采用双辛可宁酸法测定各细胞裂解样品中的总蛋白含量后，在各个微量离心管中向等量总蛋白样品加入含有β-巯基乙醇的Laemmli上样缓冲液。将样品在 95 摄氏度下加热五分钟。然后通过离心收集变性蛋白质，并从每个样品中加载等量总蛋白体积至 4%～20% 预制胶中。在 120 伏电压下电泳运行一小时。然后使用半干式电转仪将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。接着将膜放入容器中，加入含0.2% Tween 20的PBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉，在室温下轻轻振荡孵育60分钟，以封闭非特异性结合位点。封闭结束后，用10毫升含0.2% Tween 20的PBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟，随后在室温下加入适量的目标一抗，轻轻振荡孵育1小时。在4°C条件下轻柔振荡孵育过夜后，用0.2% PBS Tween 20溶液洗涤膜三次（方法如前所述），然后在室温下轻柔振荡孵育60分钟，加入相应的一抗对应的辣根过氧化物酶标记的二抗。经过三次PBS洗涤后，使用增强型化学发光溶液试剂盒孵育膜。随后使用适当的扫描系统对所得胶片成像，并采用合适的图像分析软件对结果进行定量分析。照射剂量高达10 Gy时，在照射后24小时或48小时均未改变Caco-2细胞的代谢活性，尽管在两种剂量下，细胞活力随时间推移而下降。非共培养的Caco-2细胞在受到2 Gy照射后的TEER评估显示，照射后48小时内TEER值保持稳定。然而，在10 Gy照射后，细胞的TEER值从照射后3小时开始出现持续性下降。与PBMC共培养导致TEER降低，在两个剂量下，从照射后3小时开始明显，并持续至照射后30小时，此时TEER值似乎保持相对稳定。紧密连接蛋白的Western blot分析显示，Claudin-1和Occludin的表达在照射和/或与PBMC共培养后均无变化，而多种支架蛋白则表现出显著波动。此外，NF-κB总蛋白在两个照射剂量下均未受到影响，而XIAP蛋白水平在两个剂量下均上调了四倍。通过该实验步骤，还可以添加其他生物刺激物（如肠杆菌）来进一步探究不同生物刺激物如何改变肠道单层细胞对电离辐射暴露的反应。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估电离辐射和免疫细胞对Caco-2细胞通透性及紧密连接复合物表达的影响。

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