4.12: 沉淀和拉下化验

免疫共沉淀 （CoIP） 和沉降测定是鉴定稳定蛋白质-蛋白质相互作用的密切相关方法。这些方法与免疫沉淀有关，免疫沉淀是一种将与抗体结合的靶蛋白与未结合蛋白分离的方法。在 CoIP 中，抗体结合的蛋白质本身与另一种不与抗体结合的蛋白质结合，然后是保留蛋白质-蛋白质复合物的分离过程。pull-down 测定的不同之处在于亲和标记的诱饵蛋白取代抗体，亲和层析用于分离蛋白质-蛋白质复合物。

本视频介绍了 CoIP、沉降分析及其在实验室中的实施。涵盖了每种技术的分步方案，包括用于纯化和分析结合蛋白的试剂、仪器和仪器。此外，本视频的应用部分介绍了研究粘液病毒蛋白如何抑制流感核蛋白的程序，通过沉降测定研究钙离子在钙调蛋白中的作用，以及用于表征瞬时蛋白质相互作用的改良沉降测定。

蛋白质-蛋白质相互作用在多种生物学功能中起着重要作用。大多数蛋白质-蛋白质相互作用及其生物学效应尚未确定。免疫共沉淀 （CoIP） 和沉降测定是鉴定稳定蛋白质-蛋白质相互作用的两种密切相关的方法。本视频将介绍这两种检测的原理、它们的一般实验室程序以及这些技术的应用。

CoIP 和 pull-down 分析是免疫沉淀的变体，免疫沉淀是一种从复杂溶液中选择性分离蛋白质种类的方法。在免疫沉淀实验中，允许对靶蛋白具有特异性的抗体与样品中的该靶标形成免疫复合物。然后，复合物被捕获在固体支持物上，通常是与琼脂糖凝胶珠结合的蛋白 A。任何未捕获的蛋白质都通过离心步骤去除。然后通过在还原 SDS-PAGE 样品上样缓冲液中煮沸，将蛋白质从抗体和固体支持物中释放出来。

免疫共沉淀以相同的方式进行，只是完整的蛋白质复合物被捕获到固体支持物上。抗体与靶蛋白结合，靶蛋白又与抗体不靶向的另一种蛋白结合。与免疫沉淀一样，蛋白质复合物通过在还原 SDS-PAGE 样品上样缓冲液中煮沸从抗体和固体支持物中释放出来。

沉降测定与免疫共沉淀相似，仅在使用"诱饵"蛋白而不是抗体方面有所不同。通过分子生物学技术，这种诱饵蛋白被改造成带有亲和标签，例如一系列组氨酸残基。这些亲和标签在"基于色谱的生物分子分离"中进行了描述。然后将蛋白质捕获在标签特异性的固定化亲和配体上。然后将捕获的蛋白质与含有与"诱饵"形成复合物的蛋白质的样品一起孵育。用含有对"诱饵"蛋白上的标签具有特异性的竞争性分析物的溶液洗涤，蛋白质复合物从亲和支持物中释放出来。pull-down 测定可用于确认免疫共沉淀预测的蛋白质相互作用，以及发现未知的蛋白质相互作用。

现在已经讨论了免疫共沉淀和 pull-down 分析的原理，让我们看看它们的实验室程序。

首先，我们来讨论免疫共沉淀。向一系列微量离心管中加入以下物质：PBS 缓冲液和 50% 的蛋白 A-琼脂糖凝胶溶液，这是一种与抗体结合的树脂-蛋白质复合物。旋转微量离心管以确保正确分布，然后用额外的 PBS 缓冲液洗涤树脂。将含有所需蛋白质的细胞裂解物和2 ？g抗体加入微量离心管中，并将混合物在4 °C下旋转1小时。通过离心沉淀珠子，弃去上清液，用缓冲液重新洗涤珠子 3 次以去除未结合的蛋白质。含有抗体-蛋白质复合物的微珠位于还原型 SDS-PAGE 样品上样缓冲液中，用于从抗体中去除复合物，并通过 SDS-PAGE 和免疫印迹进行分析。

现在我们将讨论 pull-down 测定的程序："诱饵"蛋白在具有适当亲和标签的质粒中表达。达到对数期生长期后，裂解细胞，然后离心。将悬浮的链霉亲和素-琼脂糖珠（捕获生物素标记的"诱饵"蛋白）移液到微量离心管中。然后离心珠子，并通过抽吸小心除去上清液。然后用缓冲液洗涤珠子，离心，并去除上清液。

含有推定的"猎物"蛋白的细胞，该蛋白对"诱饵"蛋白具有亲和力，通过离心收获。然后将上清液加入含有树脂的微量离心管中，并在 4 ？C 在振荡器上放置 3 小时。然后离心填料，去除上清液，洗涤填料以去除未结合的蛋白质。将洗脱缓冲液加入树脂中，并将混合物在室温下在振荡器上孵育 30 分钟。然后离心树脂，并通过免疫印迹分析含有所需复合物的上清液。

现在我们已经回顾了这些程序，让我们看看免疫共沉淀和 pull-down 分析的一些有用应用。

免疫共沉淀有助于更好地了解酶的作用机制。粘液病毒或 Mx 抗性蛋白可抑制多种病毒，包括甲型流感病毒，其机制尚不清楚。免疫共沉淀研究小鼠 Mx1 蛋白与流感核蛋白之间的相互作用。

pull-down 测定已被证明可用于研究第二信使的作用，第二信使是传递来自细胞环境信号的蛋白质。它们是信号通路的一个组成部分，其中多种蛋白质响应环境线索相互作用。钙离子通过与钙调蛋白结合充当次级信使，而钙调蛋白又与多种蛋白质结合，介导多种类型的生物反应。没有钙，蛋白质就不能与钙调蛋白结合。进行 pull-down 测定以测试蛋白质在存在或不存在钙离子的情况下与钙调蛋白结合的能力。

免疫共沉淀和沉降测定通常用于分析稳定或强蛋白质相互作用，但不适用于瞬时蛋白质相互作用。沉降测定的最新发展 HaloTag 简化了瞬时蛋白质相互作用的研究;HaloTag 是一种基因编码的蛋白质融合标签，与目标蛋白质融合，能够与卤代烷固体载体发生化学反应。如果需要功能分析，则可以通过与烟草蚀刻病毒蛋白酶孵育来分离除标签的蛋白质复合物。

您刚刚观看了 JoVE 关于免疫共沉淀和 pull-down 分析的视频。本视频介绍了这两种方法的原理、一般实验室程序及其一些应用。

感谢观看！