Name: 胚胎干细胞的跨内细胞质量注射导致嵌合体率增高 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学习跨内细胞质量注射技术以提高小鼠胚胎干细胞嵌合体生成效率。该方法无需额外设备，通过简单调整胚胎方向即可提升产出，适用于发育生物学与遗传学研究。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家环境健康科学研究所内部研究计划的部分支持。特别感谢Shyamal Peddada提供的统计分析。我们还要感谢Humphrey Yao、Gary Bird和Yuki Arao对本文手稿的审阅，以及Franco DeMayo持续的支持与指导。

所有操作均在国家环境健康科学研究所基因敲除小鼠核心设施的正常运行过程中完成。所有小鼠均维持在12小时光照:12小时黑暗的循环条件下，并可自由摄取NIH-31饲料和水。ad libitum. 所有实验均依照国家环境健康科学研究所动物护理与使用委员会的规定进行。
1. 动物准备
<ol>
	<li>将 8 至 10 周龄的 B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J 雌鼠与 8 至 26 周龄的 B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J 雄鼠自然交配。次日早晨目视检查阴栓（E0.5）。</li>
	<li>将 6 至 9 周龄的 Swiss Webster 雌鼠与结扎输精管的 Swiss Webster 雄鼠自然交配作为受体鼠。次日早晨目视检查阴栓（E0.5）。</li>
</ol>
2. 胚胎干细胞准备
<ol>
	<li>对于源自129小鼠的AB2.2胚胎干细胞，使用添加15%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和0.1% β-巯基乙醇的DMEM培养基进行培养。其他所有胚胎干细胞的培养均应根据供应商提供的说明及其推荐方案进行。</li>
</ol>
3. 胚胎收集
<ol>
	<li>动物解剖
	<ol>
		<li>准备若干60 mm培养皿，每5只小鼠约需1个，另加3个备用，每个培养皿中加入10 mL囊胚收集培养基（BCM）（含10%胎牛血清的DMEM），另准备一个4孔板，每孔加入0.5 mL BCM。于37 °C、5% CO2条件下平衡。</li>
		<li>使用CO2窒息法（气流速率为10%）处死E3.5阶段的B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J雌性小鼠。</li>
		<li>处死后，将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇充分润湿腹部。</li>
		<li>在腹部中点处仅切开皮肤，切口尽可能宽；随后切开腹壁，切口也尽可能宽。 
		注意：分两步操作有助于减少或避免毛发污染。</li>
		<li>从卵巢开始，用钝头镊子夹住卵巢脂肪垫，小心分离卵巢、输卵管和子宫，注意尽量减少脂肪组织的残留。可将子宫作为一个整体取出，也可分离为单个角，后续操作无差异。</li>
		<li>取出后，立即将子宫放入盛有囊胚收集培养基的60 mm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎取出
	<ol>
		<li>准备一支10 mL注射器，装满BCM，并安装25 G针头。</li>
		<li>每次取出一个子宫，从BCM保存皿中取出后，在纸巾上轻蘸以去除多余血液，然后置于低倍解剖显微镜下的60 mm培养皿中。</li>
		<li>用解剖镊子轻轻夹住子宫远端下方（靠近输卵管处），将针头尽可能平行于子宫方向插入子宫中心，针头插入位置略超过镊尖。</li>
		<li>适当加压固定子宫于针头，然后通过子宫角推出约1 mL BCM。 
		注意：此步骤需格外小心，注射器压力过大将导致培养基喷射失控，常会溅出培养皿。</li>
		<li>冲洗完子宫后，每60 mm培养皿中可放置最多5个完整子宫，放回培养箱中孵育，等待收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎收集
	<ol>
		<li>使用手工拉制的玻璃移液管和口吸移液装置，在解剖显微镜（放大倍数25X至35X之间）下收集囊胚。（图1）。 
		注意：口吸移液装置由一段30–40 cm长、内径小于5 mm的软管组成。将1,000 µL枪头尖端朝内插入一端，另一端连接玻璃移液管。软管另一端连接一个注射器滤器，并接上一个1 mL注射器筒（无活塞），作为口含部分。</li>
		<li>从培养箱取出培养皿，采用网格扫描方式仔细检查培养皿的每个区域以寻找胚胎。将胚胎逐个吸出，转移至另一个培养皿中的BCM液滴中。</li>
		<li>收集完所有培养皿中的胚胎后，用新鲜BCM液滴清洗胚胎一次，然后转移至4孔板中，等待注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胚胎注射
<ol>
	<li>根据确认情况，使用注射针逐个拾取 ES 细胞。
	<ol>
		<li>准备一个注射培养皿，向玻璃底注射培养皿中加入 5 - 7 mL 注射培养基（DMEM、10% 胎牛血清和 20 mM HEPES）。注射在室温下进行。</li>
		<li>使用空气或油压微注射仪，对注射针施加负压以吸入 ES 细胞。注意尽量减少细胞之间的空隙。在此步骤或注射步骤中对 ES 细胞进行计数。</li>
		<li>选择与细胞总体相比中等或较小尺寸、表面光滑、无明显缺陷（如空泡）的 ES 细胞。 
		注意：ES 细胞群体在形态学质量上差异较大，所采用的标准需相应调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向胚胎中注射约 15 个 ES 细胞（图 1）。
	<ol>
		<li>将持卵管尖端连接至第二个空气微注射仪，并将胚胎置于持卵管开口附近。施加负压以固定胚胎。</li>
		<li>通过上下移动持卵管调整 Z 轴，使胚胎刚好接触载玻片，然后精细聚焦于透明带。接着调整注射针的 Z 轴，使针尖附近的 ES 细胞处于焦点位置。</li>
		<li>通过注射针在胚胎顶部或底部轻轻推动，微调胚胎位置，使其内细胞团（ICM）处于理想方位。</li>
		<li>将注射针穿过透明带，并穿过内细胞团或滋养层，采用坚定但可控的推力。对注射针的微注射仪施加轻微压力，以防止囊胚腔塌陷。</li>
		<li>当注射针穿透囊胚腔后，通过微注射仪施加压力，将 ES 细胞注入胚胎的囊胚腔内。当针尖斜面开始退出胚胎时，短暂停顿，使胚胎内压力恢复至正常水平，同时确保细胞保留在腔内。 
		注意：对照组 ES 细胞按照传统 ES 细胞注射方案正常注射9，注意避免接触内细胞团。此外，还通过内细胞团进行 ES 细胞注射，即将注射针直接穿过内细胞团（TICM）（图 2，补充视频）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 胚胎移植
<ol>
	<li>按照制造商的操作规程，使用非手术胚胎移植装置在E2.5时期将胚胎移植至Swiss Webster小鼠。该非手术操作无需麻醉或特殊术后护理。在胚胎移植后，将小鼠单独饲养，直至分娩及后续断奶阶段。</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

长期以来，人们一直认为内细胞团（ICM）的任何扰动都可能导致胚胎死亡，事实上，目前的囊胚显微注射方案仍然对此提出警示12,13。我们在此证明，通过内细胞团进行显微注射并不会对胚胎造成损害，并且能够提高嵌合体的获得率。
这种效应的确切机制尚未明确。然而，对内细胞团（ICM）及其伴随的下胚层进行机械性扰动，可能会增加显微注射后外源胚胎干细胞整合到新形成内细胞团中的概率。近期在诱导多能干细胞（iPSC）领域的研究表明，机械刺激有助于人类iPSC的重编程过程14。如果机械操作对小鼠胚胎的内细胞团具有类似作用，则可能使那些已开始分化的内细胞团细胞恢复至多能状态，从而消除囊胚供体来源细胞在形成胚胎组织时可能具有的“先发优势”。最后，显微注射穿过内细胞团的过程可能导致部分内细胞团细胞死亡，从而降低基因修饰胚胎干细胞在植入后所面临的竞争水平。
该方法改进的主要优势在于无需学习新技...

近25年来，构建基因靶向小鼠的过程一直较为缓慢，通常受限于囊胚期胚胎干细胞显微注射阶段，该步骤在产生可种系传递的嵌合体小鼠过程中形成了瓶颈。近年来的技术进步，包括在胚胎干细胞中应用CRISPR/Cas91,2进行靶向编辑，以及KOMP等高通量胚胎干细胞构建联盟的建立，已显著改善了基因修饰胚胎干细胞的生成与可获得性。然而，从这些胚胎干细胞产生可种系传递的嵌合体小鼠仍是构建基因修饰小鼠过程中的主要瓶颈3,4。高通量胚胎干细胞构建项目一直受到胚胎干细胞质量差异较大的困扰，而细胞质量对于成功生成可种系传递的嵌合体至关重要。此外，一些常用的胚胎干细胞系已知存在较高的非整倍性，且难以产生具有种系传递能力的嵌合体5。
人们已开发出多种方法来制备嵌合程度更高或完全由胚胎干细胞（ES细胞）来源的小鼠6,7,8,9,10。尽管这些方法各有优势，但也存在各自的局限性。四倍体胚胎嵌合技术虽可获得100% ES细胞来源的小鼠，但效率较低，且通常仅限于远交系小鼠5,6。较新的桑葚胚注射方法可获得接近100%的高比例嵌合小鼠，但通常需要额外的专用设备（如激光或压电装置）以及相应的技术培训10,11。在已具备这些技术条件的实验室中，这种新方法可能并非必需。
本研究的目的是寻找一种方法，利用常规技术及 readily available 设备提高嵌合体小鼠的制备效率，从而增加突变等位基因生殖系传递的机会，以建立后续的小鼠品系。

<table><tbody><tr><td>ES细胞注射针</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>NSET装置</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>10439-024</td><td>每批应单独测试其对ES细胞的兼容性。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Leica</td><td>Micro manipulator</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>4孔培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60 mm培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr&amp;#60;c-2J&amp;#62;/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>Swiss Webster小鼠</td><td>Taconic, USA</td><td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td>注射用培养皿</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

内细胞团内注射胚胎干细胞可提高嵌合率

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

为了提高通过胚胎干细胞技术制备基因修饰小鼠的效率，我们对现有的囊胚注射方案进行了改进。本文报道，通过简单旋转胚胎，并经由穿过内细胞团（Trans-Inner cell mass, TICM）的路径进行注射，可将嵌合小鼠的比例从31%提高至50%，且无需额外设备或进一步的专业培训。在为期9个月的时间内，共对26种不同的近交系克隆及总计35个克隆进行了注射。传统注射方法与TICM方法在妊娠率和胚胎回收率方面均无显著差异。因此，在不显著改变注射流程的前提下，仅需简单调整囊胚的位置并通过内细胞团注射，将胚胎干细胞释放至囊胚腔内，就有可能提高嵌合体小鼠的产量及其后续的种系传递效率。

将细胞系作为随机效应，使用混合效应线性模型在软件中分析数据（例如 SAS（版本 9.2））。每次分析均对移植的胚胎数量和细胞系进行校正。第二次分析还对存活的仔鼠数量进行了校正。
本研究中，每种ES细胞系及克隆均采用传统方法和TICM技术分别进行注射，每次注射后交替使用两种方法。注射完成后，将胚胎在培养皿中分开，并按移植批次分组，通常每只受体雌鼠移植12至15枚胚胎。若胚胎无明显可见的囊胚腔、缺少透明带，或显微注射的ES细胞未能进入囊胚腔，则从实验中剔除。
首先检测的数据是妊娠率。如图3所示，TICM组与对照组的妊娠率没有差异。此外，两组幼仔存活至断奶的比例也相同（P = 0.50，图4）。最重要的是，尽管断奶时小鼠...

本文介绍一种无需使用新设备即可提高嵌合体生产效率的实验方案。通过简单改变胚胎注射时的方位，可增加所获得胚胎的数量，并可能缩短种系传递的时间进程。

为了提高通过胚胎干细胞技术构建基因修饰小鼠的效率，我们对现有方法进行了改进……

该改良方案的总体目标是在不增加成本或延长培训时间的情况下提高嵌合体的制备效率。该方法可帮助实验室在嵌合体制备方面变得更加高效，尤其适用于胚胎干细胞（ES细胞）状态次优的情况。该技术的主要优势在于无需额外设备，也无需特殊培训。今天由 Thomas Hagler 演示该操作步骤。他是一名生物学家，也是核心实验室的研究生。为了收获胚胎，先用实验用纸巾轻拭子宫以去除多余的血液，然后将器官置于低倍解剖显微镜下的一个新的 60 毫米培养皿中。使用解剖镊子小心轻柔地夹住靠近输卵管的子宫部位，将连接在装有10毫升囊胚收集培养基的10毫升注射器上的25号针头，尽可能平行地插入镊尖稍前方的子宫中央。施加压力固定镊子，以确保针头在子宫内固定，然后轻柔地将约1毫升培养基推注通过子宫角。当所有囊胚均已冲出后，组装口吸管装置，并使用口吸管将各个胚胎转移至第二个60毫米培养皿中单独的囊胚收集培养基液滴内。然后将每个胚胎在第二滴囊胚收集培养基中洗涤，并将胚胎转移至四孔培养皿中，直至进行显微注射。开始操作时，使用显微注射仪对注射针施加负压。将含有胚胎干细胞（ES细胞）的培养皿置于显微注射镜下，此时注射针和胚胎固定移液管均已安装到位。注射成功的关键在于花时间正确设置显微镜，包括在注射针中加入适量的培养基，以及正确对齐 z 轴。使用显微注射仪对注射针施加真空。尽可能减少细胞间的空隙，从胚胎培养皿中吸取表面光滑、无明显缺陷的小到中等大小的胚胎细胞。收集至少15个细胞后，将一个胚胎移至固定器开口附近。施加负压使胚胎固定在固定器上，并上下移动持卵管以调节Z轴，直至胚胎刚好接触载玻片。精细对焦于透明带区域，并调整注射针的z轴，直至针尖附近的胚胎细胞处于焦点位置。必要时，可使用注射针轻轻滚动囊胚，直至内细胞团处于适合注射的位置。以稳定而受控的力度推动注射针，穿过透明带进入内细胞团，同时对注射针的显微注射装置施加轻微压力，以防止囊胚腔塌陷。当针头刺入胚泡腔后，施加压力于显微注射仪，将全部胚胎干细胞注入胚胎内；当针头斜面开始退出胚胎时，短暂暂停，使胚胎内压力恢复至正常水平，同时仍保留细胞。当所有胚泡均完成注射后，使用非手术胚胎移植装置，按照制造商说明将胚胎移植至2.5天孕龄的Swiss Webster小鼠体内，并在每次移植后直至分娩及断奶期间，将小鼠单独饲养。在此代表性实验中，经透明带内细胞团注射组与传统注射对照组之间的妊娠率无显著差异，且每组存活至断奶的仔鼠数量相当。值得注意的是，尽管断奶时小鼠的数量保持不变，但与对照注射组相比，转基因内细胞团注射组有显著更高比例的仔鼠表现出毛色嵌合现象。该技术最突出的优点在于，仅需简单改变胚胎的方位，即可促进嵌合体的高效生成。显微镜的正确设置至关重要。如果显微镜和显微操作仪未正确安装或维护不当，注射过程将无法成功。如果您是胚胎注射的新手，反复练习是唯一的学习途径。对初学者而言，胚胎操作通常是该操作过程中最困难的部分。能够高效地将胚胎从一个培养皿转移到另一个培养皿而不丢失任何胚胎，是实验中最关键的环节。观看本视频后，您应能充分理解对标准注射技术进行简单改进，如何帮助您提高嵌合体制备的效率。

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

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胚胎干细胞的跨内细胞质量注射导致嵌合体率增高

由于青鳉胚胎具有坚硬的卵壳和柔软的胚胎组织，其操作比斑马鱼更为复杂。本视频逐步展示了青鳉胚胎操作的各项技术，包括脱膜处理、琼脂糖包埋用于成像以及细胞移植以制备嵌合体。这些技术对于在实验室中充分利用青鳉与斑马鱼在脊椎动物基因组功能遗传解析方面的互补优势至关重要。...

青鳉胚胎去壳及用于嵌合体制备的细胞移植

关键词：青鳉，胚胎去壳，细胞移植，嵌合体，发育生物学，模式生物

使用细尖微量移液器，我们将质粒DNA注射到鸡胚体节或神经管的亚区域中。通过调整质粒浓度以获得单个转染细胞。随后，我们让这些细胞发育形成克隆群体。...

鸡胚中的单细胞转染

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。...

通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

我们展示了一种将培养细胞移植至早期小鼠胚胎特定部位的方法，以确定其 体内...

精确局部转移细胞或DNA至早期着床后小鼠胚胎的方法

本文介绍了一种通过在十天内过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和...

小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

我们描述了一种用于执行的实验方案 在子宫内...

静脉内和羊膜腔内 子宫内 小鼠模型中的移植

该方法中，胚胎心脏组织经过显微手术分离、解离、荧光标记后，植入宿主胚胎组织。这为研究异位血流动力学条件下和/或改变的旁分泌/邻近分泌环境下的细胞或组织水平发育调控提供了平台。...

基于显微注射的禽类胚胎体内植入胚胎心肌细胞系统

本文的总体目标是描述如何对鸡胚进行in...

在卵内 鸡胚血管内注射

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

学习跨内细胞质量注射技术以提高小鼠胚胎干细胞嵌合体生成效率。该方法无需额外设备，通过简单调整胚胎方向即可提升产出，适用于发育生物学与遗传学研究。

内细胞团内注射胚胎干细胞可提高嵌合率

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