An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

该方案的总体目标是无偏倚地鉴定肿瘤组织和癌细胞系中的组合染色质状态模式。这种方法可以帮助回答癌症表观遗传学领域的关键问题，例如贫瘠的组蛋白修饰状态如何促进肿瘤发生。该技术的主要优点是可以同时高效地处理多个组蛋白修饰以及多个样品。

首先，使用无菌剃须刀片手动解离 50 毫克黑色素瘤组织和 2 毫升汉克平衡盐溶液或 HBSS。将组织切成 3 或 4 毫米的小块，在无菌组织培养皿中切碎约 5 分钟。将组织溶液转移到解离管中，再加入八分之一毫升 HBSS。

使用解离剂进一步解离组织，直至匀浆。接下来，交联组织，每 3 毫升 HBSS 添加 200 微升 16% 甲醛。使用搅拌机，在 10 摄氏度下以 37 rpm 的速度摇动混合物整整 10 分钟。

从培养箱中取出样品后，每 3 mL 样品加入 200 μL 肿瘤甘氨酸，并在 37 °C 下以 10 rpm 的速度摇动混合物 5 分钟。使用台式离心机在 4 摄氏度下以 934 倍 g 离心样品 5 分钟。完成后，去除上清液并加入 5 毫升冰冷的 PBS。

然后，以 934 次 g 再次离心样品，然后去除上清液。每 50 毫克组织加入 300 微升含蛋白酶抑制剂的 ChIP 收获缓冲液，并在冰上裂解样品 30 分钟。当细胞裂解时，打开水浴干扰器和相关的冷却系统，让温度达到 4 摄氏度。

将超声仪管放入水浴干扰器中，以 30 秒开和 30 秒的时间为 30 秒对黑色素瘤组织进行超声处理 60 个循环，以获得 200 至 600 个碱基对的染色质片段。对于 8 毫克黑色素瘤组织，使用管旋转器将 3 微克每种组蛋白抗体与 20 微升蛋白 g 磁珠和 100 微升结合封闭缓冲液在 4 摄氏度下旋转孵育 2 小时。超声处理后，使用 ChIP 稀释缓冲液将样品稀释 5 次，使 SDS 浓度降至 0.1%抗体和蛋白 g 磁珠孵育完成后，去除 ChIP 稀释缓冲液，并将磁珠重新悬浮在 240 μL 新鲜缓冲液中。

然后，将 20 微升等分试样的珠子放入 12 个单独的试管中，每个试管将用于单独的组织样品。将超声处理的材料均匀地分装到含有特异性抗体的蛋白 g 珠上，并使用试管旋转器在 4 摄氏度下旋转试管过夜。在反向交联后的早晨，将抗体蛋白溶液转移到 96 孔板中，并将其放在磁力架上。

让磁珠粘附至少 30 秒后，去除上清液。使用多通道移液器用 150 微升冰冷的 RIPA 洗涤缓冲液洗涤珠子五次。每次洗涤连续移动磁力架 30 秒，然后去除上清液。

洗涤步骤后，加入洗脱缓冲液预混液，每个芯片含有 44 μL 直接洗脱缓冲液、1 μL Rnase 和 5 μL protenase k，并输入样品进行反向交联。使用 PCR 热循环仪将样品在 37 摄氏度下孵育 4 小时，在 50 摄氏度下孵育 4 小时，在 65 摄氏度下孵育 8 至 16 小时。第二天早上，将样品放回磁力架上，将上清液转移到含有氨基沉淀 DNA 的新 96 孔 PCR 板中。

向溶液中加入 2.3 x 顺磁性珠子，并使用多通道移液器小心地上下移液 25 次。然后，在室温下孵育 4 分钟。然后将样品放回磁力架上，在室温下再孵育 4 分钟。

弃去上清液后，向样品中加入 150 μL 70% 乙醇，并在室温下孵育 30 秒，不要干扰珠子。让磁珠干燥后，从磁力架中取出样品并加入 30 微升 10 毫摩尔示偏氢盐。移液 25 次混合。

在室温下孵育样品后，将它们放回磁力架上，并在室温下再孵育 4 分钟。将每个样品的 20 μL 转移到新的 96 孔板中进行文库制备。PCR 扩增后，取出样品，并使用无核水将总体积降至 100 μL。

首先向每个样品中加入 55 微升珠子，然后用移液管混合 25 次，进行双面顺磁性尺寸选择。然后在室温下孵育 4 分钟。将样品放回磁力架上，在室温下再孵育 4 分钟，以在磁珠上获得不适合测序的大片段。

孵育后，将上清液转移至新的 96 孔 PCR 板中。再加入 25 μL 顺磁珠，移液 25 次混匀，并在室温下脱离磁力架孵育 4 分钟。在室温下孵育后，将样品放回磁力架上，并在室温下孵育 4 分钟。

然后丢弃上清液。将样品放在磁力架上，加入 150 μL 70% 乙醇，并在室温下孵育 30 秒，不要干扰磁珠。去除乙醇并重复洗涤。

让磁珠干燥后，从磁力架中取出样品，并加入 25 μL 的 10 毫摩尔示热 pH 值 8.0。移液 25 次混匀，并在室温下孵育，离开磁力架 4 分钟。在室温下孵育后，将样品放回磁力架上，并在室温下孵育 4 分钟。

现在，在多重检测之前，使用高灵敏度 DNA 电泳仪对文库进行定量，以确保大小适合测序。该方案允许对冷冻肿瘤组织和细胞系进行免疫沉淀，可以在数十个样品上进行，并使用高通量方法进行平行。染色质片段应在 200 到 1000 个碱基对之间，以实现最佳免疫沉淀。

在进行文库制备之前，应对纯化的 ChIP DNA 进行定量。适用于多重检测和下一代测序的完整文库应在 200 至 600 个碱基对之间，并且不含任何引物二聚体。测序后，在进行流程的后续步骤之前，应满足许多质量控制指标，例如 macs 峰识别和 chromHmm 分析。

ChIP 样品应通过输入 DNA 富集，并且每个组蛋白修饰应显示代表表观遗传景观特定组成部分的不同谱。chrome HMM 算法使用多变量隐马尔可夫模型，根据所研究的组蛋白修饰来识别最突出的重复出现的组合和空间染色质模式。使用这 6 种修饰，chrome HMM 可识别代表抑制结构和活性结构域的功能不同的染色质状态，例如多梳抑制、异色性抑制、活性转录和活性增强子。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四天内完成。在尝试此程序时，在继续文库制备和数据分析之前，确定抗体的最佳超声处理条件和规格非常重要。为了学习此程序，可以执行其他方法，例如 RRS 测序和染色体确认捕获，以确定染色质状态部分与基因表达和较高染色质结构的结合。

实验后，该技术为癌症表观遗传学领域的研究人员探索患者肿瘤样本中的染色质状态模式铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何处理和解离肿瘤组织、进行染色质免疫沉淀、为 nextgen sequeing 准备文库、处理测序后数据以及深入了解下游分析的初始步骤有很好的了解。不要忘记，使用甲醛时，它可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如适当的通风橱。