Name: 肿瘤组织中高通量芯片测序的染色质状态全基因组图谱集成平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学习高通量ChIP测序技术，用于分析肿瘤组织中的染色质状态模式和组蛋白修饰。该方法可高效处理多样本，揭示表观遗传景观，助力癌症表观遗传学研究。

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感谢 Marcus Coyle、Curtis Gumbs 以及 MDACC 的 SMF 核心设施在测序方面提供的支持。本文所述工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（CA016672）对 SMF 核心设施的资助，以及美国国家癌症研究所（NCI）奖项（1K99CA160578 和 R00CA160578）对 K. R. 的资助。

所有临床标本的采集均遵循机构审查委员会的指南。
1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>配制 200 mL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0）。</li>
	<li>配制 200 mL STE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，10 mM EDTA pH 8.0，140 mM NaCl）。</li>
	<li>配制 200 mL 2.0 M 甘氨酸溶液（37.52 g 甘氨酸溶于 200 mL 水中），并加热至 65 °C。</li>
	<li>配制 200 mL 5% 脱氧胆酸钠（DOC）溶液（10 g DOC 溶于 200 mL 水中）。</li>
	<li>配制 500 mL ChIP 收获缓冲液（12 mM Tris-Cl，0.1× 磷酸盐缓冲液（PBS），6 mM EDTA，0.5% 十二烷基硫酸钠（SDS））。</li>
	<li>配制 500 mL ChIP 稀释缓冲液（10 mM Tris-Cl，140 mM NaCl，0.1% DOC，1% Triton-X，1 mM EDTA）。</li>
	<li>配制 500 mL RIPA 洗涤缓冲液（STE，1% Triton x-100，0.1% SDS，0.1% DOC）。</li>
	<li>配制 500 mL RIPA/500 洗涤缓冲液（RIPA 缓冲液 + 360 mM NaCl）。</li>
	<li>配制 500 mL LiCl 洗涤缓冲液（TE，250 mM LiCl，0.5% NP-40，0.5% DOC）。</li>
	<li>配制 500 mL 直接洗脱缓冲液：10 mM Tris-Cl pH 8.0，5 mM EDTA，300 mM NaCl，0.5% SDS。</li>
	<li>配制 50 mL 抗体结合/封闭缓冲液（PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0.2% 无 IgG 的 BSA）。</li>
</ol>
2. 组织/细胞系处理与交联
<ol>
	<li>若组织为速冻保存，请在冰上解冻后再进行解离。</li>
	<li>在无菌组织培养皿中，使用无菌手术刀片将50 mg组织（每种组蛋白修饰抗体约需8 mg）手动解离于2 mL Hanks'平衡盐溶液（HBSS）中，将组织切成3至4 mm大小的碎片，持续约5分钟。</li>
	<li>将组织及HBSS溶液转移至解离管中，并再加入8 mL HBSS。使用组织解离仪进一步解离组织，直至形成均一悬液。</li>
	<li>对于黑色素瘤组织，将解离管放入组织解离仪中，按以下顺序依次运行程序各一次：h_tumor_01.01、h_tumor_02.01、h_tumor_03.01 和 m_heart_02.01。</li>
	<li>从标准组织培养皿中刮取21 × 106个细胞（每种组蛋白修饰及输入样本约3 × 106个；对于稀有细胞群体，可降低至每标记10万个细胞）于10 mL培养基中，并收集至15 mL锥形管中。 
	注：代表性黑色素瘤细胞系WM115所用培养基为DMEM，添加10%胎牛血清和5%青霉素/链霉素。</li>
	<li>通过向每3 mL HBSS（组织）或3 mL培养基（细胞）中加入200 µL 16%甲醛，使终浓度为1%甲醛，对组织或细胞进行交联。在37 °C下，以10 rpm振荡混合物，精确反应10分钟。 
	注意：甲醛具有毒性，应在合适的通风橱中操作。</li>
	<li>每3 mL样本中加入200 µL 2.0 M甘氨酸，继续在37 °C下以10 rpm振荡5分钟。 
	注：甘氨酸起淬灭作用。甘氨酸溶液应每月新鲜配制，因其pH值会随时间发生变化。</li>
	<li>使用台式离心机在4 °C下以934 × g离心5分钟。弃去上清液，加入5 mL预冷的PBS，再次以934 × g离心，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀物速冻，并于-80 °C保存以备后续处理。</li>
</ol>
3. 组织裂解、超声处理和抗体准备
<ol>
	<li>每10 mL染色质免疫沉淀收获缓冲液中溶解1片蛋白酶抑制剂片剂。</li>
	<li>每50 mg组织加入300 µL含蛋白酶抑制剂的ChIP收获缓冲液，冰上裂解30分钟。 
	注意：每1×107个WM115黑色素瘤细胞系，加入300 µL含蛋白酶抑制剂的ChIP收获缓冲液。</li>
	<li>细胞裂解期间，开启水浴破碎仪及其配套冷却系统，使温度降至4 °C。将超声破碎管放入水浴破碎仪中，对黑色素瘤组织进行60个循环的超声处理（开30秒，关30秒），以获得约200–600碱基对（bp）的染色质片段。 
	注意：不同组织类型的超声时间可能不同，应相应调整。此步骤至关重要，应在进行免疫沉淀前通过预实验优化。</li>
	<li>超声过程中，每份样品每种抗体使用1000 µL结合/封闭缓冲液（PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0.2% BSA）清洗20 µL蛋白G磁珠，共清洗三次。</li>
	<li>对于约8 mg黑色素瘤组织，将每种组蛋白抗体3 µg溶于100 µL结合/封闭缓冲液中，于4 °C旋转孵育2小时（使用试管旋转仪）。12份单一抗体样品共包含240 µL磁珠、36 µg抗体和1200 µL结合/封闭缓冲液。 
	注意：对于3×106个细胞，每种抗体使用5 µg抗体和30 µL蛋白G磁珠。若使用不同量的组织，应对抗体和蛋白G磁珠进行滴定优化。本方案描述了文中所述六种组蛋白修饰的免疫沉淀条件（材料表），但对于其他修饰或转录因子，抗体浓度需另行优化。</li>
	<li>为确定片段大小，取20 µL超声处理后的染色质溶液，加入每份样品的洗脱缓冲液主混合液（室温），其中包含44 µL直接洗脱缓冲液、1 µL RNase（20 mg/mL）和5 µL蛋白酶K（20 mg/mL）。将样品置于PCR仪中，于50 °C孵育至少2小时。按照生产商说明书使用PCR纯化试剂盒纯化样品。</li>
	<li>在进入步骤3.6之前，使用高灵敏度DNA毛细电泳仪检测片段大小，确保染色质已充分剪切。开启电泳仪。</li>
	<li>在8孔光学管条的每个孔中加入2 µL高灵敏度缓冲试剂。第一孔加入2 µL高灵敏度DNA标准品，其余各孔加入2 µL纯化后的样品。</li>
	<li>盖上光学管条盖，以2000 rpm涡旋震荡1分钟。打开仪器盖，安装新的高灵敏度胶带和一盒上样吸头。取下管条盖，将样品加载至电泳仪中。</li>
	<li>打开分析软件，选中胶带上的前13个通道，点击右下角的“开始”选项卡。染色质片段大小在约200–1000 bp范围内适用于ChIP实验。</li>
	<li>将超声处理后的溶液转移至无菌管中，在4 °C下以21,130 × g离心15分钟（使用台式离心机）。将上清液转移至新管中。</li>
	<li>测定上清液总体积，取出总量的10%作为Input对照，置于4 °C保存。</li>
</ol>
4. 染色质免疫沉淀
<ol>
	<li>每 20 mL 染色质免疫沉淀稀释缓冲液中溶解 2 片蛋白酶抑制剂片剂。</li>
	<li>超声处理后，使用染色质免疫沉淀稀释缓冲液将剩余样品稀释 5 倍，使 SDS 浓度降至 0.1%。取 270 µL 剩余上清液，加入 1080 µL 染色质免疫沉淀稀释缓冲液，最终总体积为 1350 µL。</li>
	<li>当抗体与蛋白 G 磁珠完成孵育后，将管子置于磁力架上，移除上清液。</li>
	<li>保持管子仍在磁力架上，加入含蛋白酶抑制剂的 750 µL 染色质免疫沉淀稀释缓冲液洗涤磁珠一次。 
	注意：此步骤中切勿扰动磁珠或旋转管子。</li>
	<li>移除染色质免疫沉淀稀释缓冲液的洗涤液，并将磁珠重悬于 240 µL 相同的染色质免疫沉淀稀释缓冲液中。将 20 µL 磁珠分装至 12 个独立的管子中，每个管子用于一个独立的组织样品。</li>
	<li>将超声处理后的样品等量加入含特异性抗体的蛋白 G 磁珠中，并在 4 °C 下使用管式旋转混合仪翻转孵育过夜。</li>
</ol>
5. 免疫沉淀的DNA-蛋白质复合物的洗涤和逆转交联
<ol>
	<li>反转交联后的第二天早晨，将抗体-蛋白溶液转移至96孔板，并置于磁力架上。静置至少30秒使磁珠吸附，然后吸除上清液。</li>
	<li>使用多通道移液器，用150 µL冰浴预冷的RIPA洗涤缓冲液洗涤磁珠5次。洗涤过程中避免直接吹打磁珠，每次洗涤时将磁力架持续从右向左移动30秒。</li>
	<li>用150 µL冰浴预冷的RIPA-500洗涤缓冲液洗涤样品两次。</li>
	<li>用150 µL冰浴预冷的LiCl洗涤缓冲液洗涤样品两次。</li>
	<li>用150 µL冰浴预冷的TE洗涤缓冲液洗涤样品一次，并立即去除TE缓冲液。对于低样本量实验，此步骤可省略。</li>
	<li>将步骤3.7中的Input对照加入含有ChIP DNA样品的96孔板新孔中。</li>
	<li>完成洗涤步骤后，为每个ChIP和Input样品加入解离缓冲液主混合液（室温），每份样品包含44 µL直接解离缓冲液、1 µL RNase（20 mg/mL）和5 µL蛋白酶K（20 mg/mL），用于反转交联。</li>
	<li>使用PCR仪孵育样品，37 °C孵育4小时，50 °C孵育4小时，65 °C孵育8–16小时。</li>
</ol>
6. 沉淀DNA的纯化与定量
<ol>
	<li>次日早晨，将样品重新置于磁力架上，转移上清液至新的96孔PCR板中，该PCR板含有免疫沉淀的DNA。</li>
	<li>向溶液中加入2.3倍体积的磁性 beads（50 µL 溶液加入115 µL），使用多通道移液器小心吹打25次。若混合充分，溶液将变得均匀。</li>
	<li>将溶液在室温下从磁力架上孵育4分钟。随后将样品重新放回磁力架，继续在室温下孵育4分钟，弃去上清液。</li>
	<li>保持样品在磁力架上，加入150 µL 70%乙醇（体积/体积），室温孵育30秒，期间避免扰动磁珠。</li>
	<li>移除乙醇，并重复洗涤一次。让磁性 beads 在磁力架上室温空气中干燥5分钟。 
	注意：第二次洗涤后必须彻底去除所有乙醇，残留的乙醇将干扰后续纯化过程。</li>
	<li>将样品从磁力架上取下，加入30 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.0）。通过移液吹打25次混匀，然后将样品在室温下离开磁力架孵育4分钟。</li>
	<li>将样品重新置于磁力架上，室温再孵育4分钟。将每份样品中的20 µL转移至新的96孔板用于文库构建。剩余的10 µL ChIP DNA应妥善保存，以备文库制备过程中可能出现问题时使用。</li>
	<li>在此阶段，应在文库构建前对ChIP DNA进行定量。使用高灵敏度DNA试剂测定DNA浓度。使用高灵敏度DNA毛细管电泳仪分析沉淀DNA的片段大小分布，随后进行步骤7.1。</li>
</ol>
7. 使用 NEBNext Ultra II DNA 文库构建试剂盒进行文库构建
<ol>
	<li>按照制造商推荐的方案，使用DNA文库构建试剂盒制备用于下一代测序（NGS）的文库。所有反应均在96孔板中进行，孵育在PCR热循环仪中完成，热盖温度设置为&#62; 100 °C，反应体积为50 µL。</li>
	<li>使用适用于NGS平台的多重寡核苷酸作为索引。PCR扩增共进行10个循环，反应条件如下：98 °C预变性30秒，98 °C变性10秒，65 °C退火/延伸30秒（共10个循环），65 °C终延伸5分钟，随后在4 °C保存。 
	注：表1列出了用于PCR扩增的引物。</li>
	<li>PCR扩增完成后，取出样品，用无核酸酶水将总体积补至100 µL。进行双端磁珠大小筛选（0.55x/0.8x）：首先加入55 µL磁珠，通过移液吹打25次混匀，在室温下远离磁力架孵育4分钟。</li>
	<li>将样品重新置于磁力架上，室温继续孵育4分钟。此步骤用于保留不适合测序的大片段，使其吸附在磁珠上。</li>
	<li>将上清液转移至新的96孔PCR板中。请勿丢弃上清液，因其含有部分纯化的DNA。</li>
	<li>再加入25 µL磁珠，通过移液吹打25次混匀，并在室温下远离磁力架孵育4分钟。</li>
	<li>将样品重新置于磁力架上，室温继续孵育4分钟，随后弃去上清液。此步骤用于保留大小约为200至600 bp的片段，这些片段将用于最终文库的构建。</li>
	<li>保持样品在磁力架上，加入150 µL 70%乙醇（v/v），静置孵育30秒，期间不要扰动磁珠（置于磁力架上时不得移动）。吸除乙醇后，重复洗涤一次。</li>
	<li>让磁珠在磁力架上自然风干5分钟。第二次洗涤后需彻底去除所有乙醇，残留的乙醇将干扰后续纯化步骤。</li>
	<li>将样品从磁力架上取下，加入25 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.0）。通过移液吹打25次混匀，在室温下远离磁力架孵育4分钟。随后将样品重新置于磁力架上，室温继续孵育4分钟。</li>
	<li>在混合文库前，使用高灵敏度DNA毛细电泳仪对文库进行定量，以确保片段大小适合测序。完成的文库片段大小范围为200–600 bp，且不含任何引物二聚体。 
	注：如有必要，可再进行一次0.7x磁珠纯化，以去除约130 bp处存在的非目标引物二聚体。</li>
	<li>根据各文库的浓度及其唯一索引引物进行等摩尔混合。例如，对于包含六个浓度介于1 ng/µL至6 ng/µL之间的样品的混合池，最低浓度样品取15 µL，最高浓度样品取2.5 µL。此策略可确保测序流式池（flow cell）各通道的读段数量分布均匀。</li>
</ol>
8. ChIP-seq 数据后续处理
<ol>
	<li>基于管道的 snakemake38,39 用于通过单个命令处理以下所有步骤。重要的是，每个步骤均会分别进行讨论，并附有相应的命令。</li>
	<li>使用 FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）评估六种组蛋白修饰对应的原始 fastq 测序读段的质量：打开 Unix 终端，将工作目录（cd）切换至包含六个组蛋白修饰原始 fastq 文件的文件夹。在终端中输入命令 fastqc *fastq.gz，然后按 [RETURN] 键。该命令将对文件夹中的所有 fastq 文件执行质量控制分析。</li>
	<li>将高质量测序读段比对至参考基因组，并在压缩为bam文件前去除重复序列。此步骤使用bowtie 1.1.2版本完成。39，SAMBLASTER 版本 0.1.2140，以及 SAMTOOLS 版本 1.3.141在 Unix 终端中输入：bowtie -m 1 -n 1 --best --strata -S -q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster -removeDups | samtools view -Sb - &#62;histone1.bam，然后按 [RETURN]。 
	注意：path_to 表示包含 hg19 人类基因组序列的文件夹。该路径将根据所研究的生物体不同而有所变化。</li>
	<li>使用 SAMTOOLS 对 bam 文件进行排序，命令如下：在 Unix 终端中输入 samtools sort histone1.bam -m 2G -@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted，然后按 [RETURN] 键。</li>
	<li>使用 SAMTOOLS 对 bam 文件建立索引，命令如下：在 Unix 终端中输入 samtools index histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai，然后按 [RETURN] 键。</li>
	<li>使用 SAMTOOLS flagstat 确定唯一比对和未比对的 reads，命令如下：在 Unix 终端中输入 samtools flagstat histone1.sorted.bam，然后按 [RETURN]。</li>
	<li>使用以下命令通过随机抽样按读段数对 bam 文件进行标准化：在 Unix 终端中输入 sambamba view -f bam -subsampling-seed=3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools sort -m 2G -@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam，然后按 [RETURN] 键。</li>
	<li>使用 SAMTOOLS 重新对 bam 文件进行索引，具体命令如下：在 Unix 终端中输入 samtools index histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai，然后按 [RETURN] 键。</li>
	<li>在基因组浏览器中可视化 ChIP-seq 文库即. UCSC 或 IGV），使用 deepTools 版本 2.4.0 生成 bigwig 文件40 通过将bam文件标准化为每千碱基每百万读段（RPKM）进行缩放。可使用以下命令执行此操作：
	<ol>
		<li>对于标准的 bigwig 文件：在 Unix 终端中输入以下命令，bamCoverage -b histone1.downsample.sorted.bam --normalizeUsingRPKM --binSize 30 --smoothLength 300 --extendReads 200 -o histone1.bw，然后按 {RETURN} 键。</li>
		<li>对于输入减去的 bigwig 文件：在 Unix 终端中输入以下命令，bamCompare --bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam --bamfile2 input1.downsample.sorted.bam --normalizeUsingRPKM --ratio subtract --binSize 30 --smoothLength 300 --extendReads 200 -o histone1.subtracted.bw，然后按 [RETURN] 键。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>识别 ChIP-seq 信号在基因组中的富集区域 &#34;输入&#34; 使用 MACS（Model-based Analysis of ChIP-seq）版本 1.4.2 进行背景分析25,26 以及版本 2.1.0。使用 macs1 进行 &#34;点源&#34; H3K4me3、H3K4me1 和 H3K27ac 因子以及 macs2 &#34;广泛来源&#34; H3K79me2、H3K27me3 和 H3K9me3 因子。此操作通过以下命令执行：
	<ol>
		<li>对于点源：在 Unix 终端中输入以下命令，macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam -c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5 --nomodel --keep-dup all -n histone1.file，然后按 [RETURN] 键。</li>
		<li>对于广域信号分析：在 Unix 终端中输入以下命令，macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam -c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6 --broad --broad-cutoff 1e-6 --keep-dup all --nomodel -n histone1.file，然后按 [RETURN] 键。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 ChromHMM24 基于以下命令，通过所研究的组蛋白修饰来识别组合式染色质状态模式：
	<ol>
		<li>在 Unix 终端中输入 cd /path_to/ChromHMM_folder，然后按 [RETURN]。</li>
		<li>进入 ChromHMM 目录后，输入以下命令：java -mx2G -jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt /path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt /path_to/BinarizeBam_output，然后按 [RETURN] 键。</li>
		<li>输入以下命令：java -mx2G -jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000 /path_to/BinarizeBam /path_to/output_directory 15 hg19，然后按 [RETURN] 键。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本实验方案描述了一种完整且全面的高通量ChIP-seq模块，用于在全基因组范围内绘制人类肿瘤组织和细胞系中的染色质状态。在任何ChIP-seq方案中，最关键的步骤之一是抗体的特异性。本文所述方法展示了针对六种组蛋白修饰的免疫沉淀条件，这些抗体均为适用于ChIP实验级别，并已在本实验室及其他实验室中得到先前验证42,44,45。尽管相同的抗体浓度已成功应用于多种其他肿瘤类型，但在研究不同目标因子时，确定抗体特异性至关重要27。
成功实验的另一个关键方面是优化超声处理条件。超声时间因样本和组织类型的不同而有所差异，需相应调整。为实现适当优化，应针对每个样本进行预实验，通过逐步增加超声时间并持续检测片段大小来确定最佳条件。在初始ChIP实验中，染色质片段的理想大小范围应为约200–1000 bp，以实现最佳免疫沉淀效果；在进行文库构建前，应定量纯化的ChI...

哺乳动物基因组的大部分（98%–99%）由非编码序列组成，这些非编码区域包含已知参与调控基因表达和染色质组织的调控元件1,2。在正常细胞中，基因组DNA特异性地组装成紧密的染色质结构，对于各种DNA相关过程的空间组织、调控及精确时序至关重要3,4,5。然而，在癌细胞中，异常的表观遗传机制引起的染色质修饰可导致染色质结构的异常组织，包括调控元件的可及性、染色体成环系统以及基因表达模式的改变6,7,8,9,10。
尽管近年来取得了一些进展，但我们对与肿瘤进展或治疗反应相关的表观遗传学改变仍知之甚少。表观基因组由多种修饰组成，包括组蛋白修饰和DNA甲基化，这些修饰共同形成一种动态状态（称为染色质状态），进而影响基因表达网络及其他对维持细胞身份至关重要的生物学过程。近期通过对H3K27Ac谱型的研究，已在多种恶性肿瘤中发现增强子区域的异常改变。11尽管此类研究有助于揭示孤立的表观遗传标记之间的相关性，但目前已鉴定出超过100种表观遗传修饰12,13 在尚未明确了解这些组蛋白和DNA修饰的生物学作用及其相互依赖关系的情况下，这些修饰还可能形成更为复杂的组合模式，而正是这些组合模式（而非单一的修饰）决定了表观遗传状态。14因此，迫切需要识别癌症进展过程中或治疗应答时这些染色质状态的改变. 癌症中表观基因组改变的全面认知在一定程度上仍滞后，部分原因在于技术（例如 从小量临床样本/单细胞生成大规模数据）及分析（例如 用于定义组合状态的算法）面临挑战。因此，迫切需要建立稳健的高通量方法，以从临床样本中大规模分析组蛋白修饰标记，并开发易于实施的计算方法来预测组合模式，从而促进确定与肿瘤发生不同阶段及治疗耐药性相关的表观遗传状态。此外，来自近期表观基因组谱型研究的数据15,16,17,18,19,20,21,22,23 在正常组织和细胞系中的数据可与肿瘤的染色质图谱整合，以进一步揭示表观基因组对肿瘤生物学的贡献。
染色质分析已成为识别各种染色质修饰全局结合模式的有力工具15,24。近年来，ChIP-seq 已成为在全基因组范围内研究 DNA-蛋白质相互作用的&#34;金标准&#34;25,26,27。对于任何 ChIP-seq 实验而言，其成功都依赖若干关键步骤，包括组织处理与解离、确定最佳超声破碎条件、确定免疫沉淀所需的最优抗体浓度、文库构建、测序后的数据处理以及下游分析。这些步骤中的每一个都包含关键的质量控制节点，综合起来对于准确识别功能验证的潜在靶点至关重要。通过在这些步骤上的改进，已有若干先前研究开发出可从少量组织样本中开展 ChIP 或 ChIP-seq 的方法学28,29,30,31,32。此外，一些研究提出了适用于高通量 ChIP 实验的方案，并结合基于 PCR 的定量分析33,34。最后，目前已有一些公开可用的 ChIP-seq 数据分析平台，例如 Easeq35 和 Galaxy36。然而，尚缺乏一个将高通量 ChIP-seq 实验与计算分析流程整合的综合平台，以同时实现单标记分析和染色质状态分析。
本方案描述了一种完整且全面的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）工作流程，用于在全基因组范围内绘制肿瘤组织和细胞系中的染色质状态图谱，并提供了易于遵循的操作指南，涵盖成功实验所需的全部步骤。通过采用Blecher-Gonen et al.37此前描述的高通量方法，本方案可同时平行处理数十个样本，并已成功应用于多种癌细胞系及人类肿瘤样本，如黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌和多形性胶质母细胞瘤。我们展示了针对六种核心组蛋白修饰的实验方法，这些修饰代表了人类黑色素瘤细胞系和肿瘤样本中表观遗传调控景观的关键组成部分。这些修饰包括H3K27ac（增强子）、H3K4me1（活性及待激活增强子）、H3K4me3（启动子）、H3K79me2（转录区域）、H3K27me3（多梳抑制）、以及H3K9me3（异染色质抑制）。这些标记可单独或联合使用，以识别代表抑制性和活性功能域的、功能上不同的染色质状态。

<table><tbody><tr><td>ChIP级H3K4me1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>ChIP级H3K27ac抗体</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr><tr><td>ChIP级H3K4me3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>ChIP级H3K79me2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab3594</td><td></td></tr><tr><td>ChIP级H3K27me3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td></td></tr><tr><td>ChIP级H3K9me3抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris HCl，pH 8.0</td><td>Teknova</td><td>T1080</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma - Life Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>吐温-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746460</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1% TWEEN-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA - 无IgG</td><td>Sigma - Life Sciences</td><td>A2058-5G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C管</td><td>GentleMACS</td><td>120-008-466</td><td>解离管</td></tr><tr><td>16% 甲醛</td><td>Peierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>miniProtease抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836153001</td><td>蛋白酶抑制剂片剂</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10009D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor NGS 0.65 mL管</td><td>Diagenode</td><td>C30010011</td><td>超声破碎管</td></tr><tr><td>DynaMag - 96 侧裙板磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td>96孔磁力架</td></tr><tr><td>TE缓冲液</td><td>Promega</td><td>V6231</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Invitrogen</td><td>100005393</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>顺磁性磁珠</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA高灵敏度检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>高灵敏度DNA试剂</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td>DNA文库构建试剂盒</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>高灵敏度DNA试剂</td></tr><tr><td>高灵敏度D1000试剂</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td>高灵敏度DNA试剂</td></tr><tr><td>多重寡核苷酸（索引引物-第1组）</td><td>New England BioLabs</td><td>E7335L</td><td>多重寡核苷酸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多重寡核苷酸（索引引物-第2组）</td><td>New England BioLabs</td><td>E7500L</td><td>多重寡核苷酸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TapeStation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td>高灵敏度DNA电泳分析仪</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico超声破碎仪&amp;nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td>水浴破碎仪</td></tr><tr><td>混匀仪</td><td>Nutator</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 Touch梯度PCR仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>PCR热循环仪</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>2322</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Denville</td><td>1003123</td><td></td></tr><tr><td>管旋转仪</td><td>Thermo-Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>96孔带裙边板</td><td>Eppendorf</td><td>47744-110</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R离心机&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99464</td><td>台式离心机</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td>台式离心机</td></tr><tr><td>光学管条（8x条）</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>光学管条盖（8x条）</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>上样吸头，10个装</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>IKA MS3涡旋振荡器</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>涡旋振荡器</td></tr></tbody></table>

利用高通量chip-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

组蛋白修饰是表观基因组的重要组成部分，在决定相关基因座转录状态方面发挥着关键的调控作用。此外，特定修饰的存在已被用于确定非编码功能元件（如增强子）的位置和性质。近年来，染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）已成为绘制全基因组范围内单个组蛋白修饰图谱的有力工具。然而，越来越多的研究表明，染色质修饰的组合模式（即染色质状态）决定了相关基因组位点的身份和特性。因此，需要建立包含高效高通量（HT）实验方法的工作流程，以同时分析多种组蛋白修饰标记，并结合能够处理大量ChIP-Seq数据集的计算分析流程，从而在大量样本中全面确定表观基因组状态。本文所介绍的高通量ChIP-Seq工作流程包含两个模块：1）一种可在96孔板格式下，利用少量肿瘤组织样本和细胞系材料同时检测多种组蛋白修饰的实验方案；2）一个整合现有工具的计算数据分析流程，用于分析单个修饰标记的占据情况以及组合型染色质状态模式。这两个模块共同实现了对数百个ChIP-Seq样本的快速、高效处理。本工作流程已被用于从黑色素瘤肿瘤和细胞系的6种组蛋白修饰图谱中推导染色质状态模式。总体而言，我们提出了一种全面的ChIP-seq工作流程，可应用于数十个人类肿瘤样本和癌细胞系，以鉴定多种恶性肿瘤中的表观基因组异常。

该方案允许从冷冻肿瘤组织和细胞系中进行免疫沉淀，可采用高通量方法并行处理数十个样本 (图1A)染色质片段大小应在约200–1000 bp之间，以获得最佳免疫沉淀效果。我们注意到，不同组织和细胞类型达到相同剪切长度所需的时间有所不同。从少量组织中成功进行ChIP的关键在于始终保持裂解物处于低温状态，尤其是在超声处理过程中。在进行文库构建之前，应定量纯化的ChIP-DNA。图2A）。适用于多重测序和高通量测序（NGS）的完整文库片段大小应介于约 200 - 600 bp 之间，且不含任何引物二聚体 (图2B). 测序后，需满足多项质控指标，方可进入后续分析流程，例如 MACS 峰识别或 ChromHMM 分析 (图3)许多这些指标可使用 F...

本文介绍了一种优化的高通量染色质免疫沉淀测序（ChIP-sequencing）实验方案及相应的计算分析流程，用于从冻存的肿瘤组织和细胞系中确定全基因组范围内的染色质状态模式。

利用高通量ChIP-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

组蛋白修饰是表观基因组的重要组成部分，在决定转录状态方面发挥着关键的调控作用。

本实验方案的总体目标是无偏倚地鉴定肿瘤组织和癌细胞系中的组合式染色质状态模式。该方法有助于解答癌症表观遗传学领域中的关键问题，例如，贫瘠的组蛋白修饰状态如何促进肿瘤发生。该技术的主要优势在于，可同时且高效地处理多种组蛋白修饰以及多个样本。首先，使用无菌手术刀片将50毫克黑色素瘤组织与2毫升Hank's平衡盐溶液（HBSS）进行手动解离。在无菌组织培养皿中将组织切成约3至4毫米大小的碎片，持续约5分钟。将组织悬液转移至解离管中，并再加入0.125毫升HBSS。使用解离仪进一步解离组织，直至匀浆化。接下来，向每3毫升HBSS中加入200微升16%甲醛，对组织进行交联。使用混合器，在37摄氏度下以10转/分钟的速度精确振荡混合物10分钟。从培养箱中取出样本后，每3毫升样本中加入200微升肿瘤性甘氨酸，在37摄氏度下以10转/分钟的速度振荡混合物5分钟。使用台式离心机在4摄氏度下以934 × g离心5分钟。离心结束后，弃去上清液，并加入5毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后，在934 × g条件下再次离心样品，并弃去上清液。每50毫克组织加入300微升含有蛋白酶抑制剂的ChIP收获缓冲液，在冰上裂解样品30分钟。在细胞裂解的同时，打开水浴破碎仪及配套冷却系统，使温度升至4°C。将超声破碎管放入水浴破碎仪中，对黑色素瘤组织进行超声处理，共60个循环，每个循环30秒开启、30秒关闭，以获得长度为200至600个碱基对的染色质片段。对于8毫克黑色素瘤组织，将每种组蛋白抗体各3微克与20微升蛋白G磁珠以及100微升结合阻断缓冲液在4摄氏度下旋转孵育2小时，使用试管旋转仪。超声处理完成后，使用ChIP稀释缓冲液将样品稀释5倍，使SDS浓度降至0.1%。当抗体与蛋白G磁珠孵育完成后，移除ChIP稀释缓冲液，并将磁珠重悬于240微升新鲜缓冲液中。然后，将珠子分成每份20 µL，分别加入12个独立的离心管中，每个离心管用于处理一个独立的组织样本。将超声处理后的材料均匀分装至含有特异性抗体的蛋白G珠子中，并在4°C下使用管式旋转仪旋转过夜。在逆转交联后的第二天早晨，将抗体-蛋白溶液转移至96孔板中，并将其置于磁力架上。让磁珠吸附至少30秒后，移除上清液。使用多通道移液器，用150 µL冰冻RIPA洗涤缓冲液洗涤磁珠5次。每次洗涤时持续移动磁铁30秒，然后移除上清液。洗涤步骤完成后，加入洗脱缓冲液主混合液，每张芯片加入44微升直接洗脱缓冲液、1微升RNase和5微升蛋白酶K，并将样品用于逆转交联。使用PCR仪在37摄氏度孵育4小时，50摄氏度孵育4小时，65摄氏度孵育8至16小时。次日早晨，将样品重新置于磁架上，将上清液转移至含有氨基沉淀DNA的新96孔PCR板中。向溶液中加入 2.3 x 顺磁性磁珠，使用多通道移液器轻轻吹打混合 25 次。随后，在室温下孵育 4 分钟。然后将样品重新置于磁力架上，在室温下继续孵育 4 分钟。弃去上清液后，向样品中加入150微升70%乙醇，在不扰动磁珠的情况下室温孵育30秒。待磁珠干燥后，将样品从磁铁上取下，加入30微升10毫摩尔的traceal。用移液器吹打混匀25次。室温孵育样品后，将样品重新置于磁架上，室温再孵育四分钟。将每个样品的20微升转移至新的96孔板中用于文库构建。PCR扩增后，取出样品，用无核酸水将总体积补至100微升。通过双面磁性珠尺寸筛选，首先向每个样本中加入55 µL磁珠，并用移液器吹打混合25次。然后在室温下孵育4分钟。将样本重新置于磁力架上，在室温下再孵育4分钟，以使较大的片段结合在磁珠上，这些片段不适合测序。孵育后，将上清液转移至新的96孔PCR板中。加入另外25 µL的磁性微珠，通过移液吹打25次混匀，并在室温下脱离磁力架孵育4分钟。室温孵育后，将样品重新放回磁力架上，于室温继续孵育4分钟。然后弃去上清液。保持样品置于磁力架上，加入150微升70%乙醇，在室温下静置孵育30秒，不要扰动磁珠。移除乙醇，并重复洗涤一次。待磁珠干燥后，将样品从磁力架上取下，加入25微升10毫摩尔、pH为8.0的痕量金属去除缓冲液（traceal pH 8.0）。用移液器吹打混合25次，室温下在磁力架外孵育4分钟。室温孵育结束后，将样品重新放回磁力架上，继续在室温下孵育4分钟。现在，在多重测序之前，使用高灵敏度DNA毛细电泳仪对文库进行定量，以确保文库片段大小适合测序。本方案可用于对冷冻肿瘤组织和细胞系进行免疫沉淀，可同时对数十个样本采用高通量方法平行操作。染色质片段长度应介于200至1000个碱基对之间，以获得最佳免疫沉淀效果。在进行文库构建之前，应定量纯化的ChIP DNA。适用于多重测序和下一代测序的完成文库片段大小应在200至600个碱基对之间，并且不含任何引物二聚体。测序完成后，在进入分析流程的后续步骤（如macs峰识别和chromHmm分析）之前，需满足多项质量控制指标。ChIP 样本应相对于输入 DNA 富集，且每种组蛋白修饰应呈现出代表表观遗传景观特定组分的独特图谱。chrome HMM 算法采用多元隐马尔可夫模型（Multivariate Hidden Markov Model），根据所研究的组蛋白修饰识别出最显著的、反复出现的组合性及空间性染色质模式。利用这六种修饰，chrome HMM 可鉴定出功能上不同的染色质状态，代表抑制性和活性区域，例如多梳抑制、异染色质抑制、活跃转录和活跃增强子。一旦掌握，该技术可在三到四天内完成，前提是操作得当。在尝试该实验流程时，重要的是在进行文库构建和数据分析之前，确定最佳的超声处理条件以及抗体的特异性。为了学习该实验方法，还可采用其他技术，如RRS测序和染色体构象捕获，以确定染色质状态区域与基因表达及高级染色质结构之间的关联。实验完成后，该技术为癌症表观遗传学领域的研究人员探索患者肿瘤样本中的染色质状态模式铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何处理和解离肿瘤组织、进行染色质免疫沉淀、为下一代测序构建文库、处理测序后的数据，并初步掌握下游分析的基本步骤。请注意，在使用甲醛时需格外小心，因其具有极高危险性，进行该操作时必须采取适当预防措施，例如在合适的通风橱中操作。

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