利用高通量ChIP-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

本实验方案的总体目标是无偏倚地鉴定肿瘤组织和癌细胞系中的组合式染色质状态模式。该方法有助于解答癌症表观遗传学领域中的关键问题，例如，贫瘠的组蛋白修饰状态如何促进肿瘤发生。该技术的主要优势在于，可同时且高效地处理多种组蛋白修饰以及多个样本。

首先，使用无菌手术刀片将50毫克黑色素瘤组织与2毫升Hank's平衡盐溶液（HBSS）进行手动解离。在无菌组织培养皿中将组织切成约3至4毫米大小的碎片，持续约5分钟。将组织悬液转移至解离管中，并再加入0.125毫升HBSS。

使用解离仪进一步解离组织，直至匀浆化。接下来，向每3毫升HBSS中加入200微升16%甲醛，对组织进行交联。使用混合器，在37摄氏度下以10转/分钟的速度精确振荡混合物10分钟。

从培养箱中取出样本后，每3毫升样本中加入200微升肿瘤性甘氨酸，在37摄氏度下以10转/分钟的速度振荡混合物5分钟。使用台式离心机在4摄氏度下以934 × g离心5分钟。离心结束后，弃去上清液，并加入5毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。

然后，在934 × g条件下再次离心样品，并弃去上清液。每50毫克组织加入300微升含有蛋白酶抑制剂的ChIP收获缓冲液，在冰上裂解样品30分钟。在细胞裂解的同时，打开水浴破碎仪及配套冷却系统，使温度升至4°C。

将超声破碎管放入水浴破碎仪中，对黑色素瘤组织进行超声处理，共60个循环，每个循环30秒开启、30秒关闭，以获得长度为200至600个碱基对的染色质片段。对于8毫克黑色素瘤组织，将每种组蛋白抗体各3微克与20微升蛋白G磁珠以及100微升结合阻断缓冲液在4摄氏度下旋转孵育2小时，使用试管旋转仪。超声处理完成后，使用ChIP稀释缓冲液将样品稀释5倍，使SDS浓度降至0.1%。当抗体与蛋白G磁珠孵育完成后，移除ChIP稀释缓冲液，并将磁珠重悬于240微升新鲜缓冲液中。

然后，将珠子分成每份20 µL，分别加入12个独立的离心管中，每个离心管用于处理一个独立的组织样本。将超声处理后的材料均匀分装至含有特异性抗体的蛋白G珠子中，并在4°C下使用管式旋转仪旋转过夜。在逆转交联后的第二天早晨，将抗体-蛋白溶液转移至96孔板中，并将其置于磁力架上。

让磁珠吸附至少30秒后，移除上清液。使用多通道移液器，用150 µL冰冻RIPA洗涤缓冲液洗涤磁珠5次。每次洗涤时持续移动磁铁30秒，然后移除上清液。

洗涤步骤完成后，加入洗脱缓冲液主混合液，每张芯片加入44微升直接洗脱缓冲液、1微升RNase和5微升蛋白酶K，并将样品用于逆转交联。使用PCR仪在37摄氏度孵育4小时，50摄氏度孵育4小时，65摄氏度孵育8至16小时。次日早晨，将样品重新置于磁架上，将上清液转移至含有氨基沉淀DNA的新96孔PCR板中。

向溶液中加入 2.3 x 顺磁性磁珠，使用多通道移液器轻轻吹打混合 25 次。随后，在室温下孵育 4 分钟。然后将样品重新置于磁力架上，在室温下继续孵育 4 分钟。

弃去上清液后，向样品中加入150微升70%乙醇，在不扰动磁珠的情况下室温孵育30秒。待磁珠干燥后，将样品从磁铁上取下，加入30微升10毫摩尔的traceal。用移液器吹打混匀25次。

室温孵育样品后，将样品重新置于磁架上，室温再孵育四分钟。将每个样品的20微升转移至新的96孔板中用于文库构建。PCR扩增后，取出样品，用无核酸水将总体积补至100微升。

通过双面磁性珠尺寸筛选，首先向每个样本中加入55 µL磁珠，并用移液器吹打混合25次。然后在室温下孵育4分钟。将样本重新置于磁力架上，在室温下再孵育4分钟，以使较大的片段结合在磁珠上，这些片段不适合测序。

孵育后，将上清液转移至新的96孔PCR板中。加入另外25 µL的磁性微珠，通过移液吹打25次混匀，并在室温下脱离磁力架孵育4分钟。室温孵育后，将样品重新放回磁力架上，于室温继续孵育4分钟。

然后弃去上清液。保持样品置于磁力架上，加入150微升70%乙醇，在室温下静置孵育30秒，不要扰动磁珠。移除乙醇，并重复洗涤一次。

待磁珠干燥后，将样品从磁力架上取下，加入25微升10毫摩尔、pH为8.0的痕量金属去除缓冲液（traceal pH 8.0）。用移液器吹打混合25次，室温下在磁力架外孵育4分钟。室温孵育结束后，将样品重新放回磁力架上，继续在室温下孵育4分钟。

现在，在多重测序之前，使用高灵敏度DNA毛细电泳仪对文库进行定量，以确保文库片段大小适合测序。本方案可用于对冷冻肿瘤组织和细胞系进行免疫沉淀，可同时对数十个样本采用高通量方法平行操作。染色质片段长度应介于200至1000个碱基对之间，以获得最佳免疫沉淀效果。

在进行文库构建之前，应定量纯化的ChIP DNA。适用于多重测序和下一代测序的完成文库片段大小应在200至600个碱基对之间，并且不含任何引物二聚体。测序完成后，在进入分析流程的后续步骤（如macs峰识别和chromHmm分析）之前，需满足多项质量控制指标。

ChIP 样本应相对于输入 DNA 富集，且每种组蛋白修饰应呈现出代表表观遗传景观特定组分的独特图谱。chrome HMM 算法采用多元隐马尔可夫模型（Multivariate Hidden Markov Model），根据所研究的组蛋白修饰识别出最显著的、反复出现的组合性及空间性染色质模式。利用这六种修饰，chrome HMM 可鉴定出功能上不同的染色质状态，代表抑制性和活性区域，例如多梳抑制、异染色质抑制、活跃转录和活跃增强子。

一旦掌握，该技术可在三到四天内完成，前提是操作得当。在尝试该实验流程时，重要的是在进行文库构建和数据分析之前，确定最佳的超声处理条件以及抗体的特异性。为了学习该实验方法，还可采用其他技术，如RRS测序和染色体构象捕获，以确定染色质状态区域与基因表达及高级染色质结构之间的关联。

实验完成后，该技术为癌症表观遗传学领域的研究人员探索患者肿瘤样本中的染色质状态模式铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何处理和解离肿瘤组织、进行染色质免疫沉淀、为下一代测序构建文库、处理测序后的数据，并初步掌握下游分析的基本步骤。请注意，在使用甲醛时需格外小心，因其具有极高危险性，进行该操作时必须采取适当预防措施，例如在合适的通风橱中操作。