Name: 幽门螺杆菌感染与胃病理的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 了解幽门螺杆菌感染小鼠模型的建立方法，用于研究胃肠道炎症与癌症的病理机制。该技术可评估细菌定植和组织病理学变化，为开发抗生素、药物或疫苗等治疗策略提供重要依据。

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作者谨此感谢 A. De Paoli 女士和 Georgie Wray-McCann 女士提供的技术协助。作者感谢莫纳什大学解剖学与发育生物学系莫纳什组织学平台提供的设施与技术支持。本实验室的研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）资助（项目编号：APP1079930、APP1107930）。RLF 获 NHMRC 高级研究员奖学金支持（项目编号：APP1079904）。KD 和 MC 均获得莫纳什大学研究生奖学金支持。KD 还获得莫纳什医学研究所先天免疫与传染病中心的支持，而 MC 获得莫纳什大学医学、护理与健康科学学院国际研究生奖学金支持。莫纳什医学研究所的研究工作得到维多利亚州政府运营基础设施支持计划的资助。

1. 细菌接种物的培养与制备
<ol>
	<li>解冻甘油菌种保藏管 H. pylori 或 H. felis15 从 -80 °C 取出并在含以下成分的马血琼脂（HBA）平板上进行传代培养：血液琼脂基础培养基 No.2（参见 材料表）；改良的“Skirrow抗生素选择性添加剂”（含万古霉素 10 μg/mL、多粘菌素B 25 ng/mL、甲氧苄啶 5 µg/mL、两性霉素B 2.5 μg/mL）；以及5–10%（v/v）马血15,16细菌在含有适当气体包的2.5或3.5 L厌氧罐内的微需氧条件下生长良好（参见 材料表，37 °C。 
	注意： H. pylori 在这些条件下培养的菌株必须在培养1–1.5天后进行传代培养，而 H. felis，通常需要至少2天的孵育时间。合适的培养和保存培养基此前已有详细描述。15.</li>
	<li>从小至中期对数生长阶段的培养物中制备用于小鼠感染的细菌接种物。通过向每块琼脂平板加入1–2 mL脑心浸出液（BHI）肉汤，轻柔地冲洗平板以收获细菌。使用巴斯德吸管吸取平板上的菌悬液。
	<ol>
		<li>或者，从 幽门螺杆菌 在BHI肉汤中培养16–18小时的细菌15. 此情况下，以2,200 x g的低速离心收集细菌 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过相差显微镜（100倍物镜）观察湿片制备样品，评估细菌的活力与运动性。制备湿片时，用接种环取适量细菌，悬浮于载玻片上10–20 μL BHI肉汤液滴中。对于 H. felis，其尺寸远大于 H. pylori使用血细胞计数板准确定量活菌数量。通过革兰染色确认培养物的纯度。 
	注意：仅使用 H. pylori 若大多数细菌呈杆菌状或螺旋状（形态可能因菌株而异）。 H. felis 接种物应主要包含螺旋形细菌. 如果大多数细菌呈球状形态，则不要使用该接种物，因为这种形态的细菌不可行，无法在小鼠体内建立感染。</li>
	<li>通过相差显微镜在100倍物镜下计数每视野中细菌的大致数量，结合以下标准估算接种物中的细菌数量：每视野1个细菌 ≈ 约10个细菌6 菌落形成单位（CFU） 幽门螺杆菌/mL；每视野10个细菌 = 约107 CFU/mL；每视野100个细菌 = 约108 CFU/mL 等等。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板时，按以下公式计算CFU/mL： 
		CFU/mL =（4 × 4 视野中细菌平均数量）×（稀释倍数）×（104).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将接种物的细菌细胞密度调整至约 107–108 必要时，用BHI肉汤稀释后测定CFU/mL。
	<ol>
		<li>为确保细菌活性最大化，制备后应尽快使用灌胃接种物。</li>
		<li>务必确认 H. pylori 通过在灌胃操作后立即对接种物进行活菌计数，测定细胞密度和存活率（见下文）。这并非在所有情况下均可行 H. felis，因为它通常不在培养基上形成孤立的菌落。活菌数量 幽门螺杆菌接种物中的细胞数量无法通过光密度测量（A600）单独使用，因为该方法无法区分活细胞（即，杆菌/螺旋体/螺旋状）和非活性（即， 球状细菌</li>
		<li>使用光密度值作为估算活菌数量的方法 H. pylori 接种物中的细菌，但在此情况下，首先需要绘制一条生长曲线。为此，需测定A600 值 H. pylori 通过平板计数法测定活菌数量，并随时间监测培养物，将其结果与活菌数直接关联。 
		注意：进行此类生长曲线测定的一个便捷方法是将细菌在液体培养基中培养（第1.2节），使用标准的平底组织培养瓶，并置于含10% CO₂的培养箱中。2 培养箱。随后，通过每4–6小时采集一次培养物等分试样，持续2–3天，测定菌落形成单位（CFU）数量，并与相应的A值进行比较。600 数值17重要的是，必须为每种情况生成生长曲线 H. pylori 菌株，因为它们的生长速率可能不同，此外，并非所有菌株都能在10% CO₂条件下良好生长2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 采用胃内灌胃法对小鼠接种Helicobacter
注意：该经口胃内灌胃方法可应用于其他定植于肠道的细菌物种，例如 S. Typhimurium、C. rodentium、Listeria monocytogenes。
<ol>
	<li>使用6–8周龄、无特定病原体（SPF）的 幽门螺杆菌- 自由活动的雄性或雌性小鼠。感染实验应使用具有 C57BL/6 遗传背景的动物。 H. pylori 或 H. felis在本研究中，我们使用了野生型（WT）和缺乏关键先天免疫受体的基因修饰型C57BL/6小鼠（称为敲除或KO动物）。 
	注意：也可使用其他遗传背景的小鼠 幽门螺杆菌 然而，定植水平和疾病严重程度可能受到宿主背景类型的影响18,19.</li>
	<li>吸取消毒的细菌接种物（步骤 1.5）至一次性 1 mL 注射器中，并将随附的针头更换为 23 号针头，针头上连接一次性聚乙烯导管（长度 6–8 cm，内径 0.58 mm）。使用小条塑料薄膜将导管固定在针头上（参见 材料表）或者，使用无菌塑料喂养管（20号 × 38毫米）替换针头/导管组件。</li>
	<li>用一只手牢固地抓住小鼠颈部的皮肤，另一只手抓住尾巴，以进行物理固定。 
	注意：此操作可在无麻醉下进行，或 alternatively 使用吸入性麻醉剂，如甲氧氟烷（methoxyflurane）或异氟烷（isoflurane）15.</li>
	<li>将导管插入张开的下颌中央，并向尾侧引导至食管。伸展小鼠颈部，以便经由食管（而非气管）顺利进入胃部，直至导管大部分或全部不可见，并感受到阻力，此阻力对应于胃底部。注入特定体积的液体，通常每次接种为100 μL（图1). 
	注意：小鼠灌胃体积应 ≥ 105 CFU 以确保最佳定植和疾病病理。</li>
	<li>实验期间，将小鼠饲养在SPF级动物实验设施中。 
	注意：在感染后约24个月，才可在野生型C57BL/6小鼠中观察到严重的病理变化和腺癌20然而，这种效应在某些基因改造动物或其他遗传背景的小鼠中可能会加快。</li>
	<li>灌胃操作完成后，采用Miles和Misra技术的改良方法，测定活菌数量 H. pylori 给予小鼠的细菌。为此，将接种物进行连续稀释（从10−1&#160;至 10−5在BHI中采用先前详细描述的方法15. 
	注意：为确保分离出单菌落，使用前应将HBA平板在生物安全柜或37 °C培养箱中预热并干燥10–15分钟。</li>
</ol>
3. 实验后从小鼠采集组织
<ol>
	<li>根据相关动物实验伦理委员会的规定，通过吸入二氧化碳或颈椎脱臼法处死小鼠。</li>
	<li>打开腹腔，使用精细的弯剪切除胃。 
	注：也可通过心脏穿刺采集血清，以辅助研究幽门螺杆菌（Helicobacter）感染引起的全身性反应。此外，收集脾脏和胃旁淋巴结有助于研究适应性免疫反应。</li>
	<li>沿胃大弯剪开胃组织，并在50 mL离心管中用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗，去除残留食物。</li>
	<li>再次用无菌PBS洗涤胃组织，然后使用已去皮重的6 cm塑料培养皿记录湿重。</li>
	<li>将胃组织展平，并沿矢状方向解剖为两个相等的组织片段，每个片段包含幽门部、胃体部和非腺状前胃区域（图2）。去除非腺状区域，称量每只胃的一半组织，随后将其加入1 mL无菌BHI培养基（用于活菌计数）或立即在液氮中速冻（用于DNA/RNA提取）。 
	注意：含有组织的BHI管必须置于冰上保存，直至准备进行后续处理。速冻的胃组织也可用于提取RNA或蛋白质，分别进行qPCR（定量PCR）或Western印迹分析。</li>
	<li>将另一半胃组织放入含有10%福尔马林的15 mL离心管中。将组织浸入10%福尔马林溶液10秒后，展平并贴附于管壁顶部。待组织初步固定后，再次完全浸入10%福尔马林溶液中，固定时间不少于24小时。 
	注：组织可在进行组织学处理前在10%福尔马林中保存数周。然而，长期储存可能影响组织结构和/或抗原性，导致后续分析结果不理想。</li>
</ol>
4. 感染后胃部细菌定植的确认
<ol>
	<li>胃内幽门螺杆菌（H. pylori）的活菌计数
	<ol>
		<li>在对感染小鼠胃组织进行菌落计数前，向无菌HBA平板中添加额外抗生素（200 μg/mL 杆菌肽和10 μg/mL 萘啶酸）16。</li>
		<li>使用可高压灭菌的聚丙烯微量研磨棒手动研磨胃组织样本，或使用机械解离仪（参见材料表）进行均质化处理。</li>
		<li>将所得胃组织匀浆液用无菌BHI培养基进行连续倍比稀释（10−1&#160;至10−2），每个稀释度设两个重复。 
		注：稀释倍数应根据所用H. pylori菌株在感染后通常获得的细菌载量以及感染持续时间来确定。也可直接使用未稀释样本。</li>
		<li>将预先干燥的HBA平板（见上述注释）分为三或四个区域。采用Miles和Misra技术的改良方法，将每种稀释液10–100 mL滴加至琼脂平板的一个区域，并使用无菌塑料接种环均匀涂布15。</li>
		<li>待平板表面液体干燥后，将其倒置（盖子朝下）放入厌氧气体罐中。为维持罐内湿度，需放置一个含有水的培养皿。</li>
		<li>将气体罐在37 °C条件下孵育，直至菌落形成（通常为4–7天）。</li>
		<li>计数含有10至100个独立菌落的区域。 
		注：可通过标准尿素酶、过氧化氢酶和氧化酶试验区分平板上H. pylori和H. felis菌落与其他小鼠胃部微生物群成员的菌落。H. pylori和H. felis在这三项试验中均为阳性。</li>
		<li>使用以下公式计算细菌载量（CFU/g 组织）： 
		[（平均菌落数）×（稀释倍数）×（涂布体积）]/（胃组织重量）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过聚合酶链式反应（PCR）检测胃组织中H. felis感染
	<ol>
		<li>采用标准DNA提取方法或市售试剂盒从小鼠胃组织中提取DNA。</li>
		<li>使用荧光定量技术测定样本DNA浓度（参见材料表）。</li>
		<li>建立PCR反应体系，扩增H. felis尿素酶B基因（ureB）的325碱基对（bp）片段21。每个反应体系包含：100 ng基因组DNA；正向引物（5’-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3’）和反向引物（5’-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3’）各1 mM；200 mM dNTPs；0.5单位Taq DNA聚合酶，以及适量缓冲液和无核酸酶水。 
		注：该引物对设计用于识别并结合H. pylori和H. felisureB基因中的同源序列，但在以下PCR条件下不会扩增肠肝螺杆菌属（enterohepatic Helicobacter spp.）ureB基因中的相应序列。</li>
		<li>采用以下热循环程序进行PCR扩增：94 °C预变性5分钟，随后进行35个循环（94 °C变性30秒，61 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），最后在20 °C保存。</li>
		<li>将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中以100 V电压电泳30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 组织学分析 幽门螺杆菌-感染小鼠胃组织切片
<ol>
	<li>胃组织处理
	<ol>
		<li>将胃组织从福尔马林中取出，并置于干净的培养皿中。</li>
		<li>使用解剖刀将胃组织切成若干大小相等的纵向条状（每条厚2–3 mm），并放入含有泡沫垫的标记包埋盒中。</li>
		<li>将包埋盒置于盛有80%乙醇的容器中，固定胃组织。 
		注意：胃组织可立即进行后续处理，或在下一步操作前于室温保存1–2天。</li>
		<li>使用自动组织处理机处理胃组织，程序设置如下： 
		脱水：70%乙醇 — 1个循环，20分钟；90%乙醇 — 1个循环，20分钟；100%乙醇 — 2个循环，各20分钟 + 1个循环，40分钟 + 1个循环，1小时。 
		透明：二甲苯 — 2个循环，各30分钟 + 1个循环，45分钟。 
		浸蜡：60 °C石蜡 — 1个循环，45分钟 + 1个循环，1小时 + 1个循环，1.25小时。</li>
		<li>从仪器中取出处理好的样本，并在室温下保存，以备石蜡包埋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理后胃组织的石蜡包埋
	<ol>
		<li>将不锈钢底模放置于包埋仪工作台上，以预热模具底部。 
		注意：包埋仪应设定在60 °C，以确保石蜡有效浸透。</li>
		<li>将含有样本的蜡盒放入包埋仪的温蜡浴/加热板区域，直至石蜡完全溶解。 
		注意：建议在石蜡溶解后尽快进行包埋，以防止组织硬化。</li>
		<li>用石蜡填充不锈钢模具一半高度。使用预热的镊子将胃组织条从包埋盒中取出，轻轻将其推入模具底部的石蜡中。小心调整组织条方向，使其与模具底面呈直角，切面朝上。 
		注意：以下步骤应尽快完成，以避免包埋块内石蜡层硬化或分离。胃组织的正确朝向对后续分析至关重要。</li>
		<li>将模具置于包埋仪的冷板上，固定标本位置，必要时重新调整组织方向。 
		注意：若组织移位且石蜡开始硬化，可将模具放回加热板上熔化石蜡，重新包埋组织。</li>
		<li>将一半已标记的包埋盒（用于组织处理）盖在模具上方，并轻轻注入温热石蜡。注意不要让石蜡溢出。</li>
		<li>将模具轻缓地放置于冷板上，使其冷却固化。</li>
		<li>待石蜡完全凝固后，将包埋块从模具中分离。使用加热板（温度高于80 °C）或刮刀清除包埋盒边缘多余的石蜡。包埋块可在室温下长期保存，直至切片使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片
	<ol>
		<li>将石蜡包埋的组织块置于冰上冷却，并将盛有超纯水的水浴锅加热至40–45 °C。</li>
		<li>将刀片固定在切片机刀架上，在插入石蜡块前，将刀片与组织块表面的 Clearance Angle（间隙角）设置为1–5°，以防止组织块表面与刀面接触。 
		注意：确保组织块已去除包埋时附着的多余石蜡，否则可能影响固定效果。</li>
		<li>调整刀片方向，使其对组织块进行直线切割。轻切2–3片薄片，以确认组织块位置正确。</li>
		<li>以约10–30 mm的厚度修块，以确保每条组织条的最大表面积被切出。</li>
		<li>切取10 µm厚的切片，并弃去因修块导致有孔的切片。</li>
		<li>使用镊子小心夹起切片，放入水浴中展平。用镊子将各切片分开。</li>
		<li>从水浴中捞取切片，转移至带电荷的玻璃载玻片上（参见材料表）。</li>
		<li>将载玻片直立放入玻片架中，置于37 °C培养箱内，过夜干燥。</li>
		<li>切片可在室温下长期保存，以备后续分析使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胃组织的苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色
	<ol>
		<li>使用二甲苯清洗载玻片3次，每次5分钟，随后用100%乙醇清洗3次，每次3分钟。确保每个步骤均使用新鲜溶液。</li>
		<li>用自来水冲洗载玻片30–60秒。</li>
		<li>轻轻将载玻片底部在纸巾上轻拍，去除多余水分。用滤过的苏木精染色3分钟，确保切片被溶液充分覆盖。</li>
		<li>在流动的自来水中冲洗载玻片，直至水流清澈。</li>
		<li>将载玻片浸入Scott氏自来水8–10秒。暴露时间不得超过&#160;10秒，否则会导致染色过深。可在显微镜下观察染色效果。此阶段理想染色应呈现“婴儿蓝”色。 
		注意：将2 g碳酸氢钠（NaHCO3）和20 g硫酸镁（MgSO4）溶于1 L蒸馏水中，配制Scott氏自来水。</li>
		<li>用自来水冲洗载玻片30–60秒。</li>
		<li>按步骤3方法去除多余水分，然后用滤过的1%水溶性伊红染色3分钟。</li>
		<li>在流动的自来水中冲洗载玻片，直至水流清澈。 
		注意：可用光学显微镜评估染色效果。若染色过深，可将载玻片在100%乙醇中脱水时间延长；若需更深染色，可在进入下一步前将伊红染色时间延长1–2分钟。</li>
		<li>使用100%乙醇清洗3次，每次30秒，随后用二甲苯清洗3次，每次2分钟。确保每个步骤均使用新鲜溶液。</li>
		<li>用封片介质封片。在干净的盖玻片中央滴加一滴封片介质，然后轻轻将载玻片（切片面朝下）盖在盖玻片上。 
		注意：封片前切勿干燥载玻片。</li>
		<li>将载玻片平放，使其自然风干。也可置于通风橱中以加快干燥速度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胃组织的吉姆萨染色
	<ol>
		<li>使用Histolene清洗载玻片2次，每次5分钟，随后用100%乙醇清洗2次，每次3分钟，最后用70%乙醇清洗1次，持续3分钟。确保每次清洗均使用新鲜溶液。</li>
		<li>用自来水冲洗载玻片30–60秒。</li>
		<li>将20%吉姆萨染液与80%蒸馏水混合，配制吉姆萨染色液。将载玻片置于染色液中染色1小时。</li>
		<li>将载玻片放入含3–4滴乙酸的100 mL蒸馏水中，处理2–3秒。 
		注意：使用前必须充分混匀溶液。此阶段载玻片应呈现淡蓝色。</li>
		<li>用96%乙醇清洗载玻片30秒。</li>
		<li>依次用3缸异丙醇清洗，每缸2分钟，随后用3缸Histolene清洗，每缸2分钟。每次清洗均需使用新鲜异丙醇和Histolene。</li>
		<li>按前述方法使用封片介质封片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种的使用方法 体内 小鼠模型用于 幽门螺杆菌 感染。该操作的关键步骤包括：1）制备 幽门螺杆菌 含有可存活且具运动性的细菌的接种物；2）通过经口灌胃将适量细菌递送至小鼠体内；3）通过菌落计数和/或PCR检测细菌感染情况；以及4）处理胃组织，以便对感染胃组织进行组织病理学评估。下文将进一步讨论相关修改建议、故障排除及技术注意事项。
生长方法 幽门螺杆菌 在本实验室，使用添加马血的2号血琼脂基础培养基培养spp.已有成熟方法。然而，也可选用其他琼脂基础培养基，如布氏琼脂和哥伦比亚血琼脂。22必须确保仅使用无洗涤剂残留且经过灭菌的玻璃器皿来配制培养基。此外，为获得最佳生长效果， H. pylori 细菌应常规接种于含有残留水分且未干燥的琼脂平板上进行传代培养。在准备时 幽门螺杆菌 种（spp）. 用于感染的接种物时，必须进行转接培养 H.&#160;幽门螺杆菌 和 H. fel...

Helicobacter pylori 是一种螺旋形、革兰氏阴性的人类胃部病原体，存在于全球所有人群中，在发展中国家的感染率估计高达80%1。尽管大多数 H. pylori 感染者无症状，但部分感染者会发展为更严重的疾病，从消化性溃疡到胃癌不等2。H. pylori 相关癌症主要分为两类：一类是上皮细胞发生恶性改变导致胃腺癌，另一类是在胃部形成胃外淋巴组织，导致黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤。H. pylori 因具备多种毒力因子及机制，能够适应胃部严苛的生态位，从而实现黏附、生长和代谢。特别是，有毒力的 H. pylori 菌株携带一个40 kb的 cag 致病岛（cagPAI），其编码约30个基因，用于构建IV型分泌系统（T4SS）3,4。携带 cagPAI 的 H. pylori 菌株可诱导宿主产生更高水平的慢性炎症，而这种炎症被认为是胃腺癌发生的重要前期因素5。
体内动物模型，尤其是小鼠模型，已为研究人员提供了重要信息，使其能够探究宿主、细菌和环境因素在H. pylori感染及疾病结局中的相对作用6。先前的研究表明，在C57BL/6遗传背景的小鼠中长期感染H. pylori可导致慢性胃炎和腺体萎缩，这两者均为H. pylori感染的典型特征7。此外，感染相关的猫/犬源性细菌物种H. felis已被证明可在小鼠体内诱导黏膜相关淋巴组织（MALT）的形成，其病理特征和疾病进展与人类MALT淋巴瘤相似8,9。在小鼠定植研究中，最常用的H. pylori分离株是“悉尼株1”（SS1）10，该菌株携带cagPAI+，但其IV型分泌系统（T4SS）无功能（T4SS−）11。其他广泛使用的菌株包括H. pylori B128 7.13（cagPAI+/T4SS+）12和X47-2AL（cagPAI-/T4SS−）13。对于H. felis感染，通常使用CS1菌株（“Cat Spiral 1”，cagPAI-/T4SS−）14。
在此，我们提供了一种制备 幽门螺杆菌 接种物用于 体内 感染、小鼠经口灌胃的操作步骤，以及处理组织以研究胃部组织病理学变化的方法。特别是，本文将重点介绍用于观察细菌定植情况并评估胃黏膜组织病理学变化（包括黏膜相关淋巴组织（MALT）形成）的组织学方法。此处描述的部分方法可适用于其他肠道病原体的研究，例如 S. 伤寒沙门氏菌或 C. rodentium.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细菌学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid 血琼脂基础培养基 No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>使用前溶于去离子水中，再行灭菌</td></tr><tr><td>优质脱纤维马血</td><td>Australian Ethical Biologicals</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 脑心浸出液肉汤</td><td>BD Bioscience</td><td>237500</td><td>使用前溶于去离子水中，再行灭菌</td></tr><tr><td>CampyGen 气体发生包</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林，10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇，100% 变性</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（2-丙醇）</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯（无硫）</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>Mayer 苏木精染液</td><td>Amber Scientific</td><td>MH-1L</td><td>使用前过滤</td></tr><tr><td>伊红水溶性染液</td><td>Amber Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>使用前过滤</td></tr><tr><td>改良 Wright-Giemsa 染色液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WG80-2.5L</td><td>使用前稀释（20% Giemsa，80% 去离子水）</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX 封片介质</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;分子生物学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 定量检测试剂盒</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>本研究中所用 &lt;em&gt;ureB&lt;/em&gt; 引物的退火温度为 61 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>试剂盒包含 10× PCR 缓冲液和氯化镁</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td>使用前用无菌无核酸酶水稀释至 10 mM</td></tr><tr><td>分子生物学级琼脂糖</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗生素&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>万古霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>溶于去离子水中</td></tr><tr><td>多粘菌素 B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>溶于去离子水中</td></tr><tr><td>甲氧苄啶（&amp;ge;98% HPLC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>溶于 100%（无水）乙醇中</td></tr><tr><td>两性霉素</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td><td>E437-100MG</td><td>溶于去离子水中</td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Bacillus licheniformis&lt;/em&gt; 的杆菌肽</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>溶于去离子水中</td></tr><tr><td>萘啶酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>溶于去离子水中</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲氧氟烷（Penthrox）</td><td>Medical Developments International</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与塑料耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid 厌氧罐</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>COPAN 玻璃巴斯德吸管</td><td>Interpath Services</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R 离心机</td><td></td><td></td><td>以 2,200 rpm 离心 10 分钟（4 &amp;deg;C）收集细菌沉淀</td></tr><tr><td>23 号精密针头</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Portex 细内径聚乙烯导管</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>塑料喂养导管</td><td>Instech&amp;nbsp; Laboratories</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 无菌结核菌素鲁尔滑动一次性注射器</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.2 - 2 mL 管用微型研磨杵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z317314</td><td>用于胃组织匀浆的可高压灭菌聚丙烯研磨杵</td></tr><tr><td>GentleMACs 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>使用预设的 GentleMACS 程序处理小鼠胃组织</td></tr><tr><td>M 管（橙色盖）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>无菌塑料接种环</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>冷台，Leica EG1160 包埋系统</td><td>Leica Biosystems</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 基底模具系统，基底模具 38 × 25 × 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III 通用包埋盒系统</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Leica RM2235 切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带电荷的 SuperFrost Plus 玻片</td><td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠模型 幽门螺杆菌 感染与胃部病理学

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

幽门螺杆菌 是一种存在于全球一半人口中的胃部病原体，是人类发病和死亡的重要原因。多种小鼠胃部模型 幽门螺杆菌 感染已开发用于研究其分子和细胞机制 H. pylori 细菌定植于人类宿主的胃部并引发疾病。本文中，我们描述了以下实验方案：1）制备用于感染的细菌悬液； 体内 通过灌胃法感染小鼠；2）通过聚合酶链式反应（PCR）和活菌计数法测定小鼠胃组织中的细菌定植水平；3）通过组织学方法评估病理学变化。为建立 幽门螺杆菌小鼠感染实验中，首先将无特定病原体（SPF）动物接种于悬液（含≥105 菌落形成单位（CFUs）的定植小鼠菌株 幽门螺杆菌 或其他胃部 幽门螺杆菌 来自动物的 spp.，例如 幽门螺杆菌 felis 在感染后的适当时间点，取出胃组织并沿矢状面解剖为两个相等的组织片段，每个片段均包含幽门部和胃体部。其中一个片段用于活菌计数或DNA提取，另一个片段则进行组织学处理。可通过Warthin-Starry、吉姆萨（Giemsa）或苏木精-伊红（Haematoxylin and Eosin, H&E）染色的胃组织切片，常规评估胃内细菌定植情况及组织病理学改变。&amp;#38;E) 染色，视具体情况而定。也可在小鼠胃组织切片上通过免疫组织化学或免疫荧光进行额外的免疫学分析。以下所述方案专为在小鼠中评估类似于人类相关胃部病理而设计 H. pylori 疾病，包括炎症、腺体萎缩和淋巴滤泡形成。接种物制备和经胃灌胃操作方案也可经调整后用于研究其他定植于小鼠的肠道人类病原体的发病机制，例如 沙门氏菌 伤寒沙门氏菌或 鼠伤寒柠檬酸杆菌.

本方案描述了一种通过口服灌胃技术在小鼠模型中实现幽门螺杆菌（H. pylori）或猫胃螺杆菌（H. felis）胃内感染的方法（图1）。安乐死后，取出小鼠胃组织，称重，并沿胃窦、胃体及非腺体区域均分为两等份（图2）。在进行任何分析之前，需先去除非腺体区域。
动物成功定植通常通过在H. pylori感染的胃组织匀浆液上进行活菌计数，并在HBA平板上计数单个菌落来确认（图3）。或者，可采用PCR方法，使用针对H. felis和H. pylori ureB基因325 bp区域的特异性、已验证引物，来确认H. felis的感染（图4）。
胃组织经过处理、包埋并切片，用于后续组织学分析。采用苏木...

小鼠代表了一种不可估量的 体内 用于研究胃肠道微生物感染及相关疾病的模型。在此，我们描述了用于研究细菌定植及小鼠模型中组织病理学变化的方法 幽门螺杆菌-相关疾病

幽门螺杆菌是一种胃部病原体，存在于全球一半人口中，是导致发病率和死亡率的重要原因……

该方法有助于解答胃肠病学领域中的关键问题，即微生物群成员（特别是幽门螺杆菌属）对炎症和癌症的影响。该技术的主要优势在于，可在生理条件下研究幽门螺杆菌感染及其对胃部的影响。该技术的应用前景包括开发用于预防或清除幽门螺杆菌感染及其后果（如抗生素、药物或疫苗）的治疗方法。这些方法可提供关于幽门螺杆菌感染发病机制的特异性信息。然而，其中部分技术也可适用于其他胃肠道病原体的研究。通常，初次使用该方法的研究人员在制备能够成功在小鼠体内建立感染的细菌接种物时会遇到困难。必须确保幽门螺杆菌分离株为已知的定植小鼠菌株，且未经过体外长期传代培养。此外，应记录这些菌株的体外传代次数。将细菌悬液加入15毫升聚苯乙烯管中，并使用塑料接种环从每种培养物中转移一滴10至20微升的液滴至各自的玻璃显微镜载玻片上。然后，在100倍放大倍数下，使用相差显微镜评估细菌的活力和运动性。只有当大多数细菌呈杆状时，才使用H.pylori接种物。H.felis接种物应主要含有螺旋状细菌。将接种物分别装入一次性1毫升注射器中。为每支注射器安装23号针头，并使用塑料封口膜将一次性聚乙烯导管固定在每根针头上。随后，用手通过颈部皮肤和尾巴固定一只6至8周龄的无特定病原体且无螺杆菌的小鼠，将一根导管插入张开的下颌中央。将导管向尾侧引导至食管方向，伸展小鼠颈部，以便导管经食管顺利进入胃部并避开气管，直至导管大部分或全部不可见且感到一定阻力。随后，接种至少1×10⁵个细菌，以确保实现理想的定植及疾病病理状态。实验结束时，使用精细的弯剪打开腹腔，以切除胃组织。沿胃大弯剪开胃组织，然后在50毫升离心管中用新鲜的PBS轻轻冲洗器官两次，每次使用一管PBS，以去除任何残留的食物。第二次冲洗后，将组织放入已去皮重的6厘米塑料培养皿中，记录湿重。将胃组织展平后，沿矢状方向将样本均分为两部分，每部分均包含幽门、胃体和无腺部前胃区域。去除无腺部区域，将每份胃组织的一半称重后，将该组织样本放入适合后续分析的相应溶液中保存。将胃组织的另一半放入含有10%甲醛的15毫升锥形管中，在10秒后将组织贴附于管壁顶部。待组织固定于管壁后，将样本重新完全浸入甲醛中至少24小时。为了计算感染后胃内可存活的幽门螺杆菌（H. pylori）数量，将保存在脑心浸液（BHI）中的胃组织样本进行匀浆处理，并用新鲜无菌肉汤对所得胃匀浆液进行连续倍比稀释。将添加了额外抗生素的预干燥马血琼脂（HBA）平板分为三至四个区域，采用改良的Miles和Misra技术，将每种胃匀浆稀释液10至100微升（µL）分别接种到各琼脂平板的一个区域。使用无菌塑料接种环将匀浆液涂布均匀，并静置使平板干燥。然后，将平板倒置放入含有一个盛有水的培养皿和一个气体包的厌氧气体罐中。随后，将气体罐在37摄氏度下培养4至7天。当可观察到菌落时，计数含有10至100个孤立菌落的区域。安乐死后，从动物

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了解幽门螺杆菌感染小鼠模型的建立方法，用于研究胃肠道炎症与癌症的病理机制。该技术可评估细菌定植和组织病理学变化，为开发抗生素、药物或疫苗等治疗策略提供重要依据。

小鼠模型幽门螺杆菌感染与胃部病理学

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