小鼠肝灌注肝细胞和正弦内皮细胞的纯化
February 12th, 2018
该协议的目的是获得高生存能力和高产量的肝细胞和正弦内皮细胞。这是通过灌注肝与 IV 型胶原酶溶液通过门静脉, 其次是差异离心获得肝细胞和正弦内皮细胞。
该程序的总体目标是成功进行小鼠肝脏灌注，以促进目标特定肝细胞群的纯化。该方法可以帮助回答肝病学领域关于如何在体外或体内测定中协助特定肝细胞群功能的关键问题。该技术的主要优点是可以从每个肝脏获得的窦内皮细胞中的大量肝细胞。
这种方法的视觉演示至关重要，因为必须看到最佳消化肝脏的颜色和形状，以保持细胞活力。放置门静脉导管，首先用镊子的背面将肠道移动到小鼠腹腔的右侧，露出门静脉，然后用弯曲的镊子将一根 20 厘米长的涤纶缝纫线滑到肝脏和胰十二指肠上静脉之间的门静脉下。使用镊子小心地将线拉到动物的另一侧，使其位于门静脉下方的中心。
并在门静脉周围打一个松散的头顶结。将弯曲的镊子放在静脉下方，轻轻地将所有组织材料拉向尾部以拉直静脉。接下来，将导管针头的斜面朝上并与门静脉下部靠近镊子平行，然后用针头轻轻刺穿静脉。
当斜面位于静脉腔中时，缩回弹簧加载的针头，并继续将掌状导管推过静脉，直到斜面靠近金星分支区域。将结固定在导管周围后，立即将蠕动泵设置为每分钟 4 毫米，并将管子的公端连接到导管的内端，此时您应该开始看到肝分支。切开腹主动脉进行引流。
使用遮蔽胶带将管路固定在垫底上。用剪刀垂直切开腹部皮肤，以便引流血液和灌注液。然后用直镊子挤压流出的血管几次，使肝脏充气，确保血液全部排出，并用 PBS 灌注肝脏，直到肝组织变白。
要收获肝细胞，首先将流出管从 1 升 PBS 培养瓶更换为 125 毫升培养瓶，其中含有补充胶原酶-4 的缓冲液 2。当胶原酶到达肝脏时，短暂但紧紧地挤压流出的血管以建立压力，并让消化缓冲液充满肝脏的所有叶。在缓冲液穿过肝脏周围的结缔组织之前释放血管。
并让缓冲液灌注穿过肝脏，直到整个体积流过组织。接下来，将含有 10 毫升缓冲液的结晶皿放在小鼠旁边，并使用直镊子和剪刀将肝脏转移到培养皿中。将培养皿转移到无菌组织培养罩中，并使用无菌技术抓住肝脏以剥开胶囊。
轻轻摇动肝组织中的细胞，然后将所得细胞溶液通过 100 微米过滤器倒入 50 毫升锥形管中。然后用更多的缓冲液 1 冲洗过滤器中的肝脏残留物。当肝脏似乎没有细胞时，将拉出的滤液通过 40 微米过滤器过滤到第二个 50 毫升试管中，然后离心收集细胞。
将含有非实质细胞和死亡肝细胞的上清液一次性倒入冰上新的 50 毫升试管中，以保存沉淀并将沉淀重新悬浮在 40 毫升新鲜缓冲液 1 中，用于下一次离心。为了分离鼻窦内皮细胞，离心含有非实质细胞的上清液。将细胞悬液拉入一个新的 50 mL 锥形管中，使总体积达到 35 mL。
通过离心收集拉出的细胞，并使用 25 毫升移液器小心地将含有非实质细胞的顶部 25 毫升上清液转移到冰上新的 50 毫升锥形管中。向试管中加入 25 mL新鲜培养基，然后重悬沉淀以进行第二次离心和上清液去除。然后离心上清液，将 15 毫升 50% Percoll 溶液加入新的 50 毫升试管中。
使用设置为最低射出速度的移液器，将 20 毫升 25% Percoll 叠加到 50% Percoll 溶液上，然后将非实质细胞重新悬浮在 10 毫升 4 摄氏度培养基中。小心地将细胞分层到 Percoll 溶液上。并通过密度梯度离心分离细胞。
接下来，吸出前 30 毫升溶液，并使用塑料 5 毫升移液管将位于 25% 至 50% 密度梯度溶液界面的窦内皮细胞和 Kupffer 细胞收集到新的 50 毫升锥形管中。用 50 毫升培养基洗涤细胞并重新悬浮沉淀，同时在 12 毫升温热培养基中冲洗管底的侧面。为了将窦状内皮细胞与 Kupffer 细胞分离，将细胞悬液转移到加湿组织培养箱中的聚苯乙烯培养皿中 8 分钟。
孵育结束时，使用 25 毫升移液器吸出上清液，并使用上清液冲洗培养皿，移液器设置为最低速度，以收集剩余的正弦内皮细胞。然后将窦状内皮细胞转移到新的 50 毫升试管中。然后通过离心收集细胞，使其重新悬浮并接种在胶原包被的细胞培养皿中。
PBS 固定灌注后小鼠肝脏的扫描电子显微镜检查，以类似于刚才演示的方式，揭示了肝脏微观解剖结构和肝细胞之间的微绒毛的清晰视图。在程序早期的低速离心过程中收获的肝细胞，在含有牛血清白蛋白的缓冲液中洗涤 4 次后表现出高纯度。通过在胶原包被的聚苯乙烯培养皿上选择性粘附来分离窦状内皮细胞，从而获得 83% 至 90% 的纯度，这在很大程度上取决于胶原酶消化的整体有效性。
正如刚才所展示的，使用代表性分离程序的光学显微镜进行定量测量，揭示了近乎 100% 纯肝细胞群的典型分离结果。以及略高于 89% 的纯正弦内皮细胞群。观看此视频后，您应该对如何切开小鼠门静脉以及如何从小鼠肝脏中纯化肝细胞和窦内皮细胞有很好的了解。
该程序也可用于在肝细胞分离后使用不同的密度梯度和离心速度从非实质部分纯化卫星细胞。
概述
本协议概述了一种进行小鼠肝脏灌流以分离高产量的肝细胞和窦内皮细胞的方法。该技术涉及用胶原酶溶液灌流肝脏并利用差速离心来纯化特定的肝细胞群体。
关键研究组成部分
科学领域
- 肝病学
- 细胞生物学
- 体外分析
背景
- 了解肝细胞功能对肝病学研究至关重要。
- 分离特定的肝细胞有助于研究它们在各种分析中的作用。
- 细胞的高活性和产量对实验的成功至关重要。
- 对肝脏消化的视觉评估对于维持细胞完整性很重要。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分离肝细胞和窦内皮细胞。
- 增强对肝细胞功能在研究中的理解。
- 为该领域的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 通过门静脉用胶原酶溶液灌流肝脏。
- 差速离心以分离细胞群体。
- 密度梯度离心用于进一步纯化窦内皮细胞。
- 视觉检查和小心处理以确保细胞活力。
主要结果
- 成功分离肝细胞和窦内皮细胞。
- 通过所描述的方法实现高细胞活力和产量。
- 通过扫描电子显微镜清晰可见肝脏微观解剖结构。
- 协议为未来的肝病学研究提供了框架。
结论
- 该协议对于分离肝细胞群体是有效的。
- 高产量和活力的细胞支持它们在研究中的使用。
- 该方法可以促进对肝脏生物学理解的进步。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable isolation of primary hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver, providing a physiologically relevant system for studying liver-specific drug metabolism and toxicity. The method supports early discovery by delivering high-yield, viable cells for in vitro assays that inform target validation and lead optimization. By minimizing ischemia-reperfusion injury through portal vein catheterization, it enhances data reproducibility across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for interrogating hepatic target engagement and pathway modulation in vitro.
- Operational Value: Delivers consistent hepatocyte yields for functional assays that de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of purified sinusoidal endothelial cells for co-culture models that improve assay predictability.
- Operational Value: Supports standardized cell isolation for scalable screening platforms assessing compound effects on liver sinusoidal signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a translational biomarker-aligned system for studying liver-specific drug responses prior to in vivo testing.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical evaluation by supplying well-characterized primary liver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early biology through lead identification by supplying validated primary hepatocytes for ADME/Tox screening and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of liver targets using primary cells that retain in vivo-like functionality.
- Screening: Delivers reproducible hepatocyte and SEC preparations for quantitative compound screening in metabolic and inflammatory pathways.
- Analytics: Generates viable cell lysates and cultured cells for biochemical readouts such as enzyme activity, cytokine release, and barrier integrity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing cells that reflect murine liver biology for target validation studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow for generating consistent liver cell preparations across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver-related target validation through use of primary, physiologically relevant cells.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via a well-defined perfusion and centrifugation protocol.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by improving early detection of liver-mediated liabilities.
- Portfolio Impact: Enables risk-informed prioritization of compounds based on hepatic cell-based assay outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery and vascular catheterization for successful portal vein access.
- Depends on perfusion pumps, centrifuges, and sterile tissue culture facilities for cell processing.
- Necessitates standardization of collagenase digestion times and buffer conditions across operators.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different mouse strains or ages.
- Limited by the technical challenge of portal vein catheterization in smaller mice (18–25 g), which may affect throughput.
