小鼠肝脏灌注法分离肝细胞和肝窦内皮细胞

本实验的总体目标是成功完成小鼠肝脏灌注，以促进特定肝细胞群体的纯化。该方法有助于回答肝病学领域中的关键问题，例如如何在体外或体内实验中辅助特定肝细胞群体的功能。该技术的主要优势在于，从每只肝脏中均可获得大量肝细胞及肝窦内皮细胞。

对该方法进行可视化演示至关重要，因为必须通过观察肝脏消化后的颜色和形态来确保细胞活力的维持。在放置门静脉导管时，首先使用镊子背面将小鼠腹腔内的肠道推向右侧，暴露出门静脉，然后用弯头镊子在肝脏与胰十二指肠上静脉之间，将一段20厘米长的聚酯缝纫线从门静脉下方穿过。再用镊子小心地将缝线拉至动物另一侧，使其正好位于门静脉正下方中央位置。

在门静脉周围打一个松散的结。将弯头镊子置于静脉下方，轻轻将所有组织向尾部方向牵拉，以拉直静脉。接着，将导管针的斜面朝上，并与镊子附近的门静脉下部平行，然后用针头轻轻穿刺静脉。

当针尖斜面进入静脉管腔后，回撤弹簧自动回缩的针头，继续推进导管通过静脉，直至斜面接近静脉分支区域。在导管周围打结固定后，立即启动蠕动泵，设置流速为 4 毫米/分钟，并将导管管路的雄性接头连接至导管的雌性接头端，此时应开始观察到肝脏分支血管。剪开腹主动脉以供引流。

使用美纹纸胶带将管路固定在垫子下方。用剪刀垂直剪开腹部皮肤，以利于血液和灌注液的排出。然后用直镊子挤压流出的血管数次，使肝脏膨胀，确保所有血液均已排出，并用 PBS 灌注肝脏，直至肝组织变白。

为了收获肝细胞，首先将流出管路从一升的 PBS 试剂瓶更换为含有胶原酶-4 的 125 毫升试剂瓶（其中装有缓冲液二）。当胶原酶到达肝脏时，短暂但紧密地挤压流出的血管，以建立压力，使消化缓冲液充满肝脏的所有叶。在缓冲液冲破肝脏周围结缔组织之前，松开血管。

让缓冲液灌注肝脏，直至全部体积的液体流经组织。接下来，将一个含有10毫升缓冲液的结晶皿放置在小鼠旁边，使用直头镊子和剪刀将肝脏转移至皿中。将皿移至无菌组织培养罩内，采用无菌技术，用镊子夹住肝脏以剥离其包膜。

轻轻振荡肝脏组织以分离细胞，并将所得的细胞悬液通过100微米滤膜过滤至一个50毫升锥形管中。然后用更多的缓冲液一冲洗滤膜上的肝脏残留物。当肝脏组织看起来已无细胞残留时，将滤过的滤液通过40微米滤膜过滤至第二个50毫升离心管中，并通过离心收集细胞。

将含有非实质细胞和死亡肝细胞的上清液一次性倒入置于冰上的新50毫升离心管中，以保护沉淀，并用40毫升新鲜缓冲液1重悬沉淀，用于下一次离心。为分离窦状内皮细胞，对含有非实质细胞的上清液进行离心。将细胞悬液转移至一个全新的50毫升锥形管中，并将总体积调整至35毫升。

通过离心收集拉取的细胞，使用25毫升移液管小心地将含有非实质细胞的上清液顶部25毫升转移至冰上新的50毫升锥形管中。向管中加入25毫升新鲜培养基，重悬沉淀物，进行第二次离心并去除上清液。然后对上清液进行离心，并向新的50毫升管中加入15毫升50% Percoll溶液。

使用移液器并将排液速度调至最低，将 20 毫升 25% Percoll 缓慢覆盖在 50% Percoll 溶液上，然后将非实质细胞重悬于 10 毫升 4 °C 的培养基中。小心地将细胞分层加至 Percoll 溶液上，通过密度梯度离心法分离细胞。

接下来，吸出前30毫升溶液，使用塑料5毫升移液管将位于25%至50%密度梯度溶液界面处的肝窦内皮细胞和库普弗细胞收集到一个新的50毫升锥形管中。用50毫升培养基洗涤细胞，并在12毫升预温的培养基中重悬细胞沉淀，同时冲洗管底边缘。为分离肝窦内皮细胞与库普弗细胞，将细胞悬液转移至聚苯乙烯培养皿中，置于湿润化的组织培养孵育箱内孵育8分钟。

孵育结束后，使用25毫升移液管吸除上清液，并用该上清液在最低流速下冲洗培养皿，以收集残留的窦状内皮细胞。随后将窦状内皮细胞转移至新的50毫升离心管中。接着通过离心收集细胞，再重悬并接种于胶原包被的细胞培养皿中。

以类似于前述方法的PBS灌注固定小鼠肝脏后进行扫描电镜观察，可清晰显示肝脏的微细解剖结构以及肝细胞之间的微绒毛。在实验早期低速离心步骤中收集的肝细胞，经含牛血清白蛋白缓冲液洗涤四次后，纯度较高。通过在胶原包被的聚苯乙烯培养皿上选择性黏附分离肝窦内皮细胞，可获得83%至90%的纯度，其纯度在很大程度上取决于胶原酶消化的整体效率。

通过刚才演示的代表性分离步骤，利用光学显微镜进行的定量测量显示，所获得的肝细胞群体纯度接近100%，而肝窦内皮细胞群体的纯度略高于89%。观看本视频后，您应能够充分掌握小鼠门静脉插管技术，以及从小鼠肝脏中分离纯化肝细胞和肝窦内皮细胞的方法。

该方法也可用于在通过不同密度梯度和离心速度分离肝细胞后，从非实质细胞组分中纯化卫星细胞。