通过非天然氨基酸的选择性压力整合及质谱与荧光蛋白分析技术构建“金色”荧光蛋白

本实验的目标是通过选择性压力掺入法，在重组蛋白表达过程中用非天然氨基酸取代天然氨基酸，从而生成新型金色荧光蛋白。选择性压力掺入法旨在制备具有新颖化学特性的蛋白质，这在尝试理解或设计蛋白质功能时尤为有用。

该技术的主要优势在于其实验操作相对简单，因其与常见的重组蛋白生产方法类似。时间与波长相关的荧光有助于研究修饰蛋白的激发态动力学，从而更易于理解引入发色团的非天然氨基酸对光学性质的影响。原则上，SPI 可应用于任何可获得营养缺陷型菌株和化学成分明确培养基的蛋白生产体系。

这包括其他细菌菌株以及哺乳动物细胞培养。表达条件的时间安排和设置至关重要，因为必须抑制未修饰的野生型蛋白的产生。因此，诸如温度、诱导时间或培养基成分等某些参数需要进行优化。

我们在最初研究含甲基氨基酸（如硒代甲硫氨酸）的蛋白质提取物后，首次提出了该方法的设想。本次实验操作将由我实验室的学生 Almut Pelzer 进行演示。开始本实验前，先将色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌细胞用 ECFP 表达质粒进行转化。

用单个菌落接种含有氨苄青霉素的5毫升LB培养基，置于培养管中。在37摄氏度、200 rpm条件下过夜培养。次日，取1毫升过夜培养物接种至100毫升添加了补充物的NMM19培养基中，置于1升锥形瓶内。

然后，在30 °C、200 rpm条件下，将培养物于摇床中过夜培养。次日，每30分钟测量一次600 nm处的光密度，直至30分钟内光密度变化小于0.05。接着，在4 °C、5,000 ×g条件下离心培养物10分钟，以收集细菌细胞。

倾倒弃去上清液。将细胞重悬于添加了氨苄青霉素的 NMM19 培养基中，总体积为 100 毫升。将此悬液转移回同一锥形瓶中。

加入4-氨基吲哚至终浓度为1毫摩尔。在30摄氏度、200转/分钟条件下，于摇床中孵育30分钟。30分钟后，向培养物中加入IPTG至终浓度为0.5毫摩尔，以诱导目的基因表达。

在30摄氏度、200 rpm条件下，于摇床中过夜培养。次日，在4摄氏度、5,000 ×g条件下离心10分钟，收集菌体细胞。通过倾倒弃去上清液。

将细胞沉淀在-20摄氏度或-80摄氏度下冷冻，直至准备进行目标蛋白纯化。首先，按照文本方案制备细菌细胞裂解液。根据制造商说明书准备好层析柱后，使用结合缓冲液对固定化金属离子亲和层析柱进行平衡。

将裂解液上样至层析柱，直至完成。注意观察与层析树脂结合的金黄色蛋白质。用结合缓冲液洗涤层析柱。

然后，使用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。收集并合并含有金黄色荧光蛋白的洗脱组分，该蛋白可通过可见的金黄色进行识别。之后，根据制造商的说明，准备截留分子量在 5,000 至 10,000 之间的透析膜。

将一毫升样品在至少100毫升缓冲液中透析，时间不少于两小时。首先，用MS缓冲液将蛋白质样品稀释至0.1毫克/毫升，最终体积为80微升。小心移液以混匀。

将溶液转移至带有玻璃内插管的质谱自动进样瓶中，并用瓶盖密封。轻弹进样瓶以去除气泡。接着，在第二个进样瓶中准备含有质谱缓冲液的空白样品。

将两个小瓶放入高效液相色谱自动进样器中。然后，根据制造商的说明准备并校准质谱仪。对于高效液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱法，设置自动进样器的进样体积为五微升。

首先，为本底运行创建工作列表，然后为GdFP样品运行创建工作列表。设定进样体积和相应的自动进样瓶位置，并运行该工作列表。开始时，按照文本方案中的说明，制备金黄色荧光蛋白溶液，并准备用于时间与波长相关单光子计数的检测器。

使用单光子计数软件，以每秒约 200,000 个光子的计数速率采集荧光发射信号，直至荧光衰减曲线的采集峰值处累计约 10,000 个计数。此后，将样品比色皿替换为装有 PBS 缓冲液中胶体二氧化硅的一厘米石英比色皿。移除激光滤光片，并调节光栅，以在探测器的中心通道采集 470 纳米的光子。

然后，采集仪器响应函数，直至发射峰处累积约 10,000 个计数。按照文本方案中所述方法对所得数据进行转换、拟合和绘图，以获得衰减相关光谱，该光谱表示荧光衰减时间对发射波长的依赖性。在本研究中，采用质谱法确认成功产生了光谱红移的绿色荧光蛋白型荧光团变体，即金黄色荧光蛋白。

野生型 ECFP 在发色团成熟后，其计算蛋白分子量为 28,283.9 道尔顿，而金黄色荧光蛋白的相应分子量为 28,313.9 道尔顿。金黄色荧光蛋白的去卷积 ESI-MS 谱图显示主峰质量约为 28,314.1 道尔顿，与理论值的偏差小于百万分之十。这证实了通过选择性压力插入法实现了非天然氨基酸的特异性掺入。

ECFP的吸收光谱在434纳米和452纳米处有两个特征性最大值。相比之下，金黄色荧光蛋白表现为一个宽广的红移吸收带，其最大值位于466纳米。尽管EGFP的吸收最大值进一步红移到488纳米，但金黄色荧光蛋白的荧光发射光谱及其对应的GdFP的斯托克斯位移表明，它是所有来自维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白衍生物中红移程度最大的一种。

此处显示的是通过单光子计数监测的时间分辨荧光发射。衰减曲线在600纳米处的荧光衰减速率略快于550纳米处。金黄色荧光蛋白的荧光发射强烈依赖于pH值，这在许多绿色荧光蛋白变体中具有典型性。

如图所示，在较低 pH 条件下荧光明显减弱，但光谱特征保持不变。一旦掌握该技术，从转化后的细菌菌落或冻存的甘油菌种开始，可在三天内完成实验。在进行该操作时，必须确保目标氨基酸被充分耗尽。

非经典氨基酸必须被细胞吸收，具有生物相容性，并能通过所选的营养缺陷型菌株整合到蛋白质中。通过此方法，可生成多种多样的蛋白质用于工程化改造。根据目标蛋白质的特性，可采用蛋白质稳定性分析仪、酶活性测定、荧光光谱或蛋白质结晶等方法，来描述非经典氨基酸对蛋白质功能和结构特性的影响。

该技术问世后，在合成生物学领域被证明具有重要价值，能够创造出自然界中不存在的新型蛋白质和蛋白质组，从而拓展了蛋白质工程的化学能力。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过选择性压力掺入法将非天然氨基酸引入重组蛋白，如何利用质谱技术验证人工氨基酸的引入，以及如何通过时间分辨荧光光谱分析荧光蛋白。