Name: 杆状病毒基因治疗应用的生产与纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 学习利用昆虫细胞培养生产杆状病毒，并通过肝素亲和层析与超速离心进行纯化和浓缩。该方法可去除Sf9细胞培养物中的细胞碎片和蛋白质，避免炎症反应，为基因治疗应用提供高纯度病毒载体。

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本工作部分由辛辛那提儿童研究基金会（CCRF）向 M.N. 提供的启动资金以及美国国立卫生研究院国家推进转化科学中心资助的创新核心基金（ICG）（资助编号 UL1 TR001425）支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

参见图1，其中示意图总结了本实验方案。
1. 杆状病毒质粒DNA的纯化
<ol>
	<li>在200 mL含有抗生素（卡那霉素50 µg/mL、四环素10 µg/mL和庆大霉素7 µg/mL）的LB液体培养基中，于37 °C、300 rpm振荡培养含有杆状病毒质粒DNA（bacmid）14的细菌，培养16小时。</li>
	<li>采用标准的碱裂解法15从细菌培养物中纯化bacmid DNA，并将其溶解于TE缓冲液中。</li>
</ol>
2. 杆状病毒的生产
<ol>
	<li>在28℃、135 rpm条件下，于轨道摇床培养箱中培养Sf9细胞 &#176;C，置于含无血清昆虫细胞培养基的聚碳酸酯锥形瓶中1,2,3. 
	注意： 若Sf9细胞从冻存株中复苏，需至少给予两周时间使细胞恢复并进入对数生长期。</li>
	<li>用台盼蓝染色后，使用血细胞计数板对处于对数生长期收获的 Sf9 细胞进行计数。接种 1 × 10⁶ 细胞/mL。6 6 孔组织培养板中每孔加入 2 mL 培养基，接种适量活 Sf9 细胞，在 28 °C 下孵育 1 小时使细胞贴壁 &#176;C，在培养箱中。</li>
	<li>将培养基更换为1 mL无血清未添加物的Grace昆虫细胞培养基。</li>
	<li>使用昆虫细胞转染试剂将杆状病毒质粒DNA转染入Sf9细胞中。
	<ol>
		<li>混合 8 &#181;L昆虫细胞转染试剂与100 &#181;升 Grace昆虫培养基</li>
		<li>稀释2 &#181;克杆状病毒质粒DNA至100 &#181;升未添加补充剂的昆虫培养基，轻轻涡旋混匀。</li>
		<li>将稀释后的DNA与稀释后的昆虫细胞转染试剂混合，轻柔混匀。室温孵育15至30分钟。</li>
		<li>将DNA-脂质混合物逐滴加入细胞中。在28℃下孵育 &#176;在培养箱中于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育约 5 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从细胞中移除转染混合物，并用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>加入2 mL昆虫培养基，继续在28℃下培养 &#176;在培养箱中于不更换培养基的条件下培养。 
	注意： 如果杆状病毒质粒（bacmid）含有荧光蛋白，其表达可在转染后48小时于细胞中检测到。转染的Sf9细胞可产生杆状病毒并将其分泌至培养基中，进而感染未转染的细胞。在5天内，整个细胞群体均被杆状病毒感染，并表现出病毒感染的特征，即细胞病变效应。这些特征包括细胞直径增大、细胞质中出现空泡或颗粒、细胞生长停止，以及细胞培养物中存在死亡或裂解的细胞。然而，如果转染或感染效率不理想，培养物可能不会表现出明显的细胞病变效应。细胞病变效应可在200–400倍放大倍数下使用倒置相差显微镜观察。杆状病毒感染的细胞可通过抗gp64抗体染色进行检测。11.</li>
	<li>转染后5天收集杆状病毒上清液，并标记为P1 病毒储备液</li>
	<li>将对光敏感的杆状病毒上清液用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS避光保存，4℃储存 &#176;C用于短期（最长90天）或-80 &#176;长期保存。</li>
	<li>接种 6 &#215; 106 Sf9细胞接种于含10 mL昆虫细胞培养基的10 cm组织培养处理板中。加入1 mL初始杆状病毒上清液（P1) 加入细胞中。</li>
	<li>收获杆状病毒上清液（P2) 在 5th 感染后第几天</li>
	<li>接种50 mL Sf9细胞（3 × 10⁶ cells/mL）至含150 cm²培养面积的细胞培养瓶中6 细胞/mL）置于250 mL聚碳酸酯锥形瓶中的昆虫培养基悬浮培养体系中，将锥形瓶放入摇床培养箱。加入2 mL P2 将病毒悬液加入细胞中，在28℃恒温条件下以135 rpm振荡培养 &#176;C. 
	注意： 感染后三到四天，整个 Sf9 细胞群将出现细胞病变效应，这表明已产生高滴度的杆状病毒。</li>
	<li>依次扩增杆状病毒上清液，直至获得所需体积（P3，P4, &#8230;通过在每次后续感染中将细胞培养体积增加10至50倍来实现。 
	注意： P3 是3rd 感染轮次中，可用10至20 mL的P感染500 mL至1 L的Sf9细胞培养物2 杆状病毒上清液；P4 是第4个th 感染轮次中，可使用100至200 mL的P感染5至10 L的Sf9细胞培养物3 杆状病毒上清液等。通常，Sf9细胞以每毫升3×10⁵个细胞的密度接种于培养皿中 &#215; 106 细胞/mL，使用无血清昆虫细胞培养基。</li>
	<li>在 4 ℃ 下以 1,000 × g 离心杆状病毒上清液 30 分钟 &#176;C以去除&#160;细胞碎片，并用 50 单位/毫升核酸酶（250 单位/&#181;L 原液）于 37 ℃ 孵育 2 小时 &#176;C以消化基因组DNA和RNA。将上清液通过0.45 μm滤膜过滤 &#956;m 滤膜单元</li>
</ol>
3. 层析系统的准备
<ol>
	<li>通过依次用无菌水、1 N 氢氧化钠、水和洗涤缓冲液（20 mM 磷酸钠缓冲液，含 150 mM 氯化钠，pH 7.0）以 50 mL/min 的线性流速冲洗样品管路和缓冲液管路，来准备层析系统。</li>
	<li>通过依次以 7 mL/min 的线性流速运行柱清洗缓冲液（5 CV 的无菌 20 mM 磷酸钠缓冲液，含 2 M 氯化钠，pH 7.0）和 5 CV 洗涤缓冲液，准备肝素 50 µm 柱（10 × 10 cm，柱体积（CV）为 7.9 mL）。</li>
</ol>
4. 杆状病毒载体的纯化
<ol>
	<li>按如下方式设置层析系统：
	<ol>
		<li>使用样品加载入口端口加载杆状病毒上清液。</li>
		<li>使用缓冲液入口端口 A1 加载洗涤缓冲液。准备一个装有至少 500 mL 洗涤缓冲液的瓶子，并将洗涤缓冲液管路插入瓶中。</li>
		<li>使用缓冲液入口端口 A2 加载洗脱缓冲液（20 mM 磷酸钠，含 1.5 M 氯化钠，pH 8.0）。准备一个装有至少 500 mL 洗脱缓冲液的瓶子，并将洗脱缓冲液管路插入瓶中。</li>
		<li>在组分收集器中插入多个 50 mL 圆锥形离心管，用于收集流穿的柱上清液（即未结合的杆状病毒上清液）、洗涤缓冲液以及洗脱下来的杆状病毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用五倍柱体积（5 × 7.9 mL，共 40 mL）的洗涤缓冲液以 7.0 mL/min 的线性流速对肝素亲和柱进行平衡。</li>
	<li>使用层析系统的样品泵（样品进样口）以 2.0 mL/min 的线性流速将 250 mL 杆状病毒上清液加载到肝素柱上。</li>
	<li>以 2.0 mL/min 的线性流速将 10 倍柱体积（80 mL）的洗涤缓冲液通过肝素柱，直至紫外（UV）吸收曲线（280 nm）恢复至基线并保持稳定。</li>
	<li>以 4.0 mL/min 的线性流速，用 5 倍柱体积（40 mL）的洗脱缓冲液从 7.9 mL 肝素柱中洗脱杆状病毒颗粒。当杆状病毒颗粒从肝素柱上解离时，注意观察色谱图上出现的明显的蛋白质洗脱峰。</li>
	<li>洗脱后，立即将洗脱所得的杆状病毒上清液用 20 mM 磷酸钠水溶液稀释 10 倍，以防止后续离心过程中因渗透压冲击导致杆状病毒颗粒失活。</li>
	<li>保存各组分 100 µL，包括加载杆状病毒上清液时收集的柱流穿液、洗涤缓冲液和洗脱液。将这些杆状病毒组分用于感染 HT1080 细胞，以评估纯化效果（见第 6 节）。</li>
	<li>使用&#160;柱清洗缓冲液和&#160;洗涤缓冲液清洗层析柱。最后，以 7.0 mL/min 的线性流速用 5 倍柱体积&#160;含 20% 乙醇的无菌水冲洗层析柱，并于 4 °C 保存。</li>
	<li>以 50.0 mL/min 的线性流速依次用水、1 N 氢氧化钠、再次用水以及&#160;含 20% 乙醇的水清洗层析系统，并将系统保存在 20% 乙醇中。</li>
</ol>
5. 杆状病毒的浓缩
<ol>
	<li>使用高压灭菌器预先对离心管进行灭菌。在组织培养操作台中，向每根超速离心管中加入等体积的杆状病毒上清液。用天平称量管重，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）调整超速离心管内内容物的重量。</li>
	<li>将每支超速离心管分别放入SW 32 Ti转子相对的吊桶中。</li>
	<li>以 80,000 × g 离心超速离心机 &#215; g 4℃下持续90分钟 &#176;C.</li>
	<li>在组织培养罩内打开超速离心管，无菌条件下吸除液体，保留杆状病毒沉淀。</li>
	<li>用200 μL溶液剧烈吹打重悬各管中的沉淀 &#181;含0.5%（w/vol）BSA的L PBS。</li>
	<li>将浓缩的杆状病毒转移至冻存管中（50 至 100） &#181;每瓶1 L，于-80℃保存 &#176;C.</li>
</ol>
6. 杆状病毒滴度测定
<ol>
	<li>感染前一天，用台盼蓝染色后使用血细胞计数板对 HT1080 细胞进行计数。在 6 孔板中每孔接种 1 × 105 个 HT1080 细胞，每孔加入含 10% 胎牛血清（FBS）的 2 mL 改良杜尔贝科氏伊格尔培养基（DMEM）。额外接种若干孔用于确定感染时细胞的准确数量。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。 
	注意：HT1080 细胞用于滴定，因其表达的硫酸乙酰肝素水平高于其他细胞系16。由于 HT1080 细胞为贴壁细胞，与传统的基于 Sf9 细胞的滴定方法相比，该滴定方法更简便且耗时更短。</li>
	<li>在感染当天，通过计数细胞确定每孔的细胞数量。加入稀释后的原始杆状病毒（即柱层析纯化前预留的样品）以及柱层析过程中的穿流液、洗涤液和洗脱组分样品进行感染。针对每个样品，根据感染性杆状病毒颗粒的数量经验性地确定稀释倍数和体积，并对每孔进行三复孔感染。</li>
	<li>感染两天后，检测目的基因的表达情况。若细胞表达荧光蛋白（例如 GFP）17，可使用流式细胞仪进行分析。</li>
	<li>根据感染时的细胞数量、稀释倍数以及荧光蛋白阳性细胞百分比，使用以下公式计算滴度（每毫升感染单位数）：（感染时细胞数 × 荧光蛋白阳性细胞百分比 × 稀释倍数）/ 加入的杆状病毒体积（mL）。 
	注意：例如，若感染时每孔细胞总数为 1.2 × 105，荧光蛋白阳性细胞百分比为 5%，稀释倍数为 100，加入的稀释杆状病毒体积为 10 µL，则滴度为 6 × 107 感染单位（IU）/mL。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方案介绍了在悬浮培养的Sf9细胞中生产杆状病毒，并利用肝素亲和层析纯化杆状病毒的方法。本方案所采用的参数可最大化提高病毒产量，同时最小化感染性杆状病毒的失活。与已有方法相比，该方案显著提高了杆状病毒颗粒的回收率9。
由于杆状病毒具有广泛的宿主范围和组织嗜性，已有多个研究将其用于中枢神经系统、肝脏、眼睛、卵巢、前列腺和睾丸的基因递送5,6,7,8。含有治疗性基因（如自杀基因、肿瘤抑制基因以及编码肿瘤特异性抗原的基因）的杆状病毒载体已在临床前动物模型中成功应用18,19。尽管杆状病毒能够转导人类细胞，但其仅能在昆虫细胞中增殖，因此不会对人类受体造成风险。...

杆状病毒主要用于在鳞翅目昆虫草地贪夜蛾（Spodoptera fugiperda）Sf9 细胞中，利用重组苜蓿银纹夜蛾多角体病毒（Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV）生产重组蛋白和疫苗1,2,3,4。近年来，它正逐渐成为一种有前景的基因治疗载体5。已知杆状病毒具有广泛的宿主和组织嗜性，可感染静止期和增殖期细胞，无致病性，且不会整合到宿主染色体中4,5,6。此外，杆状病毒可在无血清悬浮培养系统中生产，具有可放大性，并支持封闭式生产工艺，适用于未来的临床级生产1。
杆状病毒颗粒的纯度对于实现高效转导并最大限度降低细胞毒性至关重要7,8,9杆状病毒可通过超速离心或切向流过滤（TFF）进行浓缩，且对其感染性影响有限。然而，这些方法不仅会浓缩病毒颗粒，还会同时浓缩Sf9细胞培养物中的细胞碎片和蛋白质，而这些杂质可能具有毒性 体外 （个人观察）在使用时可能引发炎症或免疫反应 体内为避免此问题，尤其是在使用高浓度病毒储备液时，需要将具有感染性的杆状病毒纯化并从污染颗粒中分离出来。
已有多种方法用于杆状病毒载体的纯化与浓缩10,11,12。在现有方法中，肝素亲和层析可在单步操作中实现高水平纯化，且残留污染物蛋白含量较低12。该方法基于肝素硫酸蛋白多糖被确认为杆状病毒的受体13,14。将Sf9细胞上清液上样至层析柱并使杆状病毒结合后，可用生理（等渗）缓冲液洗涤层析柱，以去除未结合或弱结合的污染物颗粒。由于杆状病毒与肝素的结合是可逆的，因此可用高盐缓冲液将病毒颗粒洗脱，并立即稀释至生理（等渗）盐浓度，以防止因渗透压冲击导致病毒失活12。此外，杆状病毒的生产以及在层析柱上的捕获与洗脱均可在封闭系统中进行，符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的要求。
本文提供了一种利用亲和层析和离心技术制备、纯化及浓缩具有感染性杆状病毒的详细方案。简言之，我们在贴壁培养条件下，通过将杆状病毒质粒DNA转染Sf9细胞来产生杆状病毒，随后在无血清悬浮培养体系中扩增具有感染性的杆状病毒。采用肝素亲和层析法对杆状病毒进行纯化，并以超速离心作为最终步骤，实现对基因治疗应用所需载体的高浓度浓缩。

<table><tbody><tr><td>Akta Avant 150</td><td>GE Healthcare</td><td>28976337</td><td>层析系统</td></tr><tr><td>POROS Heparin 50 &amp;micro;m 色谱柱</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>肝素色谱柱</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman-Coulter</td><td>非目录产品</td><td>高速浓缩病毒</td></tr><tr><td>聚碳酸酯超速离心管</td><td>Beckman-Coulter</td><td>326823</td><td>高速浓缩病毒</td></tr><tr><td>MaxQ 8000 摇床培养箱&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>非目录产品</td><td>用于悬浮培养的摇床</td></tr><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>用于悬浮培养的烧瓶</td></tr><tr><td>1 L 锥形瓶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238072</td><td>用于悬浮培养的烧瓶</td></tr><tr><td>显微镜（Olympus CKX41）</td><td>Olympus</td><td>非目录产品</td><td>细胞观察与计数&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>用于澄清杆状病毒上清液</td></tr><tr><td>50 ml 锥底离心管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>用于收集杆状病毒上清液</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>组织培养处理板</td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>组织培养处理板</td></tr><tr><td>Stericup-HV，0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m，PVDF</td><td>EMD-Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td>过滤装置</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac 载体试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014</td><td>杆状病毒表达系统</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&amp;nbsp; 感受态细胞</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>用于bacmid转化的感受态细胞</td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>自配</td><td>非目录产品</td><td>10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0</td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>用于bacmid纯化</td></tr><tr><td>Sf9 细胞</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>昆虫细胞</td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s 昆虫细胞培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>转染培养基</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20012227</td><td>洗涤细胞、稀释样品</td></tr><tr><td>HyClone SFX-昆虫细胞培养基</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30278.02</td><td>无血清昆虫细胞生长培养基</td></tr><tr><td>苯并核酸酶（Benzonase Nuclease）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>降解DNA和RNA的酶</td></tr><tr><td>杆状病毒质粒（bacmid）DNA</td><td>自配</td><td>非目录产品</td><td>用于杆状病毒生产的bacmid</td></tr><tr><td>Cellfectin II&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>昆虫细胞转染试剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>稳定杆状病毒</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24</td><td>用于杆状病毒储存</td></tr><tr><td>HT1080 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>成纤维细胞系</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>细胞系生长培养基</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td>自配</td><td>非目录产品</td><td>含150 mmol/L氯化钠的20 mmol/L磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td>自配</td><td>非目录产品</td><td>含1.5 mol/L氯化钠的20 mmol/L磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>色谱柱清洗缓冲液</td><td>自配</td><td>非目录产品</td><td>含2.0 mol/L氯化钠的20 mmol/L磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>自配</td><td>非目录产品</td><td>用于Akta Avant系统的清洗</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09137</td><td>用于Akta Avant系统的清洗</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7073</td><td>用于Akta Avant系统的清洗</td></tr></tbody></table>

用于基因治疗应用的杆状病毒生产与纯化

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

杆状病毒传统上被用于重组蛋白和疫苗的生产。然而，近年来，杆状病毒正逐渐成为一种有前景的基因治疗载体。本文中，通过在Sf9贴壁细胞培养物中瞬时转染杆状病毒质粒DNA（bacmid）来产生杆状病毒。随后，在无血清悬浮培养的Sf9细胞中扩增杆状病毒，直至获得所需体积。然后利用肝素亲和层析从培养上清液中纯化病毒。将病毒上清液上样至肝素柱，由于肝素与杆状病毒包膜糖蛋白之间的亲和性，病毒颗粒被吸附在柱上。用缓冲液洗涤柱子以去除杂质，再用高盐缓冲液将杆状病毒从柱上洗脱下来。洗脱液被稀释至等渗盐浓度，随后通过超速离心进一步浓缩杆状病毒颗粒。采用该方法可实现高达500倍的浓缩，且感染性病毒颗粒的回收率可达25%。尽管本方案展示的是从不超过1 L的培养物中生产和纯化杆状病毒的过程，但该方法可在封闭式悬浮培养系统中放大，用于生产适用于基因治疗的临床级载体。

本方案以流程图形式展示（图1）。步骤包括：将杆状病毒DNA瞬时转染Sf9细胞，于培养板中贴壁培养以产生杆状病毒；随后在无血清悬浮培养体系中进行扩增；经核酸酶处理后，通过离心和过滤进行澄清；最后采用肝素亲和层析纯化，并通过超速离心进行浓缩。
解冻后，Sf9 细胞需要至少两周时间恢复并进入指数生长期。在贴壁培养条件下，使用杆状病毒 DNA 转染处于活跃生长状态的 Sf9 细胞。转染两天后，可检测到杆状病毒包膜糖蛋白 gp64 的表达，随后启动杆状病毒的产生11。由于杆状病毒具有复制能力，新产生的病毒会分泌到培养基中并持续感染其他细胞，导致被感染细胞数量逐渐增加。转染后第 5 天，当全部细胞群体均已被感染时，收集含病毒的细胞上清液。该初始病毒上清液被定义为第 1 代（P1）病毒原液。P1 原液用于接种更大培养...

本方案中，通过将杆状病毒质粒瞬时转染至Sf9细胞并在无血清悬浮培养体系中扩增来产生杆状病毒。上清液经肝素亲和层析纯化后，再通过超速离心进一步浓缩。该方案适用于基因治疗应用中杆状病毒的制备与纯化。

杆状病毒传统上被用于重组蛋白和疫苗的生产。然而，近年来，杆状病毒正逐渐成为一种……

本实验方案的总体目标是通过昆虫细胞培养产生杆状病毒，利用肝素亲和层析进行纯化，并通过超速离心进行浓缩。最终产物可用于体内基因转移或作为疫苗。该方法可帮助希望将纯化且浓缩的杆状病毒用于基因治疗研究的科研人员。杆状病毒颗粒可能含有来自Sf9细胞培养物的细胞碎片和蛋白质，这些物质在人体中使用时可能引发炎症或免疫反应。为避免毒性，需对杆状病毒进行纯化，以将其与污染颗粒分离。本实验步骤的某些部分将由本实验室研究助理Marilou Narciso进行演示。进行悬浮培养时，将50毫升Sf9细胞接种于昆虫培养基中，置于250毫升聚碳酸酯锥形瓶内。将锥形瓶放入摇床培养箱中。向细胞中加入2毫升P2杆状病毒原液，在28摄氏度恒温条件下以135转/分钟振荡培养。感染后第四天，整个Sf9细胞群将表现出细胞病变效应，这表明杆状病毒滴度较高。通过在每次后续感染中将细胞培养体积增加10至50倍，逐步扩增杆状病毒，直至获得所需体积。将最终的杆状病毒上清液在4摄氏度、1000g条件下离心30分钟，以去除大量细胞碎片后，将上清液转移至洁净容器中，并在37摄氏度下以每毫升50单位的核酸酶处理2小时，以降解基因组DNA和RNA。最后，使用0.45微米的滤器对病毒上清液进行过滤。通过将洗涤缓冲液管路从A1进样口插入含有至少500毫升洗涤缓冲液的瓶子中，来设置层析系统。使用A2缓冲液进样口加载洗脱缓冲液。将多个50毫升的锥形管插入组分收集器中，用于收集流穿液杆状病毒上清液、洗涤缓冲液以及洗脱的杆状病毒。用五个7.9毫升柱体积的洗涤缓冲液以每分钟7毫升的线性流速平衡肝素柱。使用进样口样品泵以每分钟2毫升的线性流速将250毫升杆状病毒上清液上样至肝素柱中。然后以每分钟2毫升的线性流速，将10个柱体积的洗涤缓冲液通过肝素柱，直至紫外吸收曲线恢复至基线并保持稳定。以每分钟4毫升的线性流速，用5个柱体积的洗脱缓冲液从肝素柱上洗脱杆状病毒颗粒。当杆状病毒颗粒从肝素柱上解离时，注意观察色谱图上出现的明显的蛋白质洗脱峰。洗脱后，立即使用 20 毫摩尔磷酸钠缓冲液将洗脱的杆状病毒上清液稀释 10 倍，以防止在后续离心过程中因渗透压休克导致杆状病毒颗粒被激活。开始浓缩步骤时，将等体积的杆状病毒上清液加入经高压灭菌的超速离心管中。用天平称量离心管重量，并用无菌 PBS 调整超速离心管内内容物的重量。将每个超速离心管放入SW 32 Ti转子相对的离心桶中，在4°C条件下以80,000g离心90分钟。离心结束后，在组织培养罩内打开超速离心管，无菌条件下吸除上清液，保留杆状病毒沉淀。加入200 µL含0.5% BSA的PBS，通过反复吹打充分重悬每个沉淀。最后，将50至100微升浓缩的杆状病毒等分转移至冻存管中，并于负80摄氏度保存。通过感染HT1080细胞来估算杆状病毒滴度。由菱形连接的曲线表示每份样品中杆状病毒的总感染单位。杆状病毒颗粒与肝素柱结合力强，因此在柱洗脱缓冲液中检测不到显著量的病毒。洗脱过程中观察到一个明显的蛋白质峰，对应于杆状病毒组分。本方案所用参数可最大化病毒产量，并将感染性杆状病毒颗粒的失活程度降至最低。该方案可用于纯化其他对肝素具有亲和力的病毒和蛋白质。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

杆状病毒基因治疗应用的生产与纯化

在本视频中，我们演示了使用肝素亲和层析法从昆虫细胞上清液中分离杆状病毒的技术。该分离过程依赖于层析柱中的肝素与杆状病毒包膜糖蛋白之间的亲和性。...

基于肝素亲和层析的杆状病毒纯化：一种从昆虫细胞上清液中分离杆状病毒的技术

蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac...

欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

在本实验方案中，我们展示了一种高效且经济的小规模蛋白质纯化方法，该方法通过独特地结合可切割的GST标签和小型His标签，实现对重组蛋白的纯化。...

GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

Kindlin 家族蛋白在整合素介导的细胞黏附中起着基础性作用，但其研究一直受到在细菌宿主中重组表达困难的限制。本文介绍了利用杆状病毒感染的昆虫细胞高效生产 Kindlin...

高效生产与纯化用于生物物理研究的重组小鼠Kindlin-3蛋白（源自昆虫细胞）

本文介绍了一种利用杆状病毒或哺乳动物表达系统合成病毒样颗粒并结合超速离心纯化的实验方案。该方法具有高度可定制性，可用于以安全且灵活的方式鉴定病毒抗原作为疫苗靶点。...

用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达与纯化

本方案描述了一种热激诱导的蛋白表达系统（pDHsp/V5-His/sf9细胞系统），可用于在昆虫细胞中表达外源蛋白，或评估外源蛋白及其截短氨基酸序列的抗凋亡活性。...

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离子通道的纯化通常具有挑战性，但一旦成功，就有可能使其得以 体外 对通道功能与结构的研究。在此，我们描述了表达与纯化哺乳动物 bestrophin 蛋白（一类 Ca²⁺ 激活的氯离子通道）的逐步操作步骤。2+-激活的 Cl-...

哺乳动物Bestrophin离子通道的表达与纯化

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改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

杆状病毒表达载体系统（BEVS）是一种强大的平台，可用于表达筛选和生产蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs），以用于生化、生物物理和结构研究。对于大多数PRMTs及其他需要真核表达平台的目标蛋白，均可产生毫克级的材料。...

利用杆状病毒表达载体系统生产重组PRMT蛋白

利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发

对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。...

用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

学习利用昆虫细胞培养生产杆状病毒，并通过肝素亲和层析与超速离心进行纯化和浓缩。该方法可去除Sf9细胞培养物中的细胞碎片和蛋白质，避免炎症反应，为基因治疗应用提供高纯度病毒载体。

用于基因治疗应用的杆状病毒生产与纯化

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