用于基因治疗应用的杆状病毒生产与纯化

本实验方案的总体目标是通过昆虫细胞培养产生杆状病毒，利用肝素亲和层析进行纯化，并通过超速离心进行浓缩。最终产物可用于体内基因转移或作为疫苗。该方法可帮助希望将纯化且浓缩的杆状病毒用于基因治疗研究的科研人员。

杆状病毒颗粒可能含有来自Sf9细胞培养物的细胞碎片和蛋白质，这些物质在人体中使用时可能引发炎症或免疫反应。为避免毒性，需对杆状病毒进行纯化，以将其与污染颗粒分离。本实验步骤的某些部分将由本实验室研究助理Marilou Narciso进行演示。

进行悬浮培养时，将50毫升Sf9细胞接种于昆虫培养基中，置于250毫升聚碳酸酯锥形瓶内。将锥形瓶放入摇床培养箱中。向细胞中加入2毫升P2杆状病毒原液，在28摄氏度恒温条件下以135转/分钟振荡培养。

感染后第四天，整个Sf9细胞群将表现出细胞病变效应，这表明杆状病毒滴度较高。通过在每次后续感染中将细胞培养体积增加10至50倍，逐步扩增杆状病毒，直至获得所需体积。将最终的杆状病毒上清液在4摄氏度、1000g条件下离心30分钟，以去除大量细胞碎片后，将上清液转移至洁净容器中，并在37摄氏度下以每毫升50单位的核酸酶处理2小时，以降解基因组DNA和RNA。

最后，使用0.45微米的滤器对病毒上清液进行过滤。通过将洗涤缓冲液管路从A1进样口插入含有至少500毫升洗涤缓冲液的瓶子中，来设置层析系统。使用A2缓冲液进样口加载洗脱缓冲液。

将多个50毫升的锥形管插入组分收集器中，用于收集流穿液杆状病毒上清液、洗涤缓冲液以及洗脱的杆状病毒。用五个7.9毫升柱体积的洗涤缓冲液以每分钟7毫升的线性流速平衡肝素柱。使用进样口样品泵以每分钟2毫升的线性流速将250毫升杆状病毒上清液上样至肝素柱中。

然后以每分钟2毫升的线性流速，将10个柱体积的洗涤缓冲液通过肝素柱，直至紫外吸收曲线恢复至基线并保持稳定。以每分钟4毫升的线性流速，用5个柱体积的洗脱缓冲液从肝素柱上洗脱杆状病毒颗粒。当杆状病毒颗粒从肝素柱上解离时，注意观察色谱图上出现的明显的蛋白质洗脱峰。

洗脱后，立即使用 20 毫摩尔磷酸钠缓冲液将洗脱的杆状病毒上清液稀释 10 倍，以防止在后续离心过程中因渗透压休克导致杆状病毒颗粒被激活。开始浓缩步骤时，将等体积的杆状病毒上清液加入经高压灭菌的超速离心管中。用天平称量离心管重量，并用无菌 PBS 调整超速离心管内内容物的重量。

将每个超速离心管放入SW 32 Ti转子相对的离心桶中，在4°C条件下以80,000g离心90分钟。离心结束后，在组织培养罩内打开超速离心管，无菌条件下吸除上清液，保留杆状病毒沉淀。加入200 µL含0.5% BSA的PBS，通过反复吹打充分重悬每个沉淀。

最后，将50至100微升浓缩的杆状病毒等分转移至冻存管中，并于负80摄氏度保存。通过感染HT1080细胞来估算杆状病毒滴度。由菱形连接的曲线表示每份样品中杆状病毒的总感染单位。

杆状病毒颗粒与肝素柱结合力强，因此在柱洗脱缓冲液中检测不到显著量的病毒。洗脱过程中观察到一个明显的蛋白质峰，对应于杆状病毒组分。本方案所用参数可最大化病毒产量，并将感染性杆状病毒颗粒的失活程度降至最低。

该方案可用于纯化其他对肝素具有亲和力的病毒和蛋白质。