Name: 利用受刺激的排放损耗 (STED) 显微镜可视化肌动蛋白和微管骨架在 B 细胞免疫突触中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 了解如何使用STED超分辨显微镜在B细胞免疫突触处可视化肌动蛋白和微管骨架结构。该方法可同时成像多种细胞骨架蛋白，为研究免疫细胞活化机制提供纳米级分辨率的空间信息。

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感谢不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所（LSI）成像中心对STED显微镜的支持与维护。本研究由加拿大卫生研究院（M.R.G.）资助，项目编号为#68865。感谢日本名古屋大学的Kozo Kaibuchi博士提供CLIP-170-GFP质粒。

所有动物实验程序均经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准。
1. 在 A20 B 淋巴瘤细胞中表达 GFP 融合蛋白
<ol>
	<li>在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）、50 µM 2-巯基乙醇、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、50 U/mL 青霉素和50 µg/mL 链霉素的完全RPMI培养基（RPMI-1640）中，于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中培养A20细胞。</li>
	<li>根据生产商说明书配制转染试剂（参见材料表）。 
	注意：本实验方案已针对材料表中所述的特定试剂和转染程序进行了优化。我们尝试过的其他转染试剂均未能达到足够的转染效率。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。将2.5 × 106个A20细胞（每次转染）在525 × g离心5分钟。用含有1–2.5 µg质粒DNA的100 µL转染试剂重悬细胞。若转染编码CLIP-170-GFP23的DNA，每次转染使用2.5 µg。轻轻混匀。</li>
	<li>将细胞转移至6孔板的一个孔中，并加入预热的完全RPMI培养基调整总体积至2 mL。于37 °C继续培养18小时，以允许蛋白表达。</li>
</ol>
2. 分离原代小鼠B细胞并用LPS激活
<ol>
	<li>按照机构动物护理委员会批准的方案，使用灭菌的手术器械从小鼠体内取出脾脏。</li>
	<li>在组织培养超净台中，将无菌的70 µm细胞筛置于含有3 mL室温无菌PBS的35 mm组织培养皿中。使用5 mL注射器活塞的橡胶部分将脾脏研磨通过细胞筛。</li>
	<li>将获得的单细胞脾细胞悬液转移至无菌的15 mL离心管中，在525 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>使用基于磁珠的B细胞分离试剂盒（见材料表）获得高度富集的B细胞群体。</li>
	<li>将B细胞重悬于完全RPMI培养基中，终浓度为3 × 106/mL，并添加2.5 µg/mL脂多糖（LPS）和5 ng/mL B细胞活化因子（BAFF；一种促存活细胞因子）。</li>
	<li>将细胞在37 °C条件下培养6小时。</li>
</ol>
3. 使用抗 Ig 抗体包被玻璃盖玻片
<ol>
	<li>准备用于包被盖玻片的抗体溶液。将羊抗小鼠Ig抗体原液用室温无菌PBS稀释，配制成12.5 µg/mL的溶液；每个盖玻片需要400 µL抗体溶液。 
	注意：A20细胞使用羊抗小鼠IgG；原代B细胞使用羊抗小鼠IgM。羊IgG抗体与小鼠Fc受体结合较弱。然而，为避免任何潜在的Fc受体结合，可使用抗小鼠IgG或抗小鼠IgM抗体的F(ab)或F(ab')2片段。</li>
	<li>用镊子将一个#1.5规格、直径18 mm的圆形玻璃盖玻片浸入100%甲醇中，然后使其完全干燥（约10分钟）。</li>
	<li>用镊子将干燥后的盖玻片放入12孔组织培养板中，然后加入400 µL浓度为12.5 µg/mL的抗体溶液（共5 µg，2 µg/cm2），使液体在盖玻片中央形成气泡并扩散至边缘。</li>
	<li>注意确保抗体溶液完全覆盖整个盖玻片，但不要让溶液溢出盖玻片边缘而接触组织培养板的塑料表面。室温孵育30分钟。</li>
	<li>通过移液向孔中加入1 mL无菌PBS，随后吸出溶液，清洗盖玻片。重复此步骤两次，以去除未结合的抗体。</li>
	<li>在含有抗体包被盖玻片的孔中加入1 mL无菌PBS，直至准备加入细胞。 
	注意：盖玻片可在室温下保存，用PBS覆盖，当日使用。</li>
</ol>
4. B细胞在抗Ig包被的盖玻片上的扩散
<ol>
	<li>制备改良型 HEPES 缓冲盐溶液（mHBS）：25 mM HEPES（pH 7.2）、125 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM Na2HPO4、0.5 mM MgSO4、1 mg/mL 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和 50 µM 2-巯基乙醇。将该溶液过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
	<li>实验当天，向 50 mL mHBS 中加入 1 mL 热灭活的胎牛血清（FBS），配制成含 2% FBS 的 mHBS（mHBS-FBS）。使用前将 mHBS-FBS 预热至 37 °C。</li>
	<li>将转染后的 A20 细胞或经 BAFF 与 LPS 共同培养的原代 B 细胞在 525 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用 1 mL mHBS-FBS 重悬细胞，使用血细胞计数板计数，并将细胞稀释至 2 × 105 个细胞/mL 的浓度，溶剂为 mHBS-FBS。</li>
	<li>使用镊子将盖玻片从组织培养板转移至一片石蜡膜上。</li>
	<li>向每张盖玻片上加入 250 µL B 细胞悬液（含 5 × 104 个细胞）。</li>
	<li>将盖玻片置于 37 °C 黑暗环境中孵育 15 分钟，使 B 细胞在抗 IgG 包被的表面充分铺展。</li>
</ol>
5. 细胞的固定与免疫染色
<ol>
	<li>通过将16%的多聚甲醛储备液和50%的戊二醛储备液用室温蒸馏水稀释，配制终浓度为3%多聚甲醛和0.1%戊二醛的固定液。固定液需在使用当天配制，多余部分应丢弃。 
	注意：多聚甲醛和戊二醛储备液仅可在化学通风橱中使用。请遵循材料安全数据表（MSDS）中的说明。</li>
	<li>配制通透/封闭缓冲液（含3% BSA和0.1% Triton X-100的PBS溶液）。用滤器过滤除菌后，于4 °C保存。实验当天将所需量恢复至室温。</li>
	<li>配制染色缓冲液（含1% BSA和0.1%皂苷的PBS溶液）。使用0.2 µm滤膜除菌后，于4 °C保存。实验当天将所需量恢复至室温。</li>
	<li>向每张盖玻片上加入350 µL固定液，确保完全覆盖表面。室温避光孵育10分钟。</li>
	<li>用移液器从盖玻片边缘小心吸除固定液。 
	注意：固定液应作为危险化学废物处理。</li>
	<li>用500 µL通透/封闭缓冲液洗涤盖玻片一次，然后吸去液体。</li>
	<li>向每张盖玻片加入250 µL通透/封闭缓冲液，室温避光孵育10分钟，以实现细胞通透和封闭。</li>
	<li>用染色缓冲液将兔抗微管蛋白抗体按1:100比例稀释。</li>
	<li>吸除盖玻片上的通透/封闭缓冲液，每张盖玻片加入50 µL稀释后的抗微管蛋白抗体溶液。室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>通过将Alexa Fluor 532标记的山羊抗兔IgG二抗和Alexa Fluor 568标记的鬼笔环肽均按1:100比例加入染色缓冲液中，配制二抗/肌动蛋白染色液。</li>
	<li>加入500 µL染色缓冲液，洗涤盖玻片三次以去除未结合的一抗，每次均吸除液体。</li>
	<li>向每张盖玻片加入50 µL二抗/肌动蛋白染色液，室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>加入500 µL染色缓冲液，洗涤盖玻片三次以去除未结合的二抗，每次均吸除液体。</li>
	<li>在载玻片上加入10 µL封片剂。将盖玻片细胞面朝下封于载玻片上。 
	注：强烈推荐使用&#34;抗荧光淬灭&#34;封片介质（参见材料表），以保持GFP融合蛋白的荧光强度。避免使用含DAPI的封片剂，因其在使用STED激光时可能干扰荧光染料的成像。</li>
	<li>将载玻片置于避光环境中过夜干燥。次日进行成像。 
	注：强烈建议在盖玻片干燥后立即成像，因为GFP荧光会随时间逐渐减弱。</li>
</ol>
6. 使用 STED 显微镜进行成像
注意：请注意，以下所述的所有软件操作步骤均针对我们所使用的显微镜及软件（参见材料表）。若使用不同的显微镜或软件进行成像，则需要对操作步骤和设置进行相应调整。
<ol>
	<li>开启STED显微镜，启动激光器和落射荧光照明灯，并启动显微镜软件。</li>
	<li>设置STED耗尽激光的参数。 
	注意：具体设置取决于所使用的显微镜型号及其配备的激光器。一些推荐设置为白光激光（WLL）70%；592 nm激光80%；660 nm激光80%。</li>
	<li>激活STED设置，并使用100倍物镜对准STED激光光束。</li>
	<li>通过目镜聚焦样品，并选择一个GFP表达水平适中的细胞。 
	注意：GFP表达水平过低将无法观察到信号，因为STED会降低发射强度；相反，CLIP-170-GFP的高表达会诱导形成大的簇状结构，这不能真实反映微管正端蛋白复合物的正常形态和分布。选择GFP表达适中的细胞对于准确成像抗原接触位点的细胞骨架结构至关重要。</li>
	<li>放大至选定细胞，并选择待成像的兴趣区域。调整焦距，使B细胞最靠近盖玻片的x-y平面处于焦点位置。
	<ol>
		<li>具体操作为：逐步将物镜向盖玻片靠近，直至B细胞的细胞骨架结构进入焦点后再失焦；然后缓慢将物镜向相反方向移动，直到B细胞的细胞骨架结构首次重新进入焦点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化设置，包括激光功率、激发光束和探测器范围。首先采用制造商推荐的设置，然后根据需要进行调整，以优化样品的信号。所有需相互比较的样品应在相同设置下成像。</li>
	<li>在软件的&#34;采集&#34;选项卡中，于左下角的&#34;顺序扫描&#34;面板中勾选&#34;帧间&#34;选项，将图像采集设置为逐帧顺序采集。</li>
	<li>设置采集顺序。 
	注意：我们优先采集GFP荧光信号，以避免GFP信号降解。 
	根据除GFP外所使用的荧光染料组合，先采集长波长荧光信号可能获得更佳结果。然而，应优化各荧光染料或荧光蛋白的受激辐射耗尽及成像顺序，以获得最强的荧光信号和最佳分辨率。</li>
	<li>在软件的&#34;采集&#34;选项卡中，为每种荧光染料选择并设置相应的STED激光功率，并使用592 nm或660 nm STED激光的滑动条调节激光功率。为GFP和Alexa Fluor 532调节592 nm耗尽激光的功率，为Alexa Fluor 568调节660 nm耗尽激光的功率。</li>
	<li>为提高分辨率并降低背景信号，请进入软件&#34;采集&#34;选项卡下的&#34;采集&#34;设置，通过下拉菜单为每项选择大于1的数值，增加扫描线平均或帧平均。</li>
	<li>此外，可在&#34;采集&#34;选项卡中勾选对应荧光染料的时间门控选项，并设定时间门控参数（见下文注释），以实现时间门控STED成像。提高STED激光功率可增强分辨率，但也会加剧荧光染料的光漂白。 
	注意：时间门控参数需根据所用显微镜、样品和荧光染料进行优化，建议门控时间为0.3至6 ns。固定后的GFP对高激光功率特别敏感。为减少GFP的光漂白，应使用时间门控并降低STED激光功率。</li>
	<li>如需采集三维STED图像，请使用滑动条将点扩散函数（PSF）更改为&#34;3D STED&#34;。</li>
	<li>手动采集多幅图像以确保可重复性。使用去卷积软件包对图像进行去卷积处理（见图1）41（参见材料表）。</li>
</ol>

<ol><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360(2011).</li>
<li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li>
<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+B+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li>
<li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+who%2C+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts%3A+Synapses+and+Kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Self+Nonself%22%5BJournal%5D)">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li>
<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311(2010).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873(2009).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunter+to+gatherer+and+back%3A+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+B+cells+capture%2C+process+and+present+antigens%3A+a+crucial+role+for+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li>
<li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk%3A+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li>
<li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li>
<li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li>
<li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li>
<li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+organization+and+dynamics%3A+two+ends+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%2BTIPs+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li>
<li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li>
<li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li>
<li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li>
<li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li>
<li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Lymphocyte+Migration%3A+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586(2015).</li>
<li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap+GTPases+regulate+the+migration%2C+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li>
<li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology%2C+immune-synapse+formation%2C+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li>
<li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion%2C+cell+spreading%2C+actin+polymerization%2C+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li>
<li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li>
<li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li>
<li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li>
<li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li>
<li>Yuseff, M. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuss%2C+JC+%22The+Image+Processing+Handbook%2C+Sixth+Edition%22">The Image Processing Handbook, Sixth Edition</a>. , CRC Press. (2011).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li>
<li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

利用STED超分辨率显微镜可以获得细胞骨架结构的详细图像，其理论分辨率可达50 nm，而传统共聚焦显微镜受衍射极限限制，分辨率约为200 nm24。通过使用去卷积软件，从观测到的&#34;模糊&#34;荧光信号中计算原始光源最可能的位置，可进一步增强对细微结构的分辨能力。本实验方案描述了使用STED技术对肌动蛋白和微管细胞骨架以及与细胞骨架相关蛋白进行成像的方法。
B细胞活化会诱导肌动蛋白细胞骨架和微管网络的重塑，这两种细胞骨架的协调调控对于免疫突触的形成具有重要意义17,42。本文所介绍的方法已优化用于在抗原接触位点处通过多色STED显微技术同时成像肌动蛋白和微管细胞骨架，但也同样适用于单色STED成像。我们此前关于B细胞细胞骨架的研究表明，STED显微技术能够为细胞结构的组织方式及其相互作用机制提供新的见解。利用共聚焦显微镜和全内反射荧光（TIRF）显微镜，我们曾观察到微管与抗原接触位点边缘的F-肌动蛋白环发生接触...

当B细胞结合到极化的抗原阵列时（例如，呈现在抗原呈递细胞（APCs）表面），由此产生的B细胞受体（BCR）信号转导可驱动经典免疫突触结构的形成，该结构最初是在T细胞中被描述的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13最初，在B细胞与抗原呈递细胞（APC）接触部位的边缘形成抗原结合的BCR微簇。这些微簇随后向抗原接触区域的中心移动，并在中心融合形成中央超分子激活簇（cSMAC），构成免疫突触的核心。免疫突触的形成可优化BCR信号传导，并促进BCR介导的抗原从APC膜上的摄取14这种抗原获取过程随后会通过BCR介导的抗原内化及后续的抗原加工，使B细胞能够向T细胞呈递肽:MHC II复合物，从而激发T细胞的辅助作用14由于免疫突触的形成可促进B细胞活化，阐明建立这种受体功能排列模式的机制，有助于深入理解体液免疫应答的启动与调控过程。
肌动蛋白和微管细胞骨架的重组对于免疫突触的形成至关重要。由空间极性排列的抗原刺激产生的局部BCR信号转导，可诱导肌动蛋白细胞骨架发生快速而显著的重塑1,15。在B细胞边缘形成的树突状肌动蛋白结构对质膜施加推动力，促进B细胞的铺展。这使得B细胞能够扫描更大面积的抗原承载表面，增加结合抗原并激活BCR信号通路的BCR数量。与此同时，微管组织中心（MTOC）和微管网络会重新定向至抗原接触位点。当MTOC接近抗原接触区域时，从MTOC发出的微管沿着B细胞与抗原承载表面之间界面处的质膜内侧延伸16,17。这些靠近膜的微管可作为动力蛋白介导的抗原结合BCR微簇向中心运动的轨道18，从而形成中心超分子活化簇（cSMAC）。
MTOC向免疫突触的重新定向和极化需要完整的肌动蛋白和微管细胞骨架，并且通常依赖于皮层肌动蛋白网络与微管之间的相互作用16,17,19,20。皮层肌动蛋白结合蛋白（如IQGAP1）可通过与修饰微管正端的蛋白复合物相互作用来捕获微管21。这些动态的正端结合蛋白复合物包括EB1和CLIP-170，它们统称为微管正端追踪蛋白（+TIPs）21,22。位于微管末端的+TIPs能够结合与质膜或皮层肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白，从而使力生成机制（例如，锚定于皮层的驱动蛋白沿微管向负端移动）对微管施加拉力，进而重新定位MTOC。CLIP-170可与肌动蛋白相关支架蛋白IQGAP1结合23，我们已证明这两种蛋白对于BCR诱导的MTOC向免疫突触极化均是必需的17。IQGAP1与CLIP-170之间的这种相互作用可能在协调B细胞免疫突触处肌动蛋白细胞骨架重塑与微管网络重定位过程中发挥关键作用。
传统的荧光显微镜已揭示了B细胞免疫突触形成过程中肌动蛋白和微管细胞骨架的显著重组2。然而，由于光的衍射极限，该方法无法对微小的细胞结构进行精细分辨。根据阿贝定律（Abbe's law），衍射极限取决于用于照明样品的光的波长以及物镜的孔径24。这一衍射极限使传统光学显微镜的横向分辨率被限制在200–300 nm，轴向分辨率被限制在500–700 nm25。因此，更小的亚细胞结构以及肌动蛋白和微管细胞骨架的精细结构细节只能通过电子显微镜进行观察。细胞骨架的电子显微镜成像耗时较长，需要使用强烈的样品固定和制备流程，这些步骤可能改变生物结构，并且仅限于抗体介导的检测。荧光显微镜则具有可进行免疫荧光标记并同时成像多种蛋白质或细胞结构的显著优势。此外，在细胞中表达荧光融合蛋白可实现对动态过程的实时成像，尤其在缺乏针对目标蛋白的有效免疫荧光抗体时尤为有用。
近年来，超分辨率显微技术的进步已突破了光的衍射极限，使得纳米级细胞结构的可视化成为可能24。其中一种超分辨率显微技术称为受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）显微术。STED 使用两束激光，一束激光激发荧光分子，另一束呈环形（“甜甜圈”状）分布的激光则选择性地抑制荧光分子周围区域的荧光发射。这种方法缩小了单个荧光颗粒的点扩散函数（即表观面积），从而获得突破衍射极限的荧光图像25,26。基态耗尽显微术也采用基于荧光的技术来获取超分辨率图像。然而，该方法的图像采集与重建时间较长，可用的荧光分子种类有限，且由于维持肌动蛋白和微管结构需要不同的固定程序，因此同时对多种细胞骨架组分进行高分辨率成像在技术上具有挑战性。因此，相较于电子显微镜及其他超分辨率显微技术，STED 具有多项优势：它能够快速采集图像，几乎无需复杂的后期处理，并且使用与常规荧光显微术相同的荧光分子和染色方法，适用于固定样品的观察26。
目前，超分辨率显微镜已用于可视化自然杀伤（NK）细胞和T细胞免疫突触中的肌动蛋白结构26,27,28,29,30,31。然而，微管细胞骨架的超分辨率成像，以及在免疫突触形成过程中肌动蛋白与微管细胞骨架的协调性重组，直到最近才被报道17。我们采用STED显微镜对B细胞进行成像，这些B细胞被允许在涂有抗免疫球蛋白（anti-Ig）抗体的盖玻片上铺展，以刺激BCR信号传导并启动细胞骨架的重组。当接种于固定的anti-Ig抗体上时，B细胞会发生显著的依赖肌动蛋白的铺展，这一过程重现了免疫突触形成初期的关键事件。重要的是，STED显微镜揭示了在免疫突触边缘形成的F-肌动蛋白树突状环的精细结构，并显示微管组织中心（MTOC）以及与其相连的微管已移至抗原接触位点附近17。这些微管向外延伸，指向F-肌动蛋白的周边环状结构。此外，对F-肌动蛋白、微管蛋白、IQGAP1以及GFP标记的CLIP-170 +TIPs等多种组合进行多色STED成像表明，由CLIP-170-GFP标记的微管正端与周边的肌动蛋白网状结构以及皮层捕获蛋白IQGAP1密切相关17。
本文介绍了一种利用受激辐射损耗（STED）显微镜对免疫突触处的肌动蛋白和微管细胞骨架进行成像的详细实验方案。这些方法已使用A20小鼠B细胞系进行了优化，该细胞系已被广泛用于研究BCR信号传导及免疫突触的形成17,32,33,34,35,36,37,38,39。由于商用CLIP-170抗体在先前实验中免疫染色效果不佳，我们在此详细描述了在A20细胞中表达GFP标记的CLIP-170的方法，并提供了可同时可视化最多三种细胞骨架组分或细胞骨架相关蛋白的染色方案。此前已有研究描述了利用STED显微镜对NK细胞免疫突触处肌动蛋白进行成像的方法40。本文进一步拓展该技术，实现了对B细胞中肌动蛋白和微管细胞骨架的多色超分辨率成像。
超分辨率显微镜的一个关键考虑因素是采用适当的固定程序，以维持细胞结构并防止荧光蛋白受损。本文所述的固定和染色方法经过优化，可保留GFP荧光，并实现对肌动蛋白和微管网络的高分辨率成像。在表达荧光蛋白时应注意，B细胞通常较难转染。使用本方案时，通常有20–50%的A20细胞表达转染的GFP融合蛋白，且在该群体中蛋白表达水平存在差异。尽管如此，采用我们描述的方法对肌动蛋白和微管进行超分辨率成像结果稳定可靠，可轻松获得高质量图像。尽管相对于A20细胞体积较小，但我们证明这些方法也可用于对经脂多糖（LPS）短暂激活的原代B细胞中的微管网络进行成像。我们已表明，LPS激活的原代B细胞可通过siRNA转染实现相对较高的敲低效率（即可通过免疫印迹检测到蛋白水平下降），使其成为某些研究中替代B细胞系的良好选择17。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 小鼠 B 淋巴瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>源自 Balb/c 小鼠的 B 细胞淋巴瘤，其表面表达含 IgG 的 B 细胞受体（BCR）</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;R0883</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 水浴 30 分钟灭活</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>液体，10,000 单位</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;原代 B 细胞附加材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>基于磁珠的 B 细胞分离试剂盒</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep 小鼠 B 细胞分离试剂盒</td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>来自 &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;0111:B4 的 LPS</td></tr><tr><td>B 细胞活化因子（BAFF）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;转染&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>编码 CLIP-170-GFP 的质粒</td><td></td><td></td><td>由日本名古屋大学 Kozo Kaibuchi 博士惠赠；参见 Fukata &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;，《&lt;strong&gt;细胞&lt;/strong&gt;》109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;推荐的转染试剂与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa 核转染试剂盒 V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>按照生产商说明将转染试剂与 DNA 混合</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector 2b 型仪器</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>使用程序 L-013</td></tr><tr><td>Falcon 6 孔板，TC 处理，无菌</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;包被盖玻片&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm 直径圆形 #1.5 盖玻片</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>类似产品：Marienfield-Superior 目录号 #117580</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>解剖用超细尖镊</td></tr><tr><td>Falcon 12 孔无菌聚苯乙烯组织培养板</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100% 甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>无钙镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>用于 A20 细胞</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgM 抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>用于原代小鼠 B 细胞</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（16% 储存液）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>用 PBS 稀释至工作浓度</td></tr><tr><td>戊二醛（50% 储存液）</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>用 PBS 稀释至工作浓度</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第五组分</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>兔抗微管蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>推荐 1:250 稀释，但应优化</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532 标记的山羊抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>推荐 1:100 稀释，但应优化</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 标记的鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>推荐 1:100 稀释，但应优化</td></tr><tr><td>Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>不含 DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens 去卷积软件</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td>参见 https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

使用受激发射损耗（sted）显微镜对b细胞免疫突触中的肌动蛋白与微管细胞骨架进行可视化观察

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

结合膜结合抗原的B细胞（例如抗原呈递细胞表面的抗原与B细胞受体（BCR）相互作用，形成免疫突触——一种优化BCR信号传导及BCR介导的抗原摄取的特化细胞结构。免疫突触的形成依赖于肌动蛋白细胞骨架的重塑以及微管网络向抗原接触位点的重定向。肌动蛋白细胞骨架重塑为致密的外周F-actin环结构，同时伴随着微管组织中心向免疫突触的极化。微管正端结合蛋白以及皮层正端捕获蛋白介导了肌动蛋白与微管细胞骨架之间的物理相互作用，从而使二者得以协调重组。阐明调控这种细胞骨架重排的分子机制，并理解这些细胞骨架结构如何影响免疫突触的形成和BCR信号传导，将为B细胞活化提供新的认识。超分辨显微成像技术的发展为此类研究提供了有力支持，能够揭示细胞骨架网络组织的新细节。本文介绍了一种利用受激发射损耗（STED）显微镜同时对B细胞中的肌动蛋白结构、微管以及转染表达的GFP标记微管正端结合蛋白进行成像的方法。为模拟免疫突触形成的早期事件，我们将B细胞铺展于包被抗免疫球蛋白（anti-Ig）抗体的盖玻片上，以启动BCR信号传导和细胞骨架重塑。本文提供了在A20 B淋巴瘤细胞中表达GFP融合蛋白、诱导anti-Ig介导的细胞铺展、以及后续的细胞固定、免疫染色、图像采集和图像去卷积等步骤的详细实验方案。通过该方法获得的高分辨率图像可同时显示肌动蛋白结构、微管以及可能连接这两种细胞骨架网络的微管正端结合蛋白。

对于在固定化抗Ig上铺展的B细胞，联合使用STED显微镜与去卷积软件可比共聚焦显微镜提供更高分辨率的细胞骨架结构图像。这一点在图1中尤为明显，其中使用上述方案对F-actin网络进行了可视化。同一标本的共聚焦与STED超分辨率图像对比显示，STED图像分辨率更高，能够揭示肌动蛋白细胞骨架更精细的结构（图1）。该图还表明，去卷积对于获得高质量的STED图像至关重要，在这些图像中肌动蛋白丝的轮廓更加清晰。尽管共聚焦图像的去卷积已显著提升了图像分辨率，但去卷积后的STED图像仍比去卷积后的共聚焦图像提供更详细的结构信息。特别是，周边F-actin环的树状结构在STED显微镜下呈现得更为清晰（图1和图2）。使用上述样品制备和成像方案，也在抗原接触位点对微管网络进行了成像（图3）。微管从...

我们介绍了一种利用STED显微镜同时成像B细胞中肌动蛋白结构、微管以及微管正端结合蛋白的实验方案。该B细胞模型通过在覆盖有B细胞受体抗体的盖玻片上铺展，模拟免疫突触形成的初始阶段。

使用受激发射损耗（STED）显微镜对B细胞免疫突触中的肌动蛋白与微管细胞骨架进行可视化观察

与膜结合抗原（例如，抗原呈递细胞表面的抗原）结合的B细胞会形成免疫突触，一种特化的细胞结构……

本实验方案的总体目标是对B细胞免疫突触中的肌动蛋白和微管细胞骨架进行染色，用于受激发射损耗（STED）显微镜观察，以成像其结构及空间关系中的组织形式。该方法有助于解答关于B细胞活化过程中细胞骨架组织的关键问题，包括免疫突触形成期间肌动蛋白和微管细胞骨架的重组过程。多色STED显微镜的主要优势在于，能够在纳米级分辨率下同时成像肌动蛋白细胞骨架、微管网络以及关键的细胞骨架相关蛋白。尽管该方法可为B细胞活化提供研究线索，但也适用于其他免疫细胞类型（如自然杀伤细胞和T细胞）的免疫突触形成研究。通常，初次使用该方法的研究人员会发现，针对STED技术中同时成像和多荧光标记优化显微镜设置需要一定练习。与Jia和Madison一同演示该实验操作的还有Kate Choi和Caitlin Pritchard。首先，将每转染样本 2.5 × 10⁶ 个 A20 B 淋巴瘤细胞离心，然后将细胞重悬于 100 µL 转染试剂中，该试剂中添加了 1 至 2.5 µg 目标质粒 DNA。轻轻混匀溶液，并将每份细胞等分转移至 6 孔板的各个孔中。用 37 °C 完全培养基将每孔体积调整至 2 mL，然后将细胞置于 37 °C 培养箱中培养 18 小时。第二天早上，将1.5个18毫米圆形玻璃盖玻片浸入100%甲醇中，然后让盖玻片完全干燥约10分钟。将干燥后的盖玻片分别放入12孔组织培养板的各个孔中，并在每片盖玻片中央加入400 µL羊抗小鼠免疫球蛋白G抗体，使气泡在中央形成并扩散至边缘，且不滴入孔内。将盖玻片在室温下孵育30分钟。然后用每孔1毫升无菌PBS洗涤盖玻片，共洗涤三次，以去除未结合的抗体。最后一次洗涤后，将每张盖玻片保存在1毫升新鲜无菌PBS中，直至进行细胞接种。当转染的细胞准备就绪后，通过离心将细胞收集至15毫升锥形管中，并将沉淀重悬于1毫升含FBS的改良HEPES缓冲盐溶液中。计数后，将细胞用含FBS的改良HEPES缓冲盐溶液稀释至每毫升2×10⁵个细胞的浓度，并用镊子将每张盖玻片转移至一片石蜡膜上。每张盖玻片上加入250 µL细胞悬液，在37°C避光孵育15分钟，使细胞在抗免疫球蛋白G包被的表面充分铺展。孵育结束后，移除每张玻片上的多余盐溶液，并在每张盖玻片上加入350 µL固定剂，确保完全覆盖整个表面。室温避光孵育10分钟后，使用微量移液器从每个盖玻片边缘小心吸去固定液，并用500 µL通透与封闭缓冲液洗涤盖玻片。随后，加入250 µL新鲜的通透与封闭缓冲液，室温避光处理10分钟，对细胞进行通透和封闭。接着，去除多余的缓冲液，并加入50 µL目标一抗，在室温避光条件下孵育30分钟，对细胞进行标记。孵育结束后，每次用500 µL染色缓冲液洗涤盖玻片，共洗涤三次，然后在每张盖玻片上加入50 µL相应的二抗，室温孵育30分钟。洗涤去除二抗后，向一张显微镜载玻片上加入10 µL封片试剂，将盖玻片细胞面朝下封于单独的载玻片上。随后将载玻片置于暗处过夜干燥，以备次日成像。为了使用 STED 显微镜对细胞进行成像，首先打开 STED 显微镜。启动落射荧光照明灯中的激光器，并打开显微镜软件。设置 STED 耗尽激光器的参数，并将第一个样品载入显微镜。使用目镜手动对样本进行聚焦，选择一个GFP表达水平适中的细胞。放大选定的细胞，并选择待成像的感兴趣区域。调节焦距，使最接近盖玻片的细胞XY平面处于清晰对焦状态。然后，在软件的“采集”选项卡中，于“顺序扫描”面板内勾选“帧间扫描”选项，以将图像采集模式设置为逐帧顺序采集。针对每种荧光染料设置STED激光功率，并使用滑动条根据实验中所用的荧光染料调整各激光功率。为提高分辨率并降低背景信号，打开采集设置，通过下拉菜单选择大于1的数值，以增加扫描线平均和/或帧平均。针对每种荧光染料，检查其增益选项及时间门控STED对应的具体增益时间值，以获得适当的荧光信号，并提高STED激光功率以增强分辨率。必须针对显微镜样品及所用荧光染料优化采集时间增益，以在不显著损失荧光信号的前提下提升分辨率。随后手动采集多幅图像以确保可重复性，并根据制造商说明，使用去卷积软件对图像进行去卷积处理。对于A20 B淋巴瘤细胞，使其在固定的NT免疫球蛋白抗体上铺展。联合使用STED显微镜与去卷积软件，可比单独使用共聚焦显微镜获得更高分辨率的细胞骨架结构图像。尽管对共聚焦图像进行去卷积处理能显著提高图像分辨率，但去卷积后的STED图像比去卷积后的共聚焦图像提供更详细的结构信息。单色STED也可用于获取整个B细胞细胞骨架网络的三维超分辨率图像。在这些多色STED图像中，可同时观察到树突状肌动蛋白外周环的染色与微管的染色。当使用转染了荧光融合蛋白的细胞时，需重点考虑达到最佳表达水平并避免因过表达而产生的伪影，而荧光融合蛋白表达过低同样会导致图像质量不佳。仔细调焦以包含整个目标区域也至关重要。例如，在此图像中，微管网络的仅有部分位于最接近盖玻片的焦平面上，从而无法对样品进行完整分析。一旦掌握，该技术可在两天内完成。样品制备与染色需一天，STED成像另需一天。需要注意的是，应优化用于转染细胞的质粒用量，以确保荧光蛋白表达量适中，既能满足成像检测需求，又可避免因过表达导致的假象。通过该实验流程，可诱导表达不同的荧光融合蛋白，从而有助于定位调控细胞骨架动态与结构的其他蛋白，或用于观察参与其他细胞过程的蛋白的亚细胞分布情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用受激辐射损耗显微镜（STED显微镜）对参与免疫突触形成的细胞骨架结构及相关蛋白进行成像。请务必注意，使用戊二醛等固定剂时具有极高的危险性，操作此类试剂时必须采取预防措施，例如在化学通风橱中进行操作。

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科研

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免疫学与感染

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