Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

该程序的总体目标是生成胎盘绒毛树碎片的 3D 渲染，适用于分析其包含的血管网络。这种方法可以帮助我们回答我们领域中的关键问题，例如为什么孩子可能会生长受限，或者是什么压力以及导致早产的压力可能有多严重。我们程序的主要优点是，我们现在能够免疫标记透明的胎盘绒毛树组织，然后可视化它们的血管网络，并使用这些可视化来表征和分析这些血管网络。

这项技术的影响可以扩展到许多诊断和治疗，因为大多数生命科学都依赖于二维组织学特征。Valerie Schwenk 女士将演示该程序，她将进行胎盘组织的免疫标记和透明化，然后 Phillip Necaise 先生将进行胎盘组织的解剖，并进行组织的反向透明化。为了准备解剖绒毛树，首先用磷酸盐缓冲盐水冲洗正式和固定的胎盘组织。

然后放在解剖显微镜载物台上的培养皿中。要找到绒毛树，请使用手术刀和细镊子将胎盘组织撕开。然后，解剖大约 5 毫米长的绒毛树的碎片，并转移到含有 1 毫升磷酸盐缓冲盐水的微管中。

用新的盐水替换磷酸盐缓冲盐水，等待 10 分钟，偶尔旋转。然后，用透化缓冲液替换磷酸盐缓冲盐水，以透化组织并阻断二抗的非特异性结合。然后，孵育 30 分钟。

然后，用含有 2% 山羊血清的磷酸盐缓冲盐水替换透化缓冲液，该盐水含有小鼠单克隆抗 CD31 和兔抗 CK7。将组织在 4 摄氏度下放置过夜。第二天，用含 2% 山羊血清的磷酸盐缓冲盐水额外洗涤以去除剩余的抗体。

然后，去除含有 2% 山羊血清的磷酸盐缓冲盐水，加入相同的缓冲液，补充山羊抗小鼠免疫球蛋白 G 偶联绿色荧光团和山羊抗兔免疫球蛋白 G 偶联红外荧光团。在室温下避光孵育 30 分钟。然后，用 PBS-GS 洗涤组织一次，并将标记的组织在室温下避光保存直至清除。

用 PBS 洗涤样品 3 次，间隔 10 分钟。要使组织脱水，请去除磷酸盐缓冲盐水，向组织中加入 50% 乙醇并孵育 10 分钟。孵育后，弃去，随后用 70% 乙醇洗涤 3 次，间隔 10 分钟，然后用 100% 乙醇洗涤 3 次，间隔 15 分钟。

然后，使用细尖镊子将组织转移到装有 1 毫升溶液 1 的微管中，持续 4 小时。4 小时后，将组织转移至装有溶液 2 的微管中，再孵育 4 小时。要将组织安装在 Sykes-Moore 腔室中，请使用细尖镊子将 25 毫米圆形盖玻片放置在腔室底座上。

同样，使用细尖镊子在盖玻片的底座上放置橡胶垫圈。取出浸入溶液 2 中的组织，并将其放在盖玻片的中心。然后，在组织上加入一滴溶液 2，大约 40 微升。

然后，取第二个盖玻片并将其放在垫圈顶部。然后，通过将锁定环拧入底座顶部，将盖玻片和垫圈牢牢压缩。然后，将 25 号针头穿过垫圈插入底座上的端口。

接下来，将 1 点 5 毫升溶液 2 填充到 3 毫升注射器中。然后，将 25 号针头安装在注射器上，并通过垫圈将针头插入对面的端口。然后，开始用溶液 2 注入腔室，并检查腔室内的空气是否通过另一个 25 号针头排出。

当腔室装满时，取出针头和注射器，并将 Sykes-Moore 腔室支架放在共聚焦显微镜载物台上。使用 10 倍物镜聚焦放置在腔室上的组织。接下来，为载物台设置一个参考点，并在焦平面上上下移动显微镜载物台，以识别和设置组织的顶部和底部。

将步长设置为 2 点 5 微米，并收集一个共聚焦图像文件，其中包含一组从上到下的组织图像。然后，将组织转移到含有 20 倍以上体积的 100% 乙醇的微管中，以逆转清除。然后，每隔一小时更换一次，更换为 70，然后更换为 50% 乙醇，最后更换磷酸盐缓冲盐水。

在 4 摄氏度下避光储存直至包埋。在这里，为了显示胎盘血管网络，已经获得了人类胎盘的显微和共聚焦显微图像。这些胎盘的显微图像显示了穿透胎盘薄壁组织的辐射绒毛树。

这些显微镜图像显示存在终止于绒毛簇中的绒毛树片的远端部分。接下来，为了显示绒毛的滋养层，对绒毛树的远端部分进行免疫标记。在图像中，外滋养层显示为绿色，毛细管显示为红色。

然后，为了在清除前后检查胎盘组织，获取未清除和清除胎盘组织的共聚焦图像。图像显示，对于未清除的组织，可以在组织深度 100 微米或更小的地方捕获免疫荧光。相反，对于透明的胎盘组织，免疫荧光可以在更高的深度捕获。

此外，为了将常规组织与反向透明切片进行比较，用乙醇以相反的过程将透明化的组织脱水。透明化前后用抗 CK7 对胎盘组织进行免疫组织化学染色表明，由于透明化，组织形态没有显着改变。动画显示免疫染色的绒毛组织沿组织体积的整个深度分布。

一旦您熟悉了该程序，您可以预计大约需要 18 小时，分为三天。在尝试执行此过程时，请务必记住它需要几种不同的技能。需要能够进行胎盘病理学、共聚焦显微镜检查。

您需要能够生成成像的 3D 渲染，并且需要能够熟悉免疫处理和分析。按照此程序，可以进行其他方法，如传统组织学、STS 页面或 maldi。随着它的发展，这项技术为母胎医学、新生儿学和滋养层生物学领域铺平了道路，以探索先兆子痫、胎儿生长不良和胎儿窘迫的根本原因。

观看此视频后，您应该对如何清除、渲染和分析胎盘绒毛树组织有很好的了解。非常感谢您观看视频，祝您的实验好运。