Immunolabeled, 澄清人胎盘长柔毛血管网络的三维渲染与分析
March 29th, 2018
本研究提出了一种可逆转组织清除、染色、3 d 渲染和分析人胎盘绒毛样品中血管网络的方法, 其顺序为 1-2 毫米3。
该程序的总体目标是生成胎盘绒毛树碎片的 3D 渲染，适用于分析其包含的血管网络。这种方法可以帮助我们回答我们领域中的关键问题，例如为什么孩子可能会生长受限，或者是什么压力以及导致早产的压力可能有多严重。我们程序的主要优点是，我们现在能够免疫标记透明的胎盘绒毛树组织，然后可视化它们的血管网络，并使用这些可视化来表征和分析这些血管网络。
这项技术的影响可以扩展到许多诊断和治疗，因为大多数生命科学都依赖于二维组织学特征。Valerie Schwenk 女士将演示该程序，她将进行胎盘组织的免疫标记和透明化，然后 Phillip Necaise 先生将进行胎盘组织的解剖，并进行组织的反向透明化。为了准备解剖绒毛树，首先用磷酸盐缓冲盐水冲洗正式和固定的胎盘组织。
然后放在解剖显微镜载物台上的培养皿中。要找到绒毛树，请使用手术刀和细镊子将胎盘组织撕开。然后，解剖大约 5 毫米长的绒毛树的碎片，并转移到含有 1 毫升磷酸盐缓冲盐水的微管中。
用新的盐水替换磷酸盐缓冲盐水，等待 10 分钟，偶尔旋转。然后，用透化缓冲液替换磷酸盐缓冲盐水，以透化组织并阻断二抗的非特异性结合。然后，孵育 30 分钟。
然后，用含有 2% 山羊血清的磷酸盐缓冲盐水替换透化缓冲液，该盐水含有小鼠单克隆抗 CD31 和兔抗 CK7。将组织在 4 摄氏度下放置过夜。第二天，用含 2% 山羊血清的磷酸盐缓冲盐水额外洗涤以去除剩余的抗体。
然后，去除含有 2% 山羊血清的磷酸盐缓冲盐水，加入相同的缓冲液，补充山羊抗小鼠免疫球蛋白 G 偶联绿色荧光团和山羊抗兔免疫球蛋白 G 偶联红外荧光团。在室温下避光孵育 30 分钟。然后，用 PBS-GS 洗涤组织一次，并将标记的组织在室温下避光保存直至清除。
用 PBS 洗涤样品 3 次，间隔 10 分钟。要使组织脱水，请去除磷酸盐缓冲盐水，向组织中加入 50% 乙醇并孵育 10 分钟。孵育后，弃去，随后用 70% 乙醇洗涤 3 次，间隔 10 分钟，然后用 100% 乙醇洗涤 3 次，间隔 15 分钟。
然后，使用细尖镊子将组织转移到装有 1 毫升溶液 1 的微管中，持续 4 小时。4 小时后，将组织转移至装有溶液 2 的微管中，再孵育 4 小时。要将组织安装在 Sykes-Moore 腔室中，请使用细尖镊子将 25 毫米圆形盖玻片放置在腔室底座上。
同样，使用细尖镊子在盖玻片的底座上放置橡胶垫圈。取出浸入溶液 2 中的组织，并将其放在盖玻片的中心。然后，在组织上加入一滴溶液 2，大约 40 微升。
然后，取第二个盖玻片并将其放在垫圈顶部。然后，通过将锁定环拧入底座顶部，将盖玻片和垫圈牢牢压缩。然后，将 25 号针头穿过垫圈插入底座上的端口。
接下来，将 1 点 5 毫升溶液 2 填充到 3 毫升注射器中。然后，将 25 号针头安装在注射器上，并通过垫圈将针头插入对面的端口。然后，开始用溶液 2 注入腔室，并检查腔室内的空气是否通过另一个 25 号针头排出。
当腔室装满时，取出针头和注射器，并将 Sykes-Moore 腔室支架放在共聚焦显微镜载物台上。使用 10 倍物镜聚焦放置在腔室上的组织。接下来，为载物台设置一个参考点，并在焦平面上上下移动显微镜载物台，以识别和设置组织的顶部和底部。
将步长设置为 2 点 5 微米，并收集一个共聚焦图像文件，其中包含一组从上到下的组织图像。然后，将组织转移到含有 20 倍以上体积的 100% 乙醇的微管中，以逆转清除。然后，每隔一小时更换一次，更换为 70，然后更换为 50% 乙醇，最后更换磷酸盐缓冲盐水。
在 4 摄氏度下避光储存直至包埋。在这里，为了显示胎盘血管网络，已经获得了人类胎盘的显微和共聚焦显微图像。这些胎盘的显微图像显示了穿透胎盘薄壁组织的辐射绒毛树。
这些显微镜图像显示存在终止于绒毛簇中的绒毛树片的远端部分。接下来，为了显示绒毛的滋养层，对绒毛树的远端部分进行免疫标记。在图像中，外滋养层显示为绿色，毛细管显示为红色。
然后，为了在清除前后检查胎盘组织，获取未清除和清除胎盘组织的共聚焦图像。图像显示，对于未清除的组织，可以在组织深度 100 微米或更小的地方捕获免疫荧光。相反，对于透明的胎盘组织，免疫荧光可以在更高的深度捕获。
此外，为了将常规组织与反向透明切片进行比较，用乙醇以相反的过程将透明化的组织脱水。透明化前后用抗 CK7 对胎盘组织进行免疫组织化学染色表明，由于透明化，组织形态没有显着改变。动画显示免疫染色的绒毛组织沿组织体积的整个深度分布。
一旦您熟悉了该程序，您可以预计大约需要 18 小时，分为三天。在尝试执行此过程时，请务必记住它需要几种不同的技能。需要能够进行胎盘病理学、共聚焦显微镜检查。
您需要能够生成成像的 3D 渲染，并且需要能够熟悉免疫处理和分析。按照此程序，可以进行其他方法，如传统组织学、STS 页面或 maldi。随着它的发展，这项技术为母胎医学、新生儿学和滋养层生物学领域铺平了道路，以探索先兆子痫、胎儿生长不良和胎儿窘迫的根本原因。
观看此视频后，您应该对如何清除、渲染和分析胎盘绒毛树组织有很好的了解。非常感谢您观看视频，祝您的实验好运。
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概述
本研究提出了一种生成适用于血管网络分析的胎盘绒毛树片段的三维渲染协议。该方法旨在解决与儿童生长受限和早产相关的关键问题。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 血管生物学
背景
- 了解胎盘中的血管网络对于研究生长受限至关重要。
- 二维组织学表征在提供洞见方面有限。
- 免疫标记和透明化技术增强了血管结构的可视化。
- 本研究旨在改进生命科学领域的诊断和治疗方法。
研究目的
- 开发一种分析胎盘组织中血管网络的方法。
- 探索导致儿童生长受限和早产的因素。
- 提供对胎盘血管化的更清晰理解。
使用的方法
- 胎盘绒毛样本的可逆组织透明化。
- 免疫染色以标记血管网络。
- 透明化组织的三维渲染以便于可视化。
- 胎盘组织的解剖和逆向透明化。
主要结果
- 成功可视化了胎盘组织中的血管网络。
- 增强了对胎盘血管结构组织的理解。
- 对于诊断和治疗与生长相关的问题具有潜在影响。
- 由训练有素的人员演示了该程序。
结论
- 开发的协议允许对胎盘血管网络进行详细分析。
- 这种技术可以导致对胎盘健康理解的进展。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上解决关键的健康问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables detailed three-dimensional analysis of placental vascular networks, supporting mechanistic de-risking in maternal-fetal medicine by clarifying structural determinants of fetal growth restriction and preterm birth. It provides a disease-relevant system for evaluating vascular integrity under pathophysiological conditions such as diabetes, hypertension, and obesity. The approach enhances predictive confidence in target validation by linking placental microstructure to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular architecture as a therapeutic target in placental insufficiency.
- Operational Value: Provides quantitative structural metrics such as branch points and volume for target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible vascular network readouts for compound screening in placental models.
- Operational Value: Supports assay scalability through reversible clearing and multiplex immunostaining of endothelial and trophoblast markers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving human placental tissue architecture for preclinical continuity.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by correlating vascular phenotypes with maternal metabolic stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of vascular targets, progresses to screening via standardized 3D vascular phenotyping, and supports translational research through preserved tissue integrity and biomarker-compatible labeling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of vascular targets in placental disease models.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative, reproducible vascular network metrics from cleared tissues.
- Analytics: Generates measurable outputs including capillary volume, branch number, and end points for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation via human tissue relevance and immunohistochemical fidelity post-clearing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for vascular phenotyping across gestational and disease-state placental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vascular target validation through direct structural phenotyping.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via reversible clearing and synchronized immunostaining protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in maternal-fetal therapeutics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular network integrity in disease-relevant placental models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in placental pathology, immunofluorescence labeling, and confocal microscopy.
- Dependent on tissue clearing infrastructure, Sykes-Moore chambers, and reversible ethanol-based clearing solutions.
- Necessitates cross-team standardization for consistent immunolabeling of CD31 and CK7 across laboratories.
- Involves adaptation considerations for varying placental tissue quality and gestational age.
- Limited by tissue size constraints (~1–2 mm³) and clearing depth (~1 mm) affecting network capture completeness.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:17
Villous Tree Dissection and Immunofluorescent Staining
3:16
Clarification of the Tissue
4:07
Mounting for Microscopy and Confocal Microscopy
6:04
Reversing the Clearing
6:33
Results: Use of Confocal Microscopy, Immunostaining, and Reverse Clearing to Analyze the Vascularization of Placental Network
8:21
Conclusion
