干燥血液和血清斑点作为评估癌症生物标志物样本储存的有用工具

该方法有助于回答转化医学研究中的关键问题，例如为发展中国家患者研究生物标志物提供了可能。该技术的主要优势在于无需冷冻即可保存血液和血清样本至少两周，并为后续分析（如qPCR和ELISA）提供高质量的材料。该技术的应用前景可拓展至癌症和传染病等疾病的诊断领域。

该方法还可应用于诊断或研究领域，例如产前疾病的研究或HIV等感染性病理的分析。当我们在比较高加索人群与非洲人群的生物标志物，而这些病例系列缺乏冷冻样本时，首次提出了该方法的想法。该方法的可视化演示至关重要，因为血液点样步骤较难掌握。

在此操作中，使用含有5.4毫克EDTA的三毫升试管采集三毫升血液样本。将患者代码编号写在保存卡的右下角。用五毫升移液器小心地重新悬浮血液。

接下来，用移液器吸取一滴血液并转移至保存卡上。每次吸取血液时均使用新的吸头，重复点样操作，共获得三到五个血斑。将干燥的血斑（DBS）置于水平打开的保存卡盖子下，在开放、非吸附性表面上室温过夜干燥，避免阳光直射。

次日，将卡片与干燥剂一同放入塑料袋中，在室温下保存至使用。将从保存卡上的三个干血斑中提取DNA。首先，从卡片上剪下每个干血斑，并将其与卡片分离。

将分离的干血斑剪切成直径约一毫米的小片。取一个干血斑的小片放入1.5毫升离心管中。为消化样品，向管中加入180 µL商品化DNA提取试剂盒中的裂解缓冲液一，然后加入20 µL蛋白酶K，涡旋混匀。

将离心管放入恒温孵育器中，在56摄氏度下振荡孵育60分钟。孵育结束后，短暂离心以去除管盖上的液滴。加入200 µL裂解缓冲液二，涡旋震荡10秒，开始洗涤步骤。

将离心管放入恒温混匀仪中，在70摄氏度孵育10分钟。将洗脱柱置于新的2毫升收集管中，并弃去旧管。加入500 µL洗涤缓冲液，在6000 ×g 条件下离心1分钟。

将层析柱放入新的2 mL收集管中，并弃去旧管。加入500 µL洗涤缓冲液2，以6000 ×g离心1分钟。将层析柱放入新的2 mL收集管中，并弃去旧管。

在20,000 × g条件下离心3分钟以干燥膜。为洗脱DNA，将柱置于新的1.5毫升离心管中，并弃去收集管。将50 µL去离子水加入膜的中央，在室温下孵育10分钟。

将离心管在20,000 × g条件下离心1分钟。收集流出液，并再次置于膜的中央。再次将离心管在20,000 × g条件下离心1分钟。

弃去膜。使用分光光度计测定DNA浓度后，将DNA于-20摄氏度保存至使用。本实验中，首先采集7毫升外周血样本至不含EDTA的7毫升离心管中。

将血液样本在室温下静置30分钟以使其凝固。在保存卡右下角写上患者代码编号。在室温下以1100 ×g离心血液样本15分钟。

从离心管中移去上清液，并转移至新的15毫升离心管中。用5毫升移液器小心地重悬血液。吸取血清，将一滴转移至保存卡上。

重复点样，共获得三到五个血斑。将干燥的血清斑在室温下敞开通风干燥过夜。次日，将卡片置于含干燥剂的塑料袋中，于室温保存至使用。

若储存时间超过14天，应于-20摄氏度保存。根据需要，将各样本的DSS解冻，以准备ELISA实验。为从DSS中洗脱蛋白质，将一片DSS剪切成直径约1毫米的小片，并将这些小片放入1.5毫升离心管中。

然后加入 4 µL PBS，在 4 °C 下以低速振荡过夜。次日，使用适当稀释的蛋白洗脱液作为血清样本，采用市售试剂盒检测分泌蛋白或生长因子。

在本方案中，血液和血清样本以干燥斑点的形式储存在滤纸上，并置于室温下。图中显示了一张典型的蛋白保存卡在采血前和采血后的外观。为了确认滤纸储存及血液洗脱操作不会影响样本质量，对八份血清样本进行了ELISA检测，以分析维生素D结合蛋白（DBP）水平。这些样本分别采集于2毫升离心管中，立即在−80°C下保存，或以干燥血清斑点的形式储存。

配对样本间的变异系数（CV）范围为2%至24%，平均CV为9.6%。一旦掌握，若操作得当，该技术可在10至15分钟内完成。在完成该步骤后，可进行后续的分子生物学或蛋白质分析方法。该技术建立后，可使转化医学研究和生物标志物分析领域的研究人员与全球范围内缺乏标准条件生物样本保存设备的机构开展合作。

观看本视频后，您应充分了解如何正确地将血液样本保存为干血斑和血清斑。请务必注意，操作血液和化学试剂可能具有极高危险性，在进行本实验时，应始终采取佩戴手套和实验服等防护措施。