Name: 干血和血清斑点作为样品贮存的有用工具, 用于评估肿瘤生物标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 了解干血和血清斑点技术用于肿瘤生物标志物评估的样品贮存方法。该技术可在室温下保存样本至少两周，无需冷冻，适用于qPCR和ELISA等下游分析，为转化研究提供高质量材料。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Gráinne Tierney 提供的编辑协助。

采集并保存了健康供者和患者的外周血及血清，所有供者和患者均签署书面知情同意书，同意参与本研究。研究方案经当地伦理委员会批准，符合1964年《赫尔辛基宣言》中规定的伦理标准。
1. 干血斑中的血液储存
<ol>
	<li>血液样本采集
	<ol>
		<li>使用含有5.4 mg乙二胺四乙酸（EDTA）的3 mL试管采集3 mL外周血样本。 
		注意：应尽快将外周血制成干血斑（DBS），最迟不超过8小时。</li>
		<li>在保存卡的右下角写上患者代码编号。</li>
		<li>用5 mL移液器小心重悬血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在DBS卡上点样血液
	<ol>
		<li>使用50–200 µL吸头，通过移液将一滴血液（50 µL）转移至保存卡（材料表）上。</li>
		<li>重复步骤1.2.1，共制备3–5个血斑。每次吸取血液时均需丢弃旧吸头并更换新吸头。</li>
		<li>将DBS卡水平放置于开放的非吸附性表面上，在室温下过夜晾干，避免阳光直射。保持保存卡盖子打开，以促进血液干燥。 
		注意：此干燥过程中空气中的微粒或灰尘不会影响后续应用。</li>
		<li>将保存卡置于含干燥剂的塑料袋中，室温保存直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 根据DNA提取试剂盒说明书（干血斑部分）从干血斑开始进行DNA提取
<ol>
	<li>样本制备
	<ol>
		<li>使用采血卡上的3个干血斑。用镊子将每个干血斑从卡片上剪下，并剪成小碎片（直径约1 mm）。</li>
		<li>将剪碎的样本放入1.5 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本消化
	<ol>
		<li>向离心管中加入180 µL试剂盒提供的裂解缓冲液1（材料表）。再加入20 µL蛋白酶K。在将溶液加入含有血斑的1.5 mL离心管前，切勿将裂解缓冲液1与蛋白酶K预先混合。通过涡旋振荡充分混匀。</li>
		<li>将离心管放入恒温孵育器中，在56 °C下孵育60分钟。若恒温孵育器无振荡功能，则每10–15分钟涡旋振荡一次，每次至少10秒，注意避免样本温度下降。短暂离心以去除管盖上的液滴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤步骤
	<ol>
		<li>加入200 µL裂解缓冲液2（材料表），涡旋振荡10秒。</li>
		<li>将离心管放入恒温混匀器或加热振荡孵育器中，在70 °C下孵育10分钟。若孵育器无振荡功能，则至少涡旋振荡一次，持续至少10秒，注意避免样本温度下降。</li>
		<li>重复步骤2.3.1。将400 µL裂解液从1.5 mL离心管转移至洗脱柱（材料表）。以6,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>将洗脱柱放入新的2 mL收集管中，弃去旧收集管。</li>
		<li>加入500 µL洗涤缓冲液1（材料表），以6,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>将洗脱柱放入新的2 mL收集管中，弃去旧收集管。</li>
		<li>加入500 µL洗涤缓冲液2（材料表），以6,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>将洗脱柱放入新的2 mL收集管中，弃去旧收集管。</li>
		<li>以20,000 × g离心3分钟，以干燥膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱步骤
	<ol>
		<li>将洗脱柱放入新的1.5 mL离心管中，弃去收集管。</li>
		<li>将50 µL去离子水加至膜的中心位置，在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>以20,000 × g离心1分钟。收集洗脱液并再次加至膜的中心位置。</li>
		<li>以20,000 × g离心1分钟，弃去洗脱柱。</li>
		<li>使用分光光度计测定DNA浓度。</li>
		<li>将DNA于-20 °C保存直至使用。 
		注意：从干血斑（DBS）提取的DNA可用于多种分析，如通过实时PCR进行SNP检测或DNA Sanger测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DSS 的血清储存
<ol>
	<li>血液样本采集
	<ol>
		<li>在不含EDTA的7 mL试管中采集7 mL外周血样本。将血液样本在室温下静置凝固30分钟。</li>
		<li>在保存卡右下角写上患者代码编号。</li>
		<li>在室温下以980 × g 离心15分钟。 
		注意：应尽快将血清作为干血清斑（DSS）保存，且不得超过8小时。</li>
		<li>小心移除试管中的上清液，并转移至新的15 mL试管中。使用5 mL移液器小心重悬血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在DSS上进行血清点样
	<ol>
		<li>用移液器吸取并转移一滴血清（50 µL）至保存卡上。重复此步骤，共制备3–5个血清斑。 
		注意：务必精确移取每滴50 µL血清。血清不应超出卡片上的虚线范围。</li>
		<li>将DSS在室温下过夜晾干。保持保存卡盖子打开，以促进血液干燥。</li>
		<li>将卡片置于含干燥剂的塑料袋中，于室温保存至使用。若保存时间超过14天，应将卡片储存在-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从 DSS 开始的 ELISA 检测
<ol>
	<li>从DSS中洗脱蛋白质。
	<ol>
		<li>如有必要，将每个样品的DSS解冻。将DSS切成小块（直径约1 mm），放入含有400 µL PBS的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>在4 °C下轻轻振荡过夜。 
		注意：振荡强度应较低，避免PBS润湿管盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据ELISA试剂盒说明书，将蛋白洗脱液经适当稀释后作为血清样品用于分泌蛋白/生长因子分析。 
	注意：该方法适用于DBP检测9；对于其他ELISA检测，可能需要进行优化步骤。</li>
</ol>

<ol><li>Bertagnolio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+drug+resistance+surveillance+using+dried+whole+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots.</a> Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).</li>
<li>Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+filter+paper+for+the+collection+and+analysis+of+human+whole+blood+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens.</a> J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).</li>
<li>Garrido, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype+variability%2C+virological+response+and+drug+resistance+assessed+on+dried+blood+spots+collected+from+HIV+patients+on+antiretroviral+therapy+in+Angola%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemoth%22%5BJournal%5D)">Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola.</a> J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).</li>
<li>Steegen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+detecting+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+in+DNA+extracted+from+whole+blood+or+dried+blood+spots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots.</a> J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).</li>
<li>Costenaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+load+detection+using+dried+blood+spots+in+a+cohort+of+HIV-1-infected+children+in+Uganda%3A+correlations+with+clinical+and+immunological+criteria+for+treatment+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure.</a> J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).</li>
<li>Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+glutathione+and+glutathione+disulfide+in+the+blood+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase-deficient+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns.</a> BMC Pediatr. 20 (17), 172(2017).</li>
<li>Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practice+in+the+measurement+and+interpretation+of+lysosomal+acid+lipase+in+dried+blood+spots+using+the+inhibitor+Lalistat+2%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2.</a> Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).</li>
<li>Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+25+inflammatory+markers+and+neurotrophins+in+neonatal+dried+blood+spots+by+immunoassay+with+xMAP+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology.</a> Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).</li>
<li>Amadori, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+polymorphisms+or+serum+levels+as+key+drivers+of+breast+cancer+development%3F+The+question+of+the+vitamin+D+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway.</a> Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).</li>
<li>Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+hepatitis+B+virus+from+dried+blood+spots+by+polymerase+chain+reaction+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification.</a> J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).</li>
<li>Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+commercial+ELISA+for+the+detection+of+measles-specific+immunoglobulin+G+%28IgG%29+in+dried+blood+spots+collected+from+children+living+in+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings.</a> J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).</li>
<li>Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA-based+assay+for+IP-10+detection+from+filter+paper+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples.</a> Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).</li>
<li>St Julien, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+quality+genome-wide+genotyping+from+archived+dried+blood+spots+without+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification.</a> PLoS One. 8 (5), e64710(2013).</li>
<li>Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+fentanyl+analogs+in+dried+blood+spots+by+flow-through+desorption+coupled+to+online+solid+phase+extraction+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry.</a> Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案探讨了在实验室缺乏处理血液样本所需人员或基础设施的情况下，将血液和血清储存在滤纸上的可行性。具体而言，采用标准试管或指尖采血方式采集的全血或血清均可使用此方法储存，且无需在采血后立即将样本冷冻于-20 °C或-80 °C。干血斑（DBS）/干血清斑（DSS）在室温下可稳定保存长达14天，而血液/血清的完整性不受影响。储存过程中的一个关键问题是水分的存在，其对生物材料性质的影响大于温度。该问题可通过使用含干燥剂的塑料袋来避免。当卡片置于塑料袋内时，水分问题即可得到有效控制。在过夜孵育过程中，未观察到空气中的颗粒物、液滴、灰尘或湿气所导致的问题10。我们此前曾在针对意大利和非洲队列人群的生物标志物研究中，使用滤纸储存血液和血清样本11。我们优化了从DBS中提取DNA的方法，并在两个病例系列中分析了多个单核苷酸多态性（SNPs）。由于我们同时关注蛋白水平的评估，因此进一步优化了从DSS中洗脱蛋白质的方法，以用于ELISA检测。用于ELISA检测的DSS血清储存比用于定性分析的全血储存更为精细，因为实验人员必须确保在所有样本中移取完全等量的血清...

癌症生物标志物研究的主要目标是鉴定可用于诊断、预测患者预后以及判断患者是否会对特定治疗产生反应的新生物学参数。该研究领域对于发现创新性癌症治疗方法至关重要，并在个体化治疗中发挥关键作用。
生物标志物鉴定与验证的每一步操作都必须可靠且可重复。转化医学研究成功的关键在于正确储存血液和血清等生物样本。这是获得高质量生物材料的第一步，这些材料可用于开展分子生物学实验或蛋白质检测。
多中心研究通常需要招募足够数量的患者，以获得可靠的数据。并非所有研究机构都具备在 -80 °C 下保存样本的能力，或无法使用干冰将样本送往其他国际中心。使用滤纸采集血液是一种简单保存血液和血清的方法，无需立即冷冻样本1,2。只需将一滴血液或血清点在滤纸上，过夜干燥后，可在室温下保存长达14天1,2。这为研究人员提供了将样本寄送至其他实验室的时间。因此，使用干血斑（DBS）和干血清斑（DSS）可简化发达国家与发展中国家各研究机构之间的合作。
由于操作简便，干血斑（DBS）取样已广泛应用于多种血清学或遗传学下游分析检测。例如，过去干血斑常用于发展中国家的HIV筛查1,2,3,4,5。该储存方法的另一优势在于，血液样本可通过指尖采血获得，因而适用于新生儿筛查6,7,8。样本易于处理和运输是干血斑的进一步优势，尤其适用于在缺乏实验室设备的偏远地区采集的样本。在之前的一项研究中，我们曾利用干血斑（DBS）和干血清斑（DSS）检测一系列高加索人和非洲患者的维生素D及其维生素D结合蛋白（DBP）9。我们的非洲同事无法获得干冰。为了比较生物标志物，以了解两种族人群之间维生素D代谢通路的差异，我们进一步优化了实验流程，采用在标准条件下保存以及保存在滤纸上的配对样本进行分析。在优化干血斑/干血清斑操作流程后，我们得以在两组患者血清中成功检测DBP和维生素D。此外，在从高加索人全血和非洲人干血斑提取DNA后，我们还评估了多个单核苷酸多态性（SNPs）位点9。本方案可实现高质量血液样本在室温下的长期保存，且不影响从分子生物学实验到ELISA检测等多种下游分析。该方法推荐用于多中心研究中的生物样本管理，或用于不具备标准储存条件的实验中心。以下方案即为上述优化流程的最终整合。

<table><tbody><tr><td>Whatman 蛋白质保存卡 903 型，100 片/包&amp;lrm;</td><td>Sigma</td><td>Z761575</td><td>适用于在室温下保存样本，用于后续分析</td></tr><tr><td>Falcon 血清移液管，5 mL</td><td>Stem cell</td><td>#38003</td><td></td></tr><tr><td>50-200 &amp;micro;L 吸头</td><td>Star-Lab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA 微量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>这是一种用于分离微量 DNA 的 DNA 提取试剂盒&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer ATL（包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中）</td><td>Qiagen</td><td></td><td>在文中称为裂解缓冲液 1</td></tr><tr><td>Buffer AL（包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中）</td><td>Qiagen</td><td></td><td>在文中称为裂解缓冲液 2</td></tr><tr><td>QIAamp mini elute 柱</td><td>Qiagen</td><td></td><td>在文中称为柱</td></tr><tr><td>AW1&amp;nbsp;（包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中）</td><td>Qiagen</td><td></td><td>在文中称为洗涤缓冲液 1</td></tr><tr><td>AW2&amp;nbsp;（包含在 QIAamp DNA 微量提取试剂盒中）</td><td>Qiagen</td><td></td><td>在文中称为洗涤缓冲液 2</td></tr><tr><td>人维生素 D 结合蛋白 Quantikine ELISA 检测试剂盒</td><td>R&amp;D systems</td><td>DVDBP0</td><td></td></tr></tbody></table>

干燥血液和血清斑点作为评估癌症生物标志物样本储存的有用工具

Dried Blood and Serum Spots As A Useful Tool for Sample Storage to Evaluate Cancer Biomarkers

血液样本的质量对于确保下游分析（如实时 PCR 或 ELISA）结果的准确性至关重要。正确保存生物材料是获得可重复且可靠结果的基础。从血液采集到储存的整个过程，所有样本均应采用相同的方式处理。根据拟进行的分析类型，全血和血清样本应保存在 -20 °C 或 -80 °C，直至使用。血液/血清样本还应进行分装，以避免反复冻融。另一个重要问题是样本在不同实验室之间运输过程中的保存条件。如果无法使用干冰，或运输时间超过数天，则需要采用替代方案。一种选择是使用滤纸进行血液采集。本文提出一种利用干血斑（DBS）和干血清斑（DSS）进行血液和血清样本采集的方法。我们已建立从 DBS 中提取 DNA 的操作流程，并用于后续通过实时 PCR 检测若干单核苷酸多态性（SNPs）。此外，我们还优化了从 DSS 洗脱蛋白后进行 ELISA 检测的实验方案。该方法也可适用于其他 ELISA 检测或蛋白质分析流程。

我们利用干血片（DBS）和干血清片（DSS）技术，在室温下储存血液和血清，且不影响生物材料的质量。图1展示了蛋白保存卡在采血前和采血后的示例。为了验证滤纸储存及血液洗脱操作不会影响样本质量，我们将其与标准储存方法进行了比较。根据方案部分所述，我们从3份配对样本中提取了DNA，这些样本的全血分别采集于2 mL离心管中或以DBS形式储存。通过实时PCR分析了5个单核苷酸多态性（SNP）位点。配对样本所得数据的一致性达到100%。
关于ELISA分析，我们保存了8份血清样本，这些样本采集于2 mL离心管中（立即于-80 °C保存），以及干燥血清斑点（DSS）（室温保存一周后转移至-20 °C）。我们按照方案部分所述方法从DSS中洗脱蛋白质，随后根据试剂盒制造商提供的DBP检测说明书对这8份样本进行ELISA检测。结果如表1所示。配对样本间的变异系数（CV）范围为2%...

本方案描述了一种简单且实用的方法，用于保存外周血和血清/血浆，以便进行后续分析，如单核苷酸多态性（SNP）检测和ELISA实验。

血液样本质量对于确保实时荧光定量 PCR 或 ELISA 等下游分析结果的准确性至关重要。正确保存生物材料是……

该方法有助于回答转化医学研究中的关键问题，例如为发展中国家患者研究生物标志物提供了可能。该技术的主要优势在于无需冷冻即可保存血液和血清样本至少两周，并为后续分析（如qPCR和ELISA）提供高质量的材料。该技术的应用前景可拓展至癌症和传染病等疾病的诊断领域。该方法还可应用于诊断或研究领域，例如产前疾病的研究或HIV等感染性病理的分析。当我们在比较高加索人群与非洲人群的生物标志物，而这些病例系列缺乏冷冻样本时，首次提出了该方法的想法。该方法的可视化演示至关重要，因为血液点样步骤较难掌握。在此操作中，使用含有5.4毫克EDTA的三毫升试管采集三毫升血液样本。将患者代码编号写在保存卡的右下角。用五毫升移液器小心地重新悬浮血液。接下来，用移液器吸取一滴血液并转移至保存卡上。每次吸取血液时均使用新的吸头，重复点样操作，共获得三到五个血斑。将干燥的血斑（DBS）置于水平打开的保存卡盖子下，在开放、非吸附性表面上室温过夜干燥，避免阳光直射。次日，将卡片与干燥剂一同放入塑料袋中，在室温下保存至使用。将从保存卡上的三个干血斑中提取DNA。首先，从卡片上剪下每个干血斑，并将其与卡片分离。将分离的干血斑剪切成直径约一毫米的小片。取一个干血斑的小片放入1.5毫升离心管中。为消化样品，向管中加入180 µL商品化DNA提取试剂盒中的裂解缓冲液一，然后加入20 µL蛋白酶K，涡旋混匀。将离心管放入恒温孵育器中，在56摄氏度下振荡孵育60分钟。孵育结束后，短暂离心以去除管盖上的液滴。加入200 µL裂解缓冲液二，涡旋震荡10秒，开始洗涤步骤。将离心管放入恒温混匀仪中，在70摄氏度孵育10分钟。将洗脱柱置于新的2毫升收集管中，并弃去旧管。加入500 µL洗涤缓冲液，在6000 ×g 条件下离心1分钟。将层析柱放入新的2 mL收集管中，并弃去旧管。加入500 µL洗涤缓冲液2，以6000 ×g离心1分钟。将层析柱放入新的2 mL收集管中，并弃去旧管。在20,000 × g条件下离心3分钟以干燥膜。为洗脱DNA，将柱置于新的1.5毫升离心管中，并弃去收集管。将50 µL去离子水加入膜的中央，在室温下孵育10分钟。将离心管在20,000 × g条件下离心1分钟。收集流出液，并再次置于膜的中央。再次将离心管在20,000 × g条件下离心1分钟。弃去膜。使用分光光度计测定DNA浓度后，将DNA于-20摄氏度保存至使用。本实验中，首先采集7毫升外周血样本至不含EDTA的7毫升离心管中。将血液样本在室温下静置30分钟以使其凝固。在保存卡右下角写上患者代码编号。在室温下以1100 ×g离心血液样本15分钟。从离心管中移去上清液，并转移至新的15毫升离心管中。用5毫升移液器小心地重悬血液。吸取血清，将一滴转移至保存卡上。重复点样，共获得三到五个血斑。将干燥的血清斑在室温下敞开通风干燥过夜。次日，将卡片置于含干燥剂的塑料袋中，于室温保存至使用。若储存时间超过14天，应于-20摄氏度保存。根据需要，将各样本的DSS解冻，以准备ELISA实验。为从DSS中洗脱蛋白质，将一片DSS剪切成直径约1毫米的小片，并将这些小片放入1.5毫升离心管中。然后加入 4 µL PBS，在 4 °C 下以低速振荡过夜。次日，使用适当稀释的蛋白洗脱液作为血清样本，采用市售试剂盒检测分泌蛋白或生长因子。在本方案中，血液和血清样本以干燥斑点的形式储存在滤纸上，并置于室温下。图中显示了一张典型的蛋白保存卡在采血前和采血后的外观。为了确认滤纸储存及血液洗脱操作不会影响样本质量，对八份血清样本进行了ELISA检测，以分析维生素D结合蛋白（DBP）水平。这些样本分别采集于2毫升离心管中，立即在−80°C下保存，或以干燥血清斑点的形式储存。配对样本间的变异系数（CV）范围为2%至24%，平均CV为9.6%。一旦掌握，若操作得当，该技术可在10至15分钟内完成。在完成该步骤后，可进行后续的分子生物学或蛋白质分析方法。该技术建立后，可使转化医学研究和生物标志物分析领域的研究人员与全球范围内缺乏标准条件生物样本保存设备的机构开展合作。观看本视频后，您应充分了解如何正确地将血液样本保存为干血斑和血清斑。请务必注意，操作血液和化学试剂可能具有极高危险性，在进行本实验时，应始终采取佩戴手套和实验服等防护措施。

dried-blood-serum-spots-as-useful-tool-for-sample-storage-to-evaluate

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

干血和血清斑点作为样品贮存的有用工具, 用于评估肿瘤生物标志物

生物标志物是直接测量的疾病或健康生物学指标。在人群与社会科学研究中，生物标志物需要易于获取、运输和分析。干血斑（Dried Blood Spot,...

最大化人群研究参与度的健康生物标志物干血斑采集

本文介绍了一种高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测方法，用于定量干燥血斑中的免疫抑制剂他克莫司，该方法采用简单的手工蛋白质沉淀步骤及在线柱提取技术。...

使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测干血斑中的免疫抑制剂他克莫司

干燥血斑（DBS）的制备与处理流程在大多数诊断应用中仍缺乏标准化。为克服这一不足，本文提出了一种全面的逐步操作方案，并进一步评估了该方案在检测病毒感染标志物方面的有效性。...

干血斑的制备与处理：在免疫测定和分子技术中的应用

皮肤肿瘤在莫氏显微外科手术后通常会被丢弃。本文介绍了一种方案，可使临床辅助人员在不影响临床操作的情况下，有效处理和储存皮肤肿瘤（例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤）样本，用于后续的实验室应用。...

建立基于临床的生物样本库

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

生物样本库是生物医学研究的重要资源，欧洲肿瘤研究所转化与数字医学部门的生物样本库是该领域的典范。本文详细描述了生物样本库在管理各类人类生物样本时的标准操作规程。...

转化医学生物样本库：最佳样本管理的标准操作规程

液体活检已彻底改变了我们进行肿瘤学转化研究的方式，其中样本采集、质量和储存是其成功应用于临床的关键步骤。本文介绍了一种标准化且经过验证的下游游离DNA检测应用方案，可适用于大多数转化医学研究实验室。...

一种用于下游游离DNA检测的标准化液体活检预分析方案

本文介绍了利用自动化设备从全血中简便高效地分离和收集无细胞DNA及循环肿瘤细胞等物质的方法。...

从临床样本中自动分离与收集癌症相关物质

本文介绍了一种从干血清样本中检测低丰度生物标志物的实验方案，以胃泌素释放肽前体（ProGRP）这一生物标志物为例。采用抗体包被的磁珠对特征性ProGRP肽段进行选择性纯化与富集，捕获的肽段随后通过液相色谱-串联质谱法进行分析。...

基于质谱靶向蛋白质分析中低丰度蛋白质的微采样技术

本方案描述了一种促进从根治性前列腺切除术标本中采集样本的方法。其目标是在将组织样本存入生物样本库之前，根据解剖病理学标准对其进行定位、表征以及宏观-微观分离。...

通过改进取样技术与组织学表征提升前列腺肿瘤生物样本库的可靠性

本方案对纳米颗粒上个性化蛋白冠的SDS-PAGE分析进行了标准化，可实现对癌症特异性标志物的可重复、可扩展且低成本的检测。该方法专为胰腺导管腺癌的早期诊断而设计，为科研和临床环境中的复杂蛋白质组学方法提供了一种切实可行且符合REASSURED标准的替代方案。...

用于早期癌症检测中个性化蛋白冠分析的标准化SDS-PAGE工作流程

了解干血和血清斑点技术用于肿瘤生物标志物评估的样品贮存方法。该技术可在室温下保存样本至少两周，无需冷冻，适用于qPCR和ELISA等下游分析，为转化研究提供高质量材料。

干燥血液和血清斑点作为评估癌症生物标志物样本储存的有用工具

探索更多视频