用于检测果蝇幼虫缺氧的挖洞/隧道法
March 27th, 2018
该议定书描述了一种简单的检测方法, 用于识别在正常大气氧水平下缺氧的果蝇幼虫。该协议允许低氧幼虫与其他突变体区别, 这些变种显示重叠的表型, 如迟缓或缓慢生长。
该测定的总体目标是识别尽管氧水平正常但患有组织缺氧的果蝇幼虫。在果蝇中，有许多突变导致幼虫生长缓慢、不良和一些幼虫迟钝。该测定法确定了该类幼虫中患有组织缺氧的幼虫。
最终，该检测将有助于识别更多通过各种生理过程在组织中产生缺氧的突变。这种分析的想法源于对气道或气管受损的幼虫表现出两种奇怪行为的观察。这些异常行为是在幼虫生命的早期未能钻入食物，以及在游荡阶段未能钻入较软的底层。
如文本方案中所述，在产蛋培养皿中设置对照和实验遗传杂交。在开始定时收集鸡蛋之前，将苍蝇置于黑暗中至少两天。对于定时收集鸡蛋，在当天早些时候将成虫转移到装饰有新鲜酵母酱的新葡萄琼脂盘中，让成虫在盘子上产卵四个小时。
四小时后，将成虫转移到新鲜的葡萄琼脂板中。接下来，将收集板在 25 摄氏度下孵育 4 小时过夜。到第二天下午，大部分幼虫将孵化。
计划每个实验组至少有 50 个。对于单次检测，每个实验组至少准备 5 个检测板。加热加入 16 克苍蝇琼脂和 700 毫升去离子水。
在 95% 乙醇中制备 17.5 毫升 Nipagen。加热琼脂溶液，直到它几乎完全溶解。然后将 Nipagen 溶液加入琼脂溶液中并加热至琼脂完全溶解。
短暂冷却琼脂溶液，然后在 10 厘米平板上加载 15 毫升琼脂溶液。琼脂凝胶化后，盖上板盖，让它们在室温下干燥几个小时或过夜。腌制的琼脂必须触感坚硬，并且在切下琼脂时不会碎裂。
琼脂固化后，使用 1.5 厘米的软木板在每个板的琼脂凝胶上打一个中心孔。然后用新鲜的酵母酱整齐地填满孔。要将幼虫转移到检测板上，请制作一个简单的工具。
将曲线弯曲到塑料微刮刀的尖端，然后将尖端浸入酵母糊中，使其粘附在幼虫上。现在单独捡起第一龄幼虫，并将它们放在靠近食物丘的琼脂板上。对于每个实验组，至少准备 5 个板，每个板有 10 只幼虫。
为确保检测重复之间的可重复性，每个检测板上仅放置 10 只幼虫至关重要。请务必仔细检查检测板，以确定每次使用微刮刀尖端输送幼虫时，是否转移了一只且仅一只幼虫。加载板后，贴上标签，盖上盖子，然后在室温下将其置于黑暗中，盖子面朝上。
每天检查每个板，直到所有幼虫都死亡或化蛹。以下是测定第 2 天到第 8 天的野生型菌株板示例。第 2 天，幼虫被埋在食物中，没有发生隧道。
隧道形成从第 3 天开始，并在第 5 天和第 8 天之间达到最大值，因为幼虫停止在隧道中徘徊并化蛹。用弯曲的挑逗针小心地将蛹转移到葡萄盘上，如果需要，数一下包裹了多少蛹。注意蛹的形成并评估蛹是否有异常。
为了对检测板内的隧道进行成像，首先小心地从每个板的中央孔中取出并丢弃所有酵母食物。然后用自来水轻轻地淹没每个板，并使用软画笔小心擦去残留在琼脂表面的任何碎屑。一些琼脂碎片可能会在隧道最密集的地方碎裂。
这可以在以后纠正。继续更换水数次，轻轻刷掉碎屑，直到板完全干净。然后用去离子水对板进行最后冲洗，盖上盖子，并在室温下干燥过夜。
重要的是使用温和的水流和轻柔的笔触清洁琼脂平板，以免折断或损坏琼脂凝胶的某些部分。第二天，准备使用黑色背景的板的 tiff 文件图像，将隧道显示为明亮的白线。凝胶成像系统适用于此步骤。
然后，使用带有椭圆工具的图像 J 定量图像中的隧道，定义琼脂凝胶，直到但不包括培养皿的塑料边缘。然后应用自动阈值以生成印版的反向图像，使隧道显示为黑线。要校正不包含隧道的暗区，请使用 Color picker 和 Paintbrush 工具将这些区域变白。
接下来，在 Analyze 下拉菜单下，选择 Set scale 并单击以删除缩放。然后转到 Analyze 下的 Set measurements （设置测量） 窗口，并选中 Area （面积） 和 Limit to threshold（限制为阈值）。现在按 Ctrl 键和 M 键，以代表隧道区域的像素单位测量图像中的黑色区域。
要定量中心孔周围琼脂侵蚀造成的隧道损失，请取消选中 Limit to threshold。使用 Wand 工具定义中心孔，然后按 Control 加 M 以像素为单位测量其值。从该值中减去直径为 1.5 厘米的孔的像素值。
将与先前获得的像素值相加，得到总隧道像素值。对于缺失琼脂延伸到隧道中心环之外的平板，需要一个额外的步骤来防止定量包括中心区域以外的区域。使用拾色器和画笔工具添加黑条，如图所示，以限制量化的区域。
所描述的测定用于研究气管中基因 unin充气功能受损的幼虫的潜在缺氧。该基因通过 Gal4 UAS 抑制 RNAi。使用了两条 Gal4 线。
Breathless Gal4，它通过整个气管系统的所有发育来表达。或 cut（ue）Gal4，在幼虫生命期间在小气管切面中强烈表达。对照幼虫包含其中一种 Gal4 系，但没有不可充气的 RNAi。
在整个发育过程中，具有 cut（ue）Gal4 驱动不可充气 RNAi 的幼虫在生长和行为方面与对照组没有区别。然而，blt-Gal4 强烈抑制整个气管中不可充气的 RNAi 导致摄食期无法挖洞并产生高死亡率。这些幼虫在游荡阶段也表现出完全没有隧道。
此外，无呼吸的 Gal4 实验幼虫比对照更小、更薄、更迟钝，并且在所有其他组化蛹后很长一段时间内仍保持幼虫状态。看完这个视频后，您应该对如何通过监测果蝇幼虫钻入食物堆或隧道进入软底层的程度来测试组织缺氧。完全没有隧道是组织缺氧的有力指标。
概述
本协议概述了一种旨在识别在正常大气氧气水平下经历缺氧的果蝇幼虫的测定方法。它将缺氧幼虫与其他表现出类似表型（如迟缓或缓慢生长）的突变体区分开来。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 生理学
背景
- 果蝇幼虫可以表现出各种导致缓慢生长和迟缓的突变。
- 一些气道损伤的幼虫表现出异常行为，表明可能存在缺氧。
- 识别缺氧幼虫可以帮助发现更多与氧气缺乏相关的突变。
- 了解这些机制对于研究发育过程中的代谢过程至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的测定方法来检测果蝇幼虫的缺氧。
- 区分缺氧幼虫和其他表型重叠的突变体。
- 促进对影响氧气运输和利用的基因突变的进一步研究。
使用的方法
- 设置遗传交叉并收集成年果蝇的卵。
- 准备用于幼虫生长的具有特定组成的琼脂板。
- 将一龄幼虫转移到测定板上并监测其行为。
- 使用成像技术和软件分析量化钻孔行为。
主要结果
- 通过行为测定成功识别出缺氧幼虫。
- 记录与幼虫健康和缺氧相关的钻孔行为。
- 为未来研究影响氧气水平的基因突变提供了框架。
- 展示了精确的实验条件对可重复性的重要性。
结论
- 该测定方法有效地将缺氧幼虫与其他表型区分开来。
- 研究结果有助于理解组织缺氧的遗传基础。
- 该方法可以应用于进一步研究影响呼吸功能的突变。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable detection of tissue hypoxia in Drosophila larvae enables early-stage target validation for genes affecting oxygen sensing and distribution. This behavioral assay provides predictive confidence in distinguishing hypoxia-driven phenotypes from overlapping growth or locomotion defects, supporting mechanistic de-risking in genetic screens. The approach enhances portfolio triage by clarifying gene function in disease-relevant oxygen homeostasis pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of genes implicated in oxygen sensing and tissue hypoxia.
- Supports mechanistic de-risking by isolating hypoxia-specific behavioral phenotypes.
- Facilitates prioritization of genetic targets for further investigation in oxygen-related disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized behavioral assay for quantifying hypoxia-induced phenotypes in larvae.
- Delivers reproducible, quantitative outputs using imaging and software analysis.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic or pharmacological screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of tissue hypoxia for translational biomarker exploration.
- Enables continuity from genetic discovery to preclinical validation of hypoxia-modulating interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying gene function in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the early discovery continuum, bridging genetic target identification with preclinical model development for hypoxia-related pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for gene function in oxygen sensing and tissue hypoxia.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative behavioral readouts for assay readiness.
- Analytics: Provides measurable outputs via ImageJ quantitation of tunneling behavior.
- Translational Research: Connects genetic findings to disease-relevant hypoxia phenotypes in vivo.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for screening diverse genetic backgrounds affecting oxygen homeostasis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes behavioral phenotyping and ensures reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying gene-phenotype relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for hypoxia-related research.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics and behavioral phenotyping.
- Needs imaging infrastructure and analytical software such as ImageJ.
- Demands strict cross-team standardization for assay setup and data analysis.
- Adaptable to various genetic backgrounds and model systems within Drosophila.
- Assay sensitivity depends on precise control of larval density and environmental conditions.
