Name: 新型光声显微镜与光学相干层析成像在活兔眼中的双模脉络成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习光声显微镜与光学相干层析成像双模态技术，实现活兔眼脉络膜视网膜的无创、无标记成像。该方法可解析血氧饱和度、血液分布及黑色素分布，为眼科疾病研究提供高分辨率成像手段。

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本研究得到了美国国立眼科研究所（National Eye Institute）4K12EY022299（YMP）、Fight for Sight-国际视网膜研究基金会（Fight for Sight-International Retinal Research Foundation）FFS GIA16002（YMP）、防盲研究基金会（Research to Prevent Blindness）的无限制部门资助，以及密歇根大学眼科与视觉科学系的大力支持。本研究使用了由美国国立眼科研究所P30 EY007003资助的视觉研究核心中心（Core Center for Vision Research）的资源。

兔子属于美国农业部（USDA）管辖的物种，其在生物医学研究中的使用需遵循严格的规定。所有兔类实验均在获得密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准的实验动物方案后（方案编号 PRO00006486，项目负责人 Yannis Paulus），依照视觉与眼科研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明进行。
1. 系统配置
<ol>
	<li>光声显微成像（PAM）
	<ol>
		<li>使用由半导体泵浦固体激光器泵浦的光学参量振荡器（OPO）激光器作为PAM的光源。选择适当的技术参数，例如脉冲重复频率为1 kHz，脉冲持续时间为3 - 6 ns，可调谐波长范围为405 - 2600 nm。</li>
		<li>将激光器发出的570 nm光束经由两面镜子（M1和M2）反射后，通过安装在电机驱动旋转台上的半波片衰减器，最后由一个光束准直器进行聚焦、滤波和准直（图1）。优化光束准直器的设计。光束准直器的一个示例配置包括一个聚焦透镜L1（焦距250 mm）、一个针孔（直径50 µm）和一个准直透镜L2（焦距30 mm）。</li>
		<li>使用分光比为90/10（反射/透射）的分束器（BS1）将准直后的光束分成两部分。将透射部分由光电二极管记录，用于逐脉冲激光能量监测。将反射部分依次经由一面镜子（M3）和一个二向色镜（DM）偏转，并利用二维检流计进行光栅扫描。该检流计与光谱域（SD）-OCT系统共用（如下所述）。</li>
		<li>将扫描后的光束通过由扫描透镜（焦距36 mm）和眼科透镜（OL，焦距10 mm）组成的望远镜系统传输，最终由兔眼的光学系统将其聚焦于眼底。</li>
		<li>选择具有适当技术参数的针状超声换能器，例如中心频率为27 MHz，双向−6 dB带宽为60%。将其置于偏离中心视轴的结膜接触位置，以捕获激发的光声信号。</li>
		<li>使用超声放大器（例如增益57 dB）对信号进行放大，通过低通滤波器（例如截止频率32 MHz）滤波，并以200 MS/s的采样率由高速数字化仪进行数字化。</li>
		<li>在兔眼前方放置一个功率计，测量兔眼角膜上的激光脉冲能量，确保其在570 nm波长下低于ANSI安全限值160 nJ38。通过由Matlab经同步电子设备控制的激光快门阻断光束，以避免激光过曝。</li>
		<li>通过数据采集（DAQ）板同步激光器、检流计和数字化仪。使用Matlab编写系统控制和数据采集的软件程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）
	<ol>
		<li>在商用系统基础上改造SD-OCT系统，即在扫描透镜（SL）后增加一个眼科透镜（OL），并在参考臂中加入一段色散补偿玻璃（DCG）（图1）。该改进使OCT系统能够对兔眼的后段进行成像。</li>
		<li>使用可调焦筒管调节参考臂的长度，确保其与样品臂的光程长度匹配。使用光阑控制从参考臂后向反射的光强，使其与兔眼眼底后向散射光的强度相匹配，以实现最大图像对比度。</li>
		<li>在扫描头内集成一个电荷耦合器件（CCD）相机，并使用发光二极管（LED）作为外部照明光源，实现对兔眼眼底的实时可视化观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 系统校准
<ol>
	<li>初始化检流计的位置，并通过调节光纤准直器支架和分束立方体的螺丝来对准OCT系统。 
	注意：逐步操作步骤可在商业采购的OCT系统手册中找到，此处不再赘述。此步骤主要是为了确保光纤准直器、参考臂和扫描透镜的正确对准，以最大化OCT系统的性能。</li>
	<li>调节针孔在聚焦透镜焦点附近的 x、y 和 z 位置，以实现对激光束的空间滤波并最大程度地传输激光能量。使用高度测量工具检查针孔前后激光束的高度，确保两者一致。</li>
	<li>调节准直透镜L2的倾斜、偏心及 z 位置，以使经过滤波的光束准直。确保在近场和远场观察时，光束的尺寸和高度大致相同。</li>
	<li>通过调节反射镜和二向色镜（DM）的倾斜角度，将PAM激光束与OCT光束同轴合并。完成此步骤后，PAM激光与OCT光应完全重合，且在兔眼视网膜上的扫描区域相同。</li>
	<li>调节物镜（OL）的倾斜和偏心，使其在光路中正确对准。完成后，双模态系统即可用于成像。 
	注意：可采用自准直法实现此对准，即观察由物镜表面反射回来的光，确保其沿入射光路径原路返回。</li>
</ol>
3. 兔子准备
<ol>
	<li>从动物房取出一只新西兰白兔，记录个体信息，如体重和动物编号。</li>
	<li>将兔用平台（包括体部支撑架和头部支撑架）安装在成像系统下方的光学平台上。在体部支撑架上放置循环水加热毯，并将循环水温度设定为 38 °C，以在整个实验及恢复期间维持兔子的体温。</li>
	<li>记录操作前的生命体征，包括动物整体状态、黏膜颜色、心率、呼吸频率和直肠体温。通过肌内注射（IM）给予氯胺酮（40 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）混合物对兔子进行麻醉，并记录氯胺酮的使用情况（属三级管制药品）。通过检测心率、呼吸频率和整体状态确认麻醉深度。</li>
	<li>使用托吡卡胺 1% 眼用溶液和盐酸去氧肾上腺素 2.5% 眼用溶液各一滴，散大兔瞳孔。</li>
	<li>使用开睑器固定眼睑，滴加一滴眼用润滑剂以湿润角膜。在成像操作前，向眼内滴入一滴 0.5% 丁卡因表面麻醉剂。 
	注意：对于持续时间较长或可能引起动物不适的操作，应在实验前给予兔子皮下注射美洛昔康，以确保动物舒适。</li>
</ol>
4. SD-OCT 成像
<ol>
	<li>将兔子转移至临床眼底相机的成像平台，于OCT成像前采集50度眼底、无红光及自发荧光图像，以评估眼球光学透明度，并识别眼底血管形态及解剖标志，如视神经和髓样放射状视网膜血管结构。</li>
	<li>将兔子转移至OCT系统的成像平台，调整其体位，使其中一只眼睛大致位于物镜（OL）下方。使用LED光源照射眼睛。 
	注意：为促进该技术的临床转化，实验中不采用任何方法固定兔眼，兔头仅放置于头托上，无额外固定措施。</li>
	<li>打开OCT软件，首先查看CCD相机捕获的眼底图像。根据需要微调头托的高度和角度，确保感兴趣区域（ROIs），如脉络膜血管和视网膜血管，位于相机视野（FOV）范围内。 
	注意：若兔子处于良好的麻醉状态，一次连续成像过程可持续长达10分钟，期间无需重新调整兔头位置。</li>
	<li>绘制一条直线以定义目标OCT B扫描位置，并开始扫描。调节参考臂长度以显示OCT图像，并在OCT软件中优化色散补偿参数，以获得最清晰的图像。 
	注意：调节参考臂长度时，将依次出现两个镜像对称的OCT图像。可根据已知的眼底解剖结构知识判断正确图像。</li>
	<li>设置数据采集参数（如像素数量和平均次数），并保存图像。</li>
	<li>观察兔子的呼吸频率和心率，以评估麻醉深度及动物舒适度。对于较长时间的成像，必要时可考虑通过气管插管、V-gel装置或面罩给予三分之一剂量的补充氯胺酮或吸入异氟烷，以维持适当的麻醉水平。</li>
	<li>实验期间每2分钟用洗眼液冲洗兔角膜一次，防止角膜表面脱水及角膜浅层点状上皮病变。每15分钟监测并记录动物生命体征。</li>
</ol>
5. PAM 成像
<ol>
	<li>佩戴适当的激光安全护目镜，并打开OPO激光器。</li>
	<li>启动PAM控制软件，将激光波长调节至目标生色团的某一吸收峰处（例如， 570 nm 用于血红蛋白），初始化检流计的位置，并监测兔角膜前的激光能量，确保其低于 ANSI 安全限值。</li>
	<li>将超声换能器安装在三维（3D）平移台上，调整换能器尖端位置，使其接触兔结膜并指向眼底。滴加一滴眼用润滑剂，以改善换能器尖端与兔结膜之间的耦合。</li>
	<li>打开LED照明光源，通过Matlab软件观察兔眼眼底。</li>
	<li>设置扫描感兴趣区域（视网膜血管或脉络膜血管），包括中心位置和物理尺寸。打开激光快门，开始扫描声束的B型扫描。通过粗略调整换能器位置，应在示波器上观察到检测到的光声信号。若未观察到信号，可轻微调整眼球位置以扫描角膜的不同区域，或更换另一只眼睛并重复上述步骤。</li>
	<li>在示波器上观察检测到的光声信号，并精细调节换能器位置，以在整个B型扫描范围内使信号强度最大化。 
	注意：由于声束宽度有限，超声换能器通常具有较小的视场（FOV）41此步骤用于确定最终光声显微成像（PAM）图像的背景调制。若未正确对齐，将导致PAM图像背景不均，显著降低图像质量。</li>
	<li>设置数据采集参数。包括像素数量（例如，256×256像素），采样率（例如，200 MS/s）及延迟时间。开始数据采集。Matlab 软件启动时会自动打开快门以允许激光通过，采集结束时则自动关闭快门以阻断激光，避免激光过曝。 
	注意：受限于激光器的脉冲重复频率（1 kHz），完成一幅 256 × 256 像素图像的数据采集约需 1 分钟。</li>
	<li>处理原始数据，并通过最大强度投影（MIP）将PAM图像以二维（2D）形式可视化13 或通过体绘制实现三维成像38.</li>
	<li>拆下超声波换能器，用去离子水冲洗探头尖端，然后放回储存盒中。</li>
	<li>将兔子转移至眼底相机，并重新检查眼底。此步骤有助于确认成像过程后眼底是否存在任何形态学改变。</li>
	<li>实验期间每2分钟用洗眼液冲洗兔眼角膜一次，以防止角膜表面脱水和角膜病变。每15分钟监测并记录动物生命体征。 
	注意：PAM、OCT 和眼底成像过程约需 1 小时。</li>
</ol>
6. 成像后处理
<ol>
	<li>使用眼底相机重新检查眼底后，断开已连接的V-gel。用洗眼液冲洗眼睛，涂抹氟比洛芬滴眼液和新霉素、多粘菌素B硫酸盐及地塞米松眼膏，然后闭合眼睑。</li>
	<li>将带有循环水毯的兔子转移至恢复舱内。遮蔽箱体避免光照，直至兔子自然苏醒。在此期间，每15分钟监测一次动物生命体征，做好记录，并将副本提交至动物设施存档。</li>
	<li>当兔子苏醒后活动正常、意识清醒且行走无异常时，将其送回动物设施。若计划进行急性实验，则使用安乐死溶液（e.g., Beuthanasia，0.22 mL/kg，经耳缘静脉注射）实施安乐死，并妥善处理尸体。</li>
	<li>关闭软件和激光器。清洁光学平台。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

完整且规则的泪膜对于获取高质量的眼底图像至关重要。不规则或退化的泪膜会显著降低图像质量42。为了维持泪膜的完整性并防止角膜浅层点状角膜病变，必须频繁使用洗眼液对角膜进行润滑，大约每两分钟一次。若对眼球透明度存在任何疑虑，应使用裂隙灯和荧光素试纸检查角膜状况。
在对较大动物的眼后段进行成像时，可能会遇到多种困难，包括光声信号随距离增加而衰减（尤其是高频成分）、角膜脱水以及光学像差等问题。光声信号在被针状超声换能器探测到之前，其幅度通常会经历显著衰减。眼球越大，信号衰减越严重。兔子的眼球尺寸（约18.1 mm）约为大鼠的三倍、小鼠的六倍，这使得对兔眼的成像尤为具有挑战性。为了获得理想的成像质量，宜采用小直径（本研究中经准直后为2 mm）且波前准直（理想情况下为平面波前）的激光束，因为这种光束受角膜固有光学像差的影响最小，并能良好聚焦于视网膜上。这一点对于降低激光照射剂量和提高图像分辨率至关重要。此外，根据实验结果，应选用中心频率为27 MHz的超声换能器，而非更高中心频率的换能器，因为在此距离下该频率可获得最大的超声信号。
<p ...

近几十年来，生物医学光声成像领域取得了迅猛发展1,2,3,4,5,6,7,8。基于光能向声能的转换，新兴的光声成像技术能够对从细胞器、细胞、组织、器官到小型动物全身等不同尺度的生物样本进行可视化，并揭示其解剖学、功能、分子、遗传及代谢信息1,2,9,10,11,12。光声成像已在细胞生物学13,14、血管生物学15,16、神经科学17,18、肿瘤学19,20,21,22、皮肤病学23、药理学24和血液学25,26等多个生物医学领域展现出独特的应用价值。其在眼科中的应用，即光声眼成像，已引起科学家和临床医生的广泛关注，目前正处于积极研究之中。
与常规使用的ocular成像技术相比27例如荧光素眼底血管造影（FA）和吲哚菁绿血管造影（ICGA）（基于荧光对比）、光学相干断层扫描（OCT）（基于光散射对比）及其衍生技术OCT血管成像（基于红细胞运动对比），光声眼成像则利用光吸收作为对比机制。这与传统的眼科成像技术不同，为研究眼部组织的光吸收特性提供了独特的工具，而这些特性通常与眼部组织的病理生理状态相关联。28迄今为止，光声眼成像领域已取得大量卓越的研究成果29,30,31,32,33,34,35,36,37但这些研究主要集中在大鼠和小鼠等小型动物眼球的后段。这些开创性研究充分证明了光声成像在眼科应用中的可行性，然而由于大鼠和小鼠的眼球尺寸远小于人类（不足人类眼球尺寸的三分之一），该技术在向临床转化方面仍面临诸多挑战。当应用于较大眼球的后段成像时，超声波需传播更长的距离，可能导致信号强度显著下降，图像质量严重受损。
为实现这一目标，我们近期报道了利用集成的光声显微镜（PAM）和谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对活体兔进行无创、无标记的脉络膜视网膜成像38。该系统性能优异，能够基于眼组织内源性的吸收和散射对比，对较大动物眼睛的视网膜和脉络膜进行可视化。在兔的初步实验结果表明，PAM可在570 nm波长下以显著低于美国国家标准协会（ANSI）安全限值（160 nJ）的激光曝光剂量（约80 nJ）无创地区分单个视网膜和脉络膜血管39；而OCT则能清晰分辨不同的视网膜层次、脉络膜和巩膜。这是首次在较大动物中实现后段眼组织的PAM成像，考虑到兔眼球的轴向长度（18.1 mm）40约为人类（23.9 mm）的80%，该技术可能成为向临床转化的重要一步。
本研究中，我们详细描述了用于活体兔无创、无标记脉络膜视网膜成像的双模态成像系统及实验方案，并通过典型的视网膜和脉络膜成像结果展示了该系统的性能。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;双模态成像系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO激光器</td><td>Ekspla (Vilnius, Lithuania)</td><td>NT-242</td><td></td></tr><tr><td>光束衰减器</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AHWP10M-600</td><td></td></tr><tr><td>电动旋转台</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>PRM1/MZ8</td><td></td></tr><tr><td>电动旋转台控制器</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>TDC001</td><td></td></tr><tr><td>聚焦透镜</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AC254-250-B</td><td></td></tr><tr><td>针孔</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>P50S</td><td></td></tr><tr><td>准直透镜</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AC127-030-B</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>PDA36A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>激光快门</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada)</td><td>LS6S2T0</td><td></td></tr><tr><td>激光快门驱动器</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada)</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>Di03-R785-t3-25&amp;times;36</td><td></td></tr><tr><td>扫描透镜</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>眼科透镜</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AC080-010-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>超声换能器</td><td>Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA)</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA)</td><td>AU-1647</td><td></td></tr><tr><td>带通滤波器</td><td>Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA)</td><td>BLP-30+</td><td></td></tr><tr><td>数字化仪</td><td>DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA)</td><td>PX1500-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>同步电子设备</td><td>National Instruments Corporation (Austin, TX, USA)</td><td>USB-6353</td><td></td></tr><tr><td>OCT模块</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>Ganymede-II-HR</td><td></td></tr><tr><td>色散补偿玻璃</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>LSM03DC</td><td></td></tr><tr><td>照明LED光源</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>MCWHF2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>功率计</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>S121C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>功率计接口</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100USB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高度测量工具&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>BHM1</td><td></td></tr><tr><td>眼底相机</td><td>Topcon Corporation (Tokyo, Japan)&amp;nbsp;</td><td>TRC 50EX</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks (Natick, MA, USA)</td><td>2017a</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA)</td><td>WaveJet 354T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;动物实验&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水循环毯</td><td>Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA)</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA)</td><td>NDC 编码 42023-115-10</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>VetOne (Boise, ID, USA)</td><td>NDC 编码 13985-704-10</td><td></td></tr><tr><td>托吡卡胺滴眼液</td><td>Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA)</td><td>NDC 编码 17478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>盐酸去氧肾上腺素滴眼液</td><td>Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA)</td><td>NDC 编码 42702-102-15</td><td></td></tr><tr><td>眼润滑剂</td><td>Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA)</td><td>NDC 编码 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>洗眼液</td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA)</td><td>NDC 编码 59390-175-18</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁卡因滴眼液</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>NDC 编码 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>氟比洛芬钠滴眼液</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>NDC 编码 24208-314-25</td><td></td></tr><tr><td>新霉素和多粘菌素B硫酸盐及地塞米松眼膏</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA)</td><td>NDC 编码 24208-795-35</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康注射液</td><td>Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA)</td><td>NDC 编码 11695-6925-1</td><td></td></tr></tbody></table>

活体兔眼脉络膜视网膜新型光声显微与光学相干断层扫描双模态成像

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

光声眼部成像是一种新兴的眼科成像技术，可通过将光能转化为声波实现对眼部组织的无创可视化，目前正处于深入研究阶段。然而，迄今大多数已报道的研究集中于对大鼠和小鼠等小型动物眼球后段的成像，由于这些动物的眼球尺寸较小，难以向临床人眼应用转化。本文介绍一种新型的光声显微成像（PAM）与光学相干断层扫描（OCT）双模态系统，适用于兔等较大动物眼球后段的成像。本文详细描述该系统的配置、系统校准、动物准备以及双模态实验方案 体内详细介绍了在兔子中进行无创、无标记的脉络膜视网膜成像的方法。通过代表性实验结果展示了该方法的有效性，包括利用光声显微成像（PAM）和光学相干断层扫描（OCT）获取的视网膜和脉络膜血管结构。本文为在兔子中重现成像结果以及推进大动物光声眼成像提供了实用指南。

作者实验室已使用四只新西兰白兔成功测试了该双模态成像系统及实验方案。以下展示部分代表性结果。
图1 展示了光声显微成像（PAM）与谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）双模态成像系统的示意图。该系统由以下模块组成：光声光源、可调激光衰减器、光束准直器、能量计、扫描头、光声检测与采集模块、OCT单元以及同步电子控制系统。详细的系统配置见第1.1节。
图2展示了使用双模态成像系统获取的兔脉络膜血管的典型成像结果。图2(a)为眼底照片，显示脉络膜血管分布在兔眼底的大部分区域，而视网膜血管则局限于髓鞘层内。<strong class...

本文描述了一种新型的光声显微成像与光学相干断层扫描双模态系统的构建及其操作流程，可用于对兔子等较大动物的脉络膜视网膜进行无创、免标记成像。

光声眼部成像是一种新兴的眼科成像技术，可通过将光能转化为……来无创地可视化眼部组织。

本新型成像系统及操作流程的总体目标是对较大哺乳动物（如兔子）的眼睛进行无创、无需标记的脉络膜视网膜成像，实现光声显微成像与光学相干断层扫描的双模态联合成像。该方法有助于解答眼科成像领域中的关键问题，包括在较大动物中分辨氧饱和度、血流分布及黑色素所需的成像深度、分辨率以及临床转化潜力。该技术的主要优势在于，能够无创地可视化眼部组织，从而获取光声显微成像与光学相干断层扫描的双模态图像。首先，选择由半导体泵浦固体激光器泵浦的光学参量振荡器激光器作为光声显微镜的光源，并使用分束器以19反射比10透射的分束比例将准直光束分开。接着，通过M3反射镜和二向色镜依次偏转反射光束，并利用二维检流计对反射光束进行光栅扫描。将扫描后的光束通过由焦距为36毫米的扫描透镜和焦距为10毫米的眼科透镜组成的望远镜系统传输，并借助兔眼光学系统将光束聚焦于视网膜上。开始成像操作前，请在体位支撑垫上放置水循环加热毯，并将循环水温度设置为38摄氏度。记录操作前的生命体征，并通过兔的心率和呼吸频率确认镇静程度是否合适。使用1%托吡卡胺滴眼液和2.5%盐酸去氧肾上腺素滴眼液各一滴，散大兔的瞳孔。使用超声放大器放大信号，并通过低通滤波器对信号进行滤波。将功率计置于兔眼前方，测量角膜上的激光脉冲能量，确保其低于美国国家标准协会的安全限值。为了使光学相干断层扫描（OCT）系统能够成像兔眼的后段结构，在扫描透镜后添加一个眼科透镜。使用可调焦的 housing 管调节参考臂长度，以确认其与样品臂的光程长度一致。对于谱域 OCT 成像，将兔置于临床眼底相机的成像平台上，获取 50 度眼底无红光及自发荧光图像。随后，将动物转移至 OCT 系统平台，使一只眼睛位于眼科物镜下方。使用LED光源照亮眼睛，并打开OCT软件。检查眼底的CCD相机图像，在软件中绘制一条直线以表示感兴趣的OCT B扫描切面。开始扫描，调节参考臂长度以观察OCT图像，并优化OCT软件中的色散补偿因子，从而获得最清晰的图像。然后设置数据、适当的数据采集参数，并保存图像。进行光声显微成像时，打开光参量振荡器激光器。启动光声显微镜控制软件，并将激光波长调节至目标染料的一个吸收峰处。初始化检流计的位置，并在激光照射兔角膜前监测激光能量，确保其低于美国国家标准协会的安全限值。将超声换能器安装在三维平移台上，并将换能器尖端接触兔结膜，使尖端指向眼底。滴加一滴眼用润滑剂以改善换能器尖端与兔结膜之间的耦合，并打开LED照明光源。通过 MatLab 软件观察兔眼眼底，并设置扫描兴趣区域，包括中心位置及该区域的物理尺寸。打开激光快门，开始进行B扫描，同时在示波器上观察检测到的光声信号，并根据需要调整换能器位置，以在整个B扫描过程中使信号强度最大化。然后设置数据采集参数，处理原始数据，并以二维形式显示光声显微镜图像。成像结束后，将兔子转移回眼底相机，检查眼底是否存在

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科研

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工程

新型光声显微镜与光学相干层析成像在活兔眼中的双模脉络成像

光声眼科成像（PAOM）是一种基于光学吸收的成像技术，可为当前可用的眼科成像技术提供互补的视网膜评估。我们报道了将PAOM与谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）结合，用于大鼠视网膜的同步多模态成像。...

集成光声眼底显微术与谱域光学相干断层扫描

来源： Jagodzinska, J., et. al.，活体小鼠视网膜神经节细胞的光学相干断层扫描成像。 J. Vis. Exp. (2017)...

使用光学相干断层扫描技术对小鼠视网膜进行活体成像

本文描述了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对小鼠视网膜进行活体成像的实验方案。重点针对视乳头周围区域的视网膜神经节细胞（RGC），介绍了多种扫描与定量分析方法。...

光学相干断层扫描：活体成像小鼠视网膜神经节细胞 In Vivo

本方案描述了如何利用眼科成像平台系统，在小鼠等小型啮齿类动物中应用谱域光学相干断层扫描和扫描激光检眼镜等高分辨率成像技术，分别获取视网膜厚度和小胶质细胞分布的信息。...

体内成像携带 Cx3cr1gfp/gfp 报告基因小鼠的谱域光学相干断层扫描与扫描激光检眼镜技术

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本文介绍了一种利用新型多模态成像平台获取大视野（FOV）三维（3D）荧光与光学相干断层扫描（OCT）视网膜图像的实验方案。我们将阐述系统配置、对准方法及操作流程。 在体 将演示成像过程，并提供代表性结果。...

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本文介绍了使用谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）在视网膜变性、青光眼、糖尿病性视网膜病变和近视等模型中活体可视化视网膜及眼部结构的方法。...

利用光学相干断层扫描对啮齿类动物模型中眼部疾病的体内结构评估

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

光学相干断层扫描在小鼠视网膜病变模型中的应用

本方案描述了一种获取高质量兔眼整体冷冻切片的可靠方法。文中详细介绍了兔眼的解剖、固定、包埋和切片步骤，这些方法可轻松适用于任何利用免疫组织化学技术研究较大眼球的实验。...

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学习光声显微镜与光学相干层析成像双模态技术，实现活兔眼脉络膜视网膜的无创、无标记成像。该方法可解析血氧饱和度、血液分布及黑色素分布，为眼科疾病研究提供高分辨率成像手段。

活体兔眼脉络膜视网膜新型光声显微与光学相干断层扫描双模态成像

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