Name: 小鼠嗅觉学习和鉴别的客观和可重复性试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习小鼠嗅觉联想学习行为学实验方法，通过气味与奖惩关联训练研究神经可塑性与感觉辨别机制。该方案支持高通量数据采集，为神经退行性疾病研究提供可靠的行为学分析工具。

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本方案改编自本实验室先前的研究工作（Huang 等8）。此处描述的所有方法均已获得贝勒医学院动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。本研究由麦克奈尔医学研究所、NINDS资助项目R01NS078294（B.R.A.）、NIH智力与发育障碍研究中心（IDDRC）资助项目U54HD083092、NIDDK资助项目F30DK112571（JMP）以及NINDS资助项目F31NS092435（CKM）支持。

所有小鼠的使用均遵循贝勒医学院机构动物照护与使用委员会批准的方案，并符合美国国立卫生研究院（NIH）标准。本方案中使用的小鼠均为成年小鼠（&#62;6 周龄），背景品系为 C57BL6/j，包括雄性和雌性小鼠。完成训练/分期任务后，小鼠被放回其原代饲养笼中。
1. 操作性学习箱的构建与使用通则（图1B, C）
<ol>
	<li>组装带有舱底的小鼠实验舱。将训练箱放置在人员走动较少、光线较暗的区域，以避免干扰。</li>
	<li>在每个出水口顶部钻一个小孔，以便18号针头将水注入出水口内。</li>
	<li>将溶于矿物油中的气味剂加入玻璃小瓶中（每周更换一次），并拧紧瓶盖。</li>
	<li>将18号针头连接至硅胶管，用该针头刺穿玻璃小瓶的瓶盖，并将硅胶管另一端连接至气味出气口的进气端。</li>
	<li>将每根硅胶管插入一个气味阀门中。</li>
	<li>将真空管路连接至气味出气口。</li>
	<li>将两个10 mL注射器固定在金属支架杆上，并通过管路连接注射器，管路另一端连接18 G针头。将针头插入小鼠实验舱鼻触口上预先钻好的孔中，再将管路的另一端连接至供水阀门。</li>
	<li>用啮齿类动物饮用水填充两个10 mL注射器。</li>
	<li>将空气流量计连接至进气口，并将气流维持在3–5 L/min。</li>
	<li>将两个供水阀门、两个气味阀门、两个出水口、一个气味出气口以及电源连接至USB接口系统。将所有阀门连接至“输出”端口，所有气味和出水口连接至“输入”端口。将所有设备连接至USB接口盒的电源输出端，最后将USB接口盒连接至电源。</li>
	<li>调节真空吸力，以避免不同试验之间的气味交叉污染。</li>
	<li>使用特定于气味的管路将气味剂小瓶连接至实验舱。</li>
</ol>
2. 小鼠准备：1–3 天
<ol>
	<li>将小鼠分为3组：对照组（无需嗅觉训练）、伪训练组（随机给予奖励或惩罚的小鼠）和训练组。将伪训练组小鼠暴露于训练箱和气味递送环境中，但不进行真正的嗅觉训练，因为奖励与惩罚的结果与所递送的气味随机关联。 
	注意：伪训练组小鼠将经历训练范式中的“&#34;Pseudotraining&#34;”阶段。训练组小鼠将完成所有训练阶段。如果实验目的仅为检测气味辨别或学习的行为差异，则伪训练步骤为可选。此处提供的方案在研究者希望探究训练前后神经元差异时加入该组。伪训练组可用于控制被动气味暴露以及与非嗅觉相关训练的影响。</li>
	<li>开始对小鼠进行限水处理，每日供水量为40 mL/kg。避免小鼠体重下降超过其基础体重的20%，以防止动物产生应激（图2A）。</li>
	<li>每日称量小鼠体重，确保其体重保持在基础体重的80%以上。若某只小鼠体重低于此阈值，应将其移出实验并给予自由饮水。</li>
	<li>在整个实验过程中保持所有环境因素恒定，包括温度、噪音和干扰性气味（如人体气味、香水/古龙水/除臭剂的气味）。 
	注意：与所有动物行为测试一样，微小的环境变化可能显著影响实验结果。</li>
</ol>
3. 所有阶段的说明
<ol>
	<li>为以下每个阶段编写训练软件代码。在行为软件上运行该程序。 
	注意：所有阶段的代码均包含在补充代码文件中。20 次试验的数据被组合为一个区块，小鼠的表现将按区块显示。此外，每个阶段可在同一只小鼠上重复进行若干天，直至达到完成标准。</li>
	<li>每天不得让小鼠在行为箱中停留超过 60 分钟。</li>
	<li>在将每只小鼠转移至笼子前，清理笼内排泄物。使用 70% 乙醇喷洒并擦拭实验舱，以尽量减少小鼠气味带来的干扰。</li>
</ol>
4. 训练阶段1：将饮水奖励与中央鼻触行为关联，1–3天
<ol>
	<li>在此阶段，当小鼠探索饮水口时，给予其饮水奖励，使其建立关联。</li>
	<li>训练阶段1编程说明
	<ol>
		<li>将此阶段程序设置为仅使用饮水递送口。每当小鼠进行一次鼻触（nose poke），即给予一次饮水奖励。 
		注意：程序将输出试验的持续时间以及小鼠获得的饮水奖励总次数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伪训练阶段1的编程设置应与训练阶段1相同。</li>
	<li>行为箱配置与小鼠准备
	<ol>
		<li>将行为箱配置为中央设有饮水口，其余侧边孔口均不可进入。将小鼠放入实验舱内，关闭舱门，启动阶段1程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当小鼠在60分钟内完成100次试验时，可认为该阶段已完成。在60分钟结束或完成100次试验后，将小鼠从实验舱中移出（图2B）。 
	注意：由于个体差异，部分小鼠可能天然不愿探索实验箱。</li>
	<li>如需鼓励，可手动向饮水口添加饮水。此阶段可重复最多3天。 
	注意：已完成训练的小鼠可继续重复该阶段，以保持组间一致性并维持液体限制状态。当群体平均达到100次试验/60分钟时，也可将整个群体推进至阶段2，以便所有小鼠能在同一天继续后续训练。</li>
</ol>
5. 训练阶段2：将侧端口的水奖励与中央端口的鼻触建立关联，1–5天
<ol>
	<li>在此阶段，让小鼠将鼻子伸入中央孔，随后立即在侧孔获得水奖励。</li>
	<li>箱体配置与小鼠准备
	<ol>
		<li>将本阶段及后续所有阶段均配置为两侧各有一个水孔，中央为气味输送孔。将小鼠放入实验腔室，关闭腔室门，启动第二阶段程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>训练阶段2的程序设置说明
	<ol>
		<li>当小鼠将鼻子伸入中央气味输送孔后，立即在两侧提供水奖励。本阶段的输出参数应包括单次试验持续时间、已启动的试验次数，以及在鼻触中央孔后5秒内获得的水奖励次数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伪训练阶段2的程序设置与训练阶段2相同。</li>
	<li>当小鼠在60分钟内完成至少40次试验，且至少25%的水奖励在鼻触中央孔后5秒内获得时，可认为本阶段已完成。完成本阶段后将小鼠移出（图2C）。 
	注意：训练程序会自动计算及时获得水奖励的百分比，以判断是否满足本阶段完成标准。尽管不同小鼠完成该阶段的速度存在差异，但大多数小鼠可在5天内达到完成标准。若某只小鼠在5天内未能完成本阶段，则不得进入下一阶段，该小鼠将从实验队列中剔除。</li>
</ol>
6. 训练阶段3：在特定时间窗口内将水分奖励与特定气味关联，1–3天
<ol>
	<li>在此阶段，当小鼠在中央鼻触端进行鼻触时，给予其一个“Go”（S+）气味刺激；随后，若小鼠在5秒内探入侧边饮水端，则给予水奖励。</li>
	<li>训练阶段3的程序设置说明
	<ol>
		<li>在中央气味端释放S+气味。</li>
		<li>若小鼠在气味释放后5秒内探入侧边端口，则给予水奖励。 
		注：程序初始仅要求小鼠在中央端口进行100毫秒的鼻触即可获得水奖励。当小鼠在80%的试验中达到正确鼻触时长后，获得水奖励所需的鼻触持续时间将每次增加50毫秒，直至达到400毫秒。</li>
		<li>将输出参数设置为与阶段2相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伪训练阶段3的程序设置与训练阶段3相同，但不将S+气味连接至气味递送控制器，以确保S+气味不会与水奖励相关联。</li>
	<li>行为箱配置与小鼠准备
	<ol>
		<li>采用与阶段2相同的配置。</li>
		<li>将S+气味连接至气味递送控制器。将小鼠放入实验舱内，关闭舱门并启动阶段3程序。该阶段完成后，将小鼠移出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当60分钟内获得的奖励次数超过60次时，可认为该阶段已完成（图2D）。</li>
</ol>
7. 第4A阶段：关联“禁止”（S-）气味与暂停惩罚，1–2天
<ol>
	<li>在此阶段，向小鼠引入“不反应”气味（S-）。当小鼠闻到“不反应”气味后错误地前往饮水口时，给予其超时惩罚。</li>
	<li>训练阶段4A编程指令
	<ol>
		<li>本阶段开始时仅提供S+气味，与阶段3相同。当小鼠完成40次试验后，开始随机呈现S+和S-两种气味。若小鼠在呈现“不反应”气味后试图获取水奖励，则程序设定2秒的超时惩罚。 
		注意：为帮助区分“反应”与“不反应”，可操控红外侧灯，使其在“反应”气味呈现时开启，在“不反应”气味呈现时关闭。灯光作为辅助线索，帮助小鼠在初期训练中学习。一旦小鼠在有灯光条件下完成训练，应继续在无灯光条件下进行训练，以确认其已真正通过气味学会任务。</li>
		<li>设定输出参数，包括试验的时间长度、启动的试验次数、完成的试验次数、正确率（%）以及获得的总奖励次数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伪训练阶段4A的编程指令与训练阶段4S相同，但S+和S-气味从一开始就随机呈现。无论任务表现如何，随机给予水奖励或超时惩罚。</li>
	<li>箱体配置与小鼠设置
	<ol>
		<li>箱体配置与前一阶段3相同。</li>
		<li>将S+和S-气味均连接至气味递送控制器。将小鼠放入实验舱内，关闭舱门，启动阶段4A程序。小鼠完成40次试验后，切换程序以随机递送气味。本阶段结束后，将小鼠取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当完成40次试验且正确反应率&#62;60%时，可认为本阶段完成。</li>
</ol>
8. 第4B阶段：关联“禁止”（S-）气味与暂停惩罚，5–11天
<ol>
	<li>训练阶段4B编程指令
	<ol>
		<li>使本阶段与阶段4A完全相同，但小鼠在S-气味后尝试获取水奖励时，超时惩罚时间为4秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置伪训练阶段4B的编程指令与阶段4A相同，但水奖励和超时惩罚在每次试验中随机给予。</li>
	<li>行为箱配置与小鼠设置
	<ol>
		<li>将行为箱的配置设置为与前一阶段4A相同。</li>
		<li>将S+和S-气味均连接至气味递送控制器。将一只小鼠放入实验舱内。关闭小鼠实验舱并启动阶段4B程序。当在60分钟内完成&#62;100次试验且准确率&#62;85%时，认为该阶段完成（图2E）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测每节实验中正确率的最大值和最小值，以跟踪每只小鼠在本阶段的进展。约85-90%的小鼠可达到本阶段的完成标准。未能完成本阶段的小鼠应排除在后续Go/No-Go测试阶段之外。</li>
	<li>（可选）在本阶段结束时，进行逆转训练，即在气味瓶平台上交换Go/No-Go气味剂。确保小鼠并非将行为与其它刺激（例如侧端口阀门发出的声音）相关联。</li>
</ol>
9. Go/No-Go 任务测试：每天每只小鼠 20 分钟，持续 1 天
<ol>
	<li>将此阶段视为确定动物识别气味关联的准确性以及学会区分气味对的最终阶段。 
	注意：使用新的气味剂作为S+和S-，以测试动物学会新关联所需的时间。使用结构相似的气味剂配对以增加任务难度。示例包括1-丁醇与1-戊醇、异戊基乙酸酯与异戊基丁酸酯、+香芹酮与-香芹酮。</li>
	<li>编程指令
	<ol>
		<li>让训练软件检测鼻触的持续时间。在中央气味孔设置300毫秒的鼻触以启动任务。</li>
		<li>设置输出参数与阶段4B相同，但不使用任何光引导提示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>箱体配置与小鼠准备
	<ol>
		<li>将箱体配置设置为与前一阶段4B相同。</li>
		<li>将S+和S-气味均连接至气味递送控制器。将一只小鼠放入实验腔内。关闭小鼠实验腔并启动Go/No-Go阶段程序。让已学会嗅觉学习任务的小鼠接触化学结构相似的新气味对。 
		注意：野生型小鼠在接触新气味剂后，经过约10–20个训练区块或200–400次试验，其准确率通常可达&#62;85%（图3A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Becoming+a+new+neuron+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb.</a> Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).</li>
<li>Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+death+of+adult-born+olfactory+bulb+granule+neurons%3A+role+of+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction.</a> J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+sensory+experience-dependent+survival+of+newly+generated+granule+cells+in+the+adult+mouse+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb.</a> PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).</li>
<li>Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+odor+exposure+increases+the+number+of+newborn+neurons+in+the+adult+olfactory+bulb+and+improves+odor+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory.</a> J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).</li>
<li>Arenkiel, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+remodeling+of+olfactory+bulb+microcircuits+revealed+by+monosynaptic+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing.</a> PloS one. 6 (12), 29423(2011).</li>
<li>Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+discrimination+learning+increases+the+survival+of+adult-born+neurons+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).</li>
<li>Quast, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+broadening+of+inhibitory+sensory+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental broadening of inhibitory sensory maps.</a> Nat Neurosci. 20 (2), 189(2017).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Task+learning+promotes+plasticity+of+interneuron+connectivity+maps+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).</li>
<li>Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+odor+discrimination+and+habituation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Testing for odor discrimination and habituation in mice.</a> J Vis Sci. (99), e52615(2015).</li>
<li>Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+measure+olfactory+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Methods to measure olfactory behavior in mice.</a> Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).</li>
<li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb%3A+domain+organization+and+odorant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat Neurosci. 3 (10), 1035(2000).</li>
<li>Cang, J., Isaacson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+whole-cell+recording+of+odor-evoked+synaptic+transmission+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb.</a> J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).</li>
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<li>Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+smell+in+stereo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rats smell in stereo.</a> Science. 311 (5761), 666-670 (2006).</li>
<li>Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+temporal+origins+of+olfactory+bulb+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes.</a> J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).</li>
<li>Sakamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+postnatal+neurogenesis+contributes+to+formation+of+the+olfactory+bulb+neural+circuits+and+flexible+olfactory+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning.</a> J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).</li>
<li>Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical%2C+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat Protoc. 11 (3), 566(2016).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optogenetics+with+multifunctional+flexible+polymer+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers.</a> Nat Neurosci. 20 (4), 612(2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突且无竞争利益。

啮齿类动物的嗅觉系统为研究感觉依赖性可塑性提供了一个独特的模型。本文介绍了一种嗅觉学习范式，用于训练小鼠将特定气味对与奖励或惩罚相关联。通过该学习任务，可在后续实验中研究其下游神经环路的变化（如电生理学、 体内 神经元成像 等等小鼠将学会执行一项简单的气味提示任务，以将饮水奖励与一种气味关联，而将另一种气味与超时惩罚关联。
由于这是一个行为学实验，我们建议在实验组和对照组动物之间保持年龄和性别的均衡分布。必须尽可能保持小鼠之间的条件一致。例如，确保在整个训练过程中由相同人员操作小鼠，并保持光照条件恒定。如果许多小鼠未能按预期完成任务，请确保满足以下条件：（1）尽量保持行为学实验装置处于安静状态。（2）充分进行小鼠的水分剥夺。我们发现，即使经过一整天的水分剥夺，许多小鼠仍无法从第一阶段箱体的中央端口摄入足够的水分以达到完成标准。（3）在每只新小鼠开始实验前，检查气味/供水阀门和管道，确保其位置正确。（4）不同气味剂的挥发性存在差异，因此某些气味剂比其他气味剂蒸发得更快。对于蒸气压较高、更易挥发的气味剂，应每日更换而非每周更换，尤其是在使用较低浓度时...

小鼠嗅球（OB）是气味信息进入中枢神经系统（CNS）的起始部位，为研究依赖经验的结构变化提供了理想的模型。OB神经环路以活动依赖的方式持续整合成年新生神经元。成年新生神经元的前体细胞由侧脑室邻近的脑室下区（subventricular zone）的祖细胞分裂产生1。这些神经前体细胞迁移至OB后，部分存活、分化并作为抑制性颗粒细胞整合入环路，另一部分则发生凋亡2。细胞命运的选择受到嗅觉活动的影响，包括嗅觉学习过程3,4,5,6。在整合完成后，颗粒细胞在为期两周的关键期内发生学习诱导的突触改变7,8。因此，嗅觉学习检测方法有助于研究经验依赖性可塑性如何影响成熟脑环路的结构与功能重组。
本方案提供了一种利用操作性条件反射范式进行嗅觉训练的方法。在此任务中，经饮水剥夺的小鼠被训练将一种气味（目标气味）与奖励关联起来 &#34;开始&#34; 气味）与水奖励关联，而另一种气味（非奖励性气味） &#34;无进展&#34; 气味）并伴随试次超时惩罚。小鼠在2至4周内逐步完成一系列分级训练阶段。训练结束后，小鼠对“Go”或“No-Go”气味表现出明确且对应的行为反应（在Go试次中寻求水奖励，而在No-Go试次中不寻求水奖励）。图1A训练完成后，可进一步使用化学结构相似的气味对小鼠进行挑战，以测试其辨别能力，或将其转入研究嗅觉学习如何改变嗅球结构或功能的实验中。尽管此前已有描述气味辨别任务的相关文献，但大多数方法依赖于主观测量指标，例如在两种气味物质之间嗅探次数的差异。9,10此外，此类任务需要人工评分，同样耗时耗力。本方案中描述的Go/No-Go嗅觉学习任务可提供一种无偏倚、直接的气味辨别与嗅觉学习测量方法。

<table><tbody><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01016</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Thermo Scientific</td><td>86000030</td><td></td></tr><tr><td>18号针头</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>小鼠行为箱</td><td>Med Associates</td><td>ENV-307W</td><td></td></tr><tr><td>行为箱底板</td><td>Med Associates</td><td>ENV-307W-GFW</td><td></td></tr><tr><td>饮水口</td><td>Med Associates</td><td>ENV-313W</td><td>需要两个</td></tr><tr><td>气味刺激装置</td><td>Med Associates</td><td>ENV-275</td><td>包含两个阀门，用于控制气味释放&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>气味输出口</td><td>Med Associates</td><td>ENV-375W-NPP</td><td></td></tr><tr><td>USB接口</td><td>Med Associates</td><td>DIG-703A-USB</td><td></td></tr><tr><td>配备Windows 2000、XP、Vista或7操作系统的台式计算机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流量计</td><td>VWR</td><td>97004-952</td><td></td></tr><tr><td>行为学软件</td><td>Med Associates</td><td>SOF-735</td><td>该软件用于运行各个训练阶段，现已被Med-PC V取代</td></tr><tr><td>数据传输软件</td><td>Med Associates</td><td>SOF-731</td><td>该软件可将数据格式化为Excel文件</td></tr><tr><td>训练编程软件</td><td>Med Associates</td><td>DIG-703A-USB</td><td>该软件用于编程设置各个训练阶段</td></tr><tr><td>饮水控制阀</td><td>Neptune Research</td><td>225P012-11</td><td>该阀门用于控制饮水释放，需要两个</td></tr><tr><td>气味控制阀</td><td>Neptune Research</td><td>360P012-42</td><td>该阀门用于控制气味释放，需要两个</td></tr></tbody></table>

小鼠嗅觉学习与辨别能力的客观可重复检测方法

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

嗅觉是小鼠最主要的感觉方式，影响着许多重要的行为，包括觅食、天敌探测、交配和育幼。尤为重要的是，小鼠可以被训练将新气味与特定行为反应相关联，从而为研究嗅觉环路功能提供线索。本实验方案详细描述了在“Go/No-Go”操作式学习任务中训练小鼠的步骤。在此方法中，小鼠每天接受数百次自动化训练，持续2至4周，之后可利用新的“Go/No-Go”气味对来测试其嗅觉分辨能力，或用于研究气味学习如何改变嗅觉环路的结构或功能。此外，小鼠的嗅球（OB）具有持续整合成年新生神经元的特征。有趣的是，嗅觉学习能够提高这些成年新生神经元的存活率及其突触连接。因此，本方案可与其他生物化学、电生理学和成像技术相结合，用于研究介导神经元存活和可塑性的学习及活动依赖性因素。

小鼠学会嗅觉学习任务后，便能够将新的气味对与奖励或惩罚关联起来。这些经过训练的小鼠在Go/No-Go任务中的初始正确率通常约为50%。可通过试验区块将正确率绘制成新气味对的学习曲线（图3A）。在10个区块的试验内（大多数小鼠完成所需时间少于30分钟），小鼠能够以超过85%的正确率准确区分不同气味（红线）。这表明，我们的实验方案已成功训练野生型小鼠将一种气味与饮水奖励相关联，而将另一种气味与超时惩罚相关联。为了评估两个实验组之间的辨别能力，可进一步分析数据，比较达到85%熟练度所需的试验次数（图3B），或比较达到熟练度后的平均正确率。
小鼠学会该任务后，可通过改变气味对来增加或降低任务难度。例如，降低气味对的浓度可增加任务难度（...

在此，我们通过关联学习任务训练小鼠以测试其气味辨别能力。该方案还可用于研究学习诱导的大脑结构变化。

嗅觉是小鼠的主要感觉模式，影响着许多重要行为，包括觅食、捕食者探测、交配以及……

本行为学实验方案的总体目标是训练小鼠，使其将一种气味与奖励相关联，而将另一种气味与惩罚相关联。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如学习、突触可塑性和感觉辨别。该技术的主要优势在于，小鼠一旦完成训练，可在数小时内完成数百次试验，从而获得可靠的统计学样本量。该技术的应用前景涉及神经退行性疾病的治疗或诊断，因为嗅觉功能障碍的严重程度可预测人类后续的认知能力下降。尽管该方法可用于研究嗅觉，也可应用于其他感觉系统，例如视觉或听觉。对该方法进行可视化演示至关重要，因为行为实验箱的搭建以及软件操作的初始步骤较为复杂，难以掌握，原因在于存在不同的连接端口和训练步骤。首先，组装一个带舱底的小鼠实验舱。将训练箱放置在人员走动较少、光线较暗的区域，以避免干扰。然后，在每个水端口的顶部钻一个小孔，以便18号针头可将水注入端口内。将溶于矿物油中的气味物质加入玻璃小瓶中，并拧紧瓶盖。接着，将18号针头连接到硅胶管上。刺穿玻璃小瓶的瓶盖，并将硅胶管的另一端连接到气味进样口的入口处。然后，将每根硅胶管插入一个气味阀门中。将真空管路连接到气味端口上。将两个10毫升注射器固定在金属支架杆上，并将管路连接至注射器。随后，将管路的另一端连接至一支18号针头。将针头插入小鼠饲养箱鼻触孔板上的钻孔内，并将管路的另一端连接至供水阀。用啮齿类动物饮用水注满两支10毫升注射器。然后将气流计连接到进气口，并将气流维持在每分钟3至5升。将两个水阀、两个气味阀、两个水口、气味口以及电源连接至USB接口系统。最后，将USB接口盒连接至电源。接下来，调节真空吸力以避免不同试验之间的气味交叉污染，并使用特定气味的管路将气味剂小瓶连接到实验舱。为准备小鼠训练，开始以每天每千克体重40毫升的量进行限水。每天称量小鼠体重，确保其体重保持在基础值的80%以上，并在整个实验过程中保持所有环境因素恒定，包括温度、噪音和干扰性气味。每次将小鼠转移至笼具前均需清洁笼具。使用70%乙醇喷洒并擦拭实验舱，以尽量减少小鼠气味带来的干扰。在第一阶段训练中，将行为箱配置为中央设有饮水口，所有侧边孔口均不可进入。将一只小鼠放入实验舱并关闭舱门，然后启动第一阶段程序。当小鼠在60分钟内完成100次试验时，视为该阶段结束。60 分钟后或完成 100 次试验后，将小鼠从实验舱中移出。对于第二阶段训练，将本阶段及后续所有阶段设置为两侧各有一个出水口，中间为气味端口。将一只小鼠放入实验舱内并关闭舱门。然后，开始第二阶段程序。当在60分钟内完成至少40次试验，且至少25%的水奖励在小鼠鼻触中央端口后5秒内给予时，视为该阶段完成。此阶段完成后，移出小鼠。进行第三阶段训练时，将S+气味与气味递送控制器连接。将一只小鼠放入实验舱内并关闭舱门。随后，启动第三阶段程序。当 60 分钟内获得的奖励次数超过 60 次时，视为该阶段完成，并在阶段完成后移除小鼠。进行第四-A 阶段训练时，将箱子的配置设置为与前一第三阶段相同。然后，将 S-plus 和 S-minus 气味均连接至气味递送控制器。将一只小鼠放入实验舱并关闭舱门。然后，启动第四阶段-A程序。当小鼠完成40次试验后，切换程序以随机递送气味。阶段完成后将小鼠移除。对于第四阶段-B训练，该阶段的设置与第四阶段-A完全相同，但小鼠在S-minus气味后尝试获取水奖励时，将受到4秒的超时惩罚。将S-plus和S-minus气味连接至气味递送控制器。将小鼠放入实验舱内。关闭小鼠实验舱，启动第四阶段B程序。当60分钟内完成超过100次试验且准确率超过85%时，视为此阶段完成。对于“执行/不执行”实验，将箱子的配置设置为与前一阶段四-B相同。将S-plus和S-minus两种气味均连接至气味递送控制器，然后将一只小鼠放入实验腔室中。启动阶段性的“-go/不-go”程序，然后让已学会嗅觉学习任务的小鼠接触化学性质相似的新型气味对。小鼠在学会嗅觉学习任务后，能够将新的气味对与奖励或惩罚相关联。这些经过训练的小鼠在“go/no-go”任务中的初始正确率通常约为50%。可以通过试验区块绘制正确率，作为新气味对的学习曲线。在10个区块试验内，小鼠能够正确区分不同气味，准确率超过85%。这表明我们的实验方案已成功训练野生型小鼠将一种气味与饮水奖励相关联，而将另一种气味与时间惩罚（time out）相关联。小鼠学会该任务后，可通过改变气味对来增加或降低任务难度。例如，降低气味对的浓度会增加任务难度。小鼠还能够记住先前学会的气味对。学习任务七天后进行回忆测试，结果显示野生型小鼠能够快速回忆起先前习得的气味关联。在实施该操作时，务必确保目标气味剂已正确连接至行为箱。若多名实验人员使用不同气味时，这一点尤为重要。完成该操作后，还可以进行其他方法，例如气味图谱绘制，以回答更多问题，比如：学习如何影响大脑对感觉信息的表征方式？该技术开发之后，为神经科学领域的研究人员探索小鼠嗅觉系统中由学习引起的神经变化铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何训练小鼠将一种气味与奖励关联，而将另一种气味与惩罚关联。请注意，使用锐利的针头可能具有极高的危险性，在进行此操作时，应始终采取适当的预防措施，例如妥善处理锐器。

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科研

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神经科学

小鼠嗅觉学习和鉴别的客观和可重复性试验

啮齿类动物嗅觉系统具有基本而独特的特性，这使其在生物学研究中受到日益广泛的关注。因此，也需要一种相对简单的功能评估方法。本文描述了用于表征小鼠嗅觉敏感性和偏好的高灵敏度检测方法。...

成年小鼠的嗅觉行为测试

嗅觉功能障碍是多种神经退行性疾病（包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病）的常见特征。本文介绍了一组用于评估小鼠嗅觉辨别和嗅觉检测能力的测试方法，可用于测量神经退行性疾病小鼠模型中的嗅觉功能。...

神经退行性疾病小鼠模型的嗅觉检测方法

本文描述了一种用于检测啮齿类动物嗅觉系统的方法。通过嗅觉习惯化/去习惯化实验，研究人员可以判断小鼠是否对重复呈现的气味产生习惯化，以及在呈现新气味时是否表现出去习惯化反应。...

小鼠气味辨别与习惯化测试

我们介绍一种在小鼠中进行的简单且无偏倚的嗅觉测试。通过该方案，可在单次行为学实验中评估小鼠对新气味与水相比的嗅觉辨别能力、偏好性、回避行为及敏感性。该方法适用于单名实验者操作，数据分析基于计算机辅助的视频处理。...

小鼠简易及计算机辅助嗅觉检测

物体识别实验（ORT）是一种用于评估小鼠学习和记忆能力的简单且高效的检测方法。该方法的具体步骤如下所述。...

小鼠学习与记忆研究中的新物体识别实验

本文详细描述了一种新型的小鼠判断偏倚实验方案。同时展示了该嗅觉挖掘任务对情绪状态敏感性的证据，并讨论了其在不同研究领域的应用价值。...

通过嗅觉挖掘任务评估小鼠的判断偏差

本文详细描述了埋藏食物测试和社会气味辨别实验，以评估吸入性环境污染物暴露对小鼠嗅觉功能的影响。...

研究吸入性环境污染物对小鼠嗅觉功能的影响

本方案描述了用于“选择/不选择”嗅觉行为实验的嗅觉仪的构建方法。提供了分步操作说明及相应图片，以确保嗅觉仪的成功搭建。同时包含了在构建过程中可能遇到问题的故障排除信息。...

构建用于啮齿类动物嗅觉行为研究的嗅觉仪

本文介绍了一种嗅觉偏好测试方案，可用于评估抑郁小鼠模型对具有吸引力和厌恶性气味刺激的负面嗅觉偏向。...

一种用于测量抑郁小鼠模型中嗅觉享乐偏好的嗅觉偏好测试

小鼠使用拉什利III型迷宫进行低应激路线学习

学习小鼠嗅觉联想学习行为学实验方法，通过气味与奖惩关联训练研究神经可塑性与感觉辨别机制。该方案支持高通量数据采集，为神经退行性疾病研究提供可靠的行为学分析工具。

小鼠嗅觉学习与辨别能力的客观可重复检测方法

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