小鼠嗅觉学习与辨别能力的客观可重复检测方法

本行为学实验方案的总体目标是训练小鼠，使其将一种气味与奖励相关联，而将另一种气味与惩罚相关联。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如学习、突触可塑性和感觉辨别。该技术的主要优势在于，小鼠一旦完成训练，可在数小时内完成数百次试验，从而获得可靠的统计学样本量。

该技术的应用前景涉及神经退行性疾病的治疗或诊断，因为嗅觉功能障碍的严重程度可预测人类后续的认知能力下降。尽管该方法可用于研究嗅觉，也可应用于其他感觉系统，例如视觉或听觉。对该方法进行可视化演示至关重要，因为行为实验箱的搭建以及软件操作的初始步骤较为复杂，难以掌握，原因在于存在不同的连接端口和训练步骤。

首先，组装一个带舱底的小鼠实验舱。将训练箱放置在人员走动较少、光线较暗的区域，以避免干扰。然后，在每个水端口的顶部钻一个小孔，以便18号针头可将水注入端口内。

将溶于矿物油中的气味物质加入玻璃小瓶中，并拧紧瓶盖。接着，将18号针头连接到硅胶管上。刺穿玻璃小瓶的瓶盖，并将硅胶管的另一端连接到气味进样口的入口处。

然后，将每根硅胶管插入一个气味阀门中。将真空管路连接到气味端口上。将两个10毫升注射器固定在金属支架杆上，并将管路连接至注射器。

随后，将管路的另一端连接至一支18号针头。将针头插入小鼠饲养箱鼻触孔板上的钻孔内，并将管路的另一端连接至供水阀。用啮齿类动物饮用水注满两支10毫升注射器。

然后将气流计连接到进气口，并将气流维持在每分钟3至5升。将两个水阀、两个气味阀、两个水口、气味口以及电源连接至USB接口系统。最后，将USB接口盒连接至电源。

接下来，调节真空吸力以避免不同试验之间的气味交叉污染，并使用特定气味的管路将气味剂小瓶连接到实验舱。为准备小鼠训练，开始以每天每千克体重40毫升的量进行限水。每天称量小鼠体重，确保其体重保持在基础值的80%以上，并在整个实验过程中保持所有环境因素恒定，包括温度、噪音和干扰性气味。

每次将小鼠转移至笼具前均需清洁笼具。使用70%乙醇喷洒并擦拭实验舱，以尽量减少小鼠气味带来的干扰。在第一阶段训练中，将行为箱配置为中央设有饮水口，所有侧边孔口均不可进入。

将一只小鼠放入实验舱并关闭舱门，然后启动第一阶段程序。当小鼠在60分钟内完成100次试验时，视为该阶段结束。

60 分钟后或完成 100 次试验后，将小鼠从实验舱中移出。对于第二阶段训练，将本阶段及后续所有阶段设置为两侧各有一个出水口，中间为气味端口。将一只小鼠放入实验舱内并关闭舱门。

然后，开始第二阶段程序。当在60分钟内完成至少40次试验，且至少25%的水奖励在小鼠鼻触中央端口后5秒内给予时，视为该阶段完成。此阶段完成后，移出小鼠。

进行第三阶段训练时，将S+气味与气味递送控制器连接。将一只小鼠放入实验舱内并关闭舱门。随后，启动第三阶段程序。

当 60 分钟内获得的奖励次数超过 60 次时，视为该阶段完成，并在阶段完成后移除小鼠。进行第四-A 阶段训练时，将箱子的配置设置为与前一第三阶段相同。然后，将 S-plus 和 S-minus 气味均连接至气味递送控制器。

将一只小鼠放入实验舱并关闭舱门。然后，启动第四阶段-A程序。当小鼠完成40次试验后，切换程序以随机递送气味。

阶段完成后将小鼠移除。对于第四阶段-B训练，该阶段的设置与第四阶段-A完全相同，但小鼠在S-minus气味后尝试获取水奖励时，将受到4秒的超时惩罚。

将S-plus和S-minus气味连接至气味递送控制器。将小鼠放入实验舱内。关闭小鼠实验舱，启动第四阶段B程序。

当60分钟内完成超过100次试验且准确率超过85%时，视为此阶段完成。对于“执行/不执行”实验，将箱子的配置设置为与前一阶段四-B相同。将S-plus和S-minus两种气味均连接至气味递送控制器，然后将一只小鼠放入实验腔室中。

启动阶段性的“-go/不-go”程序，然后让已学会嗅觉学习任务的小鼠接触化学性质相似的新型气味对。小鼠在学会嗅觉学习任务后，能够将新的气味对与奖励或惩罚相关联。这些经过训练的小鼠在“go/no-go”任务中的初始正确率通常约为50%。

可以通过试验区块绘制正确率，作为新气味对的学习曲线。在10个区块试验内，小鼠能够正确区分不同气味，准确率超过85%。这表明我们的实验方案已成功训练野生型小鼠将一种气味与饮水奖励相关联，而将另一种气味与时间惩罚（time out）相关联。

小鼠学会该任务后，可通过改变气味对来增加或降低任务难度。例如，降低气味对的浓度会增加任务难度。小鼠还能够记住先前学会的气味对。

学习任务七天后进行回忆测试，结果显示野生型小鼠能够快速回忆起先前习得的气味关联。在实施该操作时，务必确保目标气味剂已正确连接至行为箱。若多名实验人员使用不同气味时，这一点尤为重要。

完成该操作后，还可以进行其他方法，例如气味图谱绘制，以回答更多问题，比如：学习如何影响大脑对感觉信息的表征方式？该技术开发之后，为神经科学领域的研究人员探索小鼠嗅觉系统中由学习引起的神经变化铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何训练小鼠将一种气味与奖励关联，而将另一种气味与惩罚关联。

请注意，使用锐利的针头可能具有极高的危险性，在进行此操作时，应始终采取适当的预防措施，例如妥善处理锐器。