Name: 细胞间相互作用中基因表达模式的控制与分析的 Optogenetic 方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解光遗传学控制与实时监测基因表达动态的方法，用于研究C2C12细胞间振荡信息传递。该技术可精确操控Notch信号通路，揭示多细胞系统中细胞通讯的分子机制。

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本工作得到了以下资助：日本科学技术振兴机构（JST）先驱性研究项目（PRESTO）（A.I.）、核心研究推进计划（CREST）（JPMJCR12W2（R.K.））、文部科学省（MEXT，日本）创新科学领域研究专项基金（26119708（A.I.）和16H06480（R.K.））、日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（A类）（24240049（R.K.））以及青年科学家（A类）项目（15H05326（A.I.））、文部科学省（MEXT，日本）创新科学领域研究专项基金“&#34;荧光活体成像&#34;”，以及来自文部科学省（MEXT，日本）的“生命系统动态研究平台”项目支持。

1. 利用 Tol2 系统生成稳定细胞系
<ol>
	<li>将基于 Tol2 的光遗传学模块质粒载体（图 1A）与转座酶（Tol2）表达载体（pCAGGS-mT2TP）共同转染至 C2C12 细胞中。所有步骤中，除非另有说明，均使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的 DMEM 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下培养细胞（表 1）。
	<ol>
		<li>用细胞计数仪对胰酶消化后的细胞进行计数，于转染前一天在 12 孔板中每孔接种 5 × 104 个 C2C12 细胞。</li>
		<li>使用脂质体转染试剂，共转染 0.375 μg 基于 Tol2 的光遗传学载体（pAI177 或 pAI218）、0.125 μg 药物筛选载体（pAI170）以及 0.5 μg 的 pCAGGS-mT2TP 载体。</li>
		<li>转染后一天，将转染的细胞进行胰酶消化，并接种至 100 mm 培养皿中。</li>
		<li>将转染细胞的培养基更换为添加了 100 mg/mL 潮霉素的培养基。</li>
		<li>继续培养细胞 3 天以清除未转染的细胞。注意：此期间无需更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将转染后的细胞进行胰酶消化，并通过荧光蛋白表达筛选纯化细胞群体。对于携带 pAI177 的受体细胞，设定分选门控至 Green-PE 通道，以纯化 mCherry 阳性细胞群体；对于携带 pAI218 的光敏感供体细胞，设定分选门控至 APC 通道，以纯化 iRFP713 阳性细胞群体。</li>
	<li>（可选）通过标准方法建立单克隆细胞群体，例如有限稀释法或流式细胞术单细胞分选（FACS）。</li>
</ol>
2. 群体水平上工程细胞光敏感性的评估
注意：本部分描述了一种通过生化实验（如定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹）检测蓝光照射下 Dll1 配体蛋白动态诱导的实验方案。
<ol>
	<li>设置两种类型的培养箱，分别配备或不配备光源，用于光照条件或黑暗条件。使用光度计设置蓝光LED透射仪的光照强度，如图1B所示，并通过向单板微控制器加载控制脚本，设定光照的时间和持续时长，以实现可编程的光照周期（图1C）。</li>
	<li>使用细胞计数器对胰酶消化后的细胞进行计数，并将1.0 × 105个携带pAI218和pAI170的光敏供体细胞接种于直径35 mm的塑料培养皿中（光照条件至少12个培养皿，黑暗条件1个培养皿），并将培养皿分别置于对应光照或黑暗条件的培养箱中。接种完成后，直至收集细胞裂解液前，保持培养箱门关闭。</li>
	<li>接种后约1.5天开始光照处理（此时细胞融合度预计超过80%）。避免将细胞暴露于光照下，以防发生非预期的光刺激。 
	注意：光照程序应根据实验目的进行调整。持续光照条件（例如，持续1分钟，间隔10分钟，光照强度为40 µmol/m2/s）足以初步检测光诱导效果；强光照射对细胞有害，因此应确保选择对细胞无害的光照参数。</li>
	<li>接种后约2天，以30分钟为间隔制备细胞裂解液。将样品培养皿从培养箱中取出后立即置于冰上，并开始制备细胞裂解液用于后续分析。</li>
</ol>
3. 群体水平上的动态发送-接收检测：通过光电倍增管对细胞在光刺激下的实时响应进行监测
<ol>
	<li>采用标准方法对供体细胞和受体细胞进行胰酶消化并计数。制备总体积为1 mL的混合悬液，其中包含2.5 × 104个受体细胞和1.25 × 105个供体细胞（比例为1:5）。 
	注：供体与受体细胞比例为2:1、1:1或1:2时也可行，总细胞数为1.5 × 105。10</li>
	<li>将混合后的细胞接种至含1 mM荧光素的培养基的24孔黑色培养板中，每孔加一孔。</li>
	<li>使用酶标仪进行荧光素酶检测分析，并确认输出信号未超出记录系统的检测上限。 
	注：若输出信号高于1 × 106 光子数/秒，可能出现信号饱和。此时应降低荧光素浓度至最佳水平，使输出信号低于1 × 106 光子数/秒。</li>
	<li>将培养板置于记录系统上，启动记录程序（图1D）。例如，在开始记录后18小时启动光照。 
	注：时间滤波方法（如使用移动平均法或Savitzky-Golay滤波法对信号进行去趋势处理）有助于波形可视化和峰位检测。</li>
</ol>
4. 单细胞水平的动态发送-接收实验：在光遗传学扰动控制下对单细胞响应进行实时成像
<ol>
	<li>将0.5 × 105个受体细胞和2.5 × 105个供体细胞接种至直径为35 mm、底部为27 mm玻璃的培养皿中。确保细胞混合比例及总细胞数量（细胞密度）已正确调整。</li>
	<li>接种后一天，更换为2 mL记录培养基（含5% FBS、青霉素-链霉素和1 mM荧光素的酚红-free DMEM培养基），并将玻璃底培养皿置于显微镜载物台上。如有必要，用PBS (-) 洗去死亡细胞碎片。 
	注意：建议在避光条件下进行此步骤。</li>
	<li>设置配备环境控制腔的倒置显微镜，维持37 °C和5% CO2的培养条件。</li>
	<li>设置冷却CCD相机。确保CCD传感器温度已降至设定值（通常为-90 °C）。</li>
	<li>在自动采集软件中设置“&#34;多维延时成像&#34;”窗口参数，以实现每5分钟采集一次图像，连续采集超过288次（超过一个晚上的记录时间）。
	<ol>
		<li>打开“&#34;多维延时成像&#34;”窗口，从下拉菜单中选择发光通道和慢速50 kHz读出模式，并设置4 × 4 binning及4分钟曝光时间。确保读出模式设为慢速50 kHz模式，这对降低读出噪声、检测微弱的生物发光信号至关重要。</li>
		<li>打开“&#34;多维延时成像&#34;”窗口，从下拉菜单中选择荧光通道和快速1 MHz读出模式，并设置2 × 2 binning及400 ms曝光时间。确保读出模式设为快速1 MHz模式，以缩短荧光成像所需时间。</li>
		<li>点击“&#34;采集&#34;”按钮，开始延时记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过图像分析软件从延时视频中提取发光通道的单细胞信号轨迹，步骤如下：首先，将图像数据导入图像分析软件，生成发光和荧光的图像序列堆栈。对于发光图像，通过比较时间相邻帧中像素的强度，识别并去除由宇宙射线引起的热点像素，将这些像素值替换为前后帧对应位置像素强度的时间平均值（该操作在软件中实现为“&#34;SpikeNoise Filter&#34;”），然后对处理后的图像应用空间平滑滤波器，并从每帧中减去视野外区域的背景像素值。随后，在每个时间点的荧光图像上确定每个细胞的“&#34;感兴趣区域&#34;”（ROI），将该ROI应用于对应的发光图像，并测量每个ROI的发光强度。</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
<li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li>
<li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141(2012).</li>
<li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们展示了一种控制基因表达动态的方法，其周期为2至3小时。这一时间尺度远短于其他传统系统（包括Tet-On系统和原始的LightOn系统）中的时间尺度。实现这种超昼夜节律时间尺度的关键参数是光诱导分子产物、mRNA和蛋白质的半衰期。这些动力学参数可能依赖于细胞类型和物种。为了调节动力学特性，用其他序列替换Hes1的3'非翻译区（3'UTR）是一种直接有效的方法，因为该方法不会改变目标蛋白的序列和功能。为了在特定感兴趣的细胞中获得理想的脉冲表达模式而筛选其他3'UTR序列时，通过光照诱导对dLuc进行活细胞实时监测是一个良好的起点，可用于筛选和验证。
最常被问到的问题之一是关于光敏细胞的日常操作。在Notch信号通路的动态发送-接收检测中，我们能够在室内光线下进行每日的细胞传代，因为我们的系统（光诱导型dLuc或Dll1细胞以及接收细胞）不会改变细胞增殖，并且在细胞转移至黑暗环境后6小时内迅速恢复到静息状态。如果目标基因为细胞命运决定因子，渗漏表达可能诱导细胞分化或阻碍细胞扩增，因此在细胞操作过程中建立红光环境至关重要，以避免不必要的光遗传学干扰。
<p class="jov...

细胞间的通讯在发育过程中胚胎图式形成中起着至关重要的作用。在脊椎动物胚胎中，称为体节的节段性结构在体轴的前后方向上以精确的时间准确性形成，这一过程受一种称为“体节化时钟”的计时机制调控1。在此过程中，一群原节中胚层（PSM）细胞会以同步的方式周期性地转化为体节。该过程涉及基因表达的同步振荡，处于同相振荡的PSM细胞将形成同一个体节。在小鼠中，基因振荡的周期约为2至3小时，在斑马鱼中则约为30分钟。当PSM细胞被分离后，其振荡同步性会丧失2,3；但当它们重新聚集时，能够自我组织并恢复群体的同步性4，这表明细胞间的耦合是实现同步振荡的关键。
大量研究发现，Delta-Notch 信号通路中的信号分子与体节时钟基因的同步振荡密切相关。无论是使用药理学抑制剂还是Notch信号通路的基因突变，都会导致振荡器群体失去同步性。在斑马鱼中，Notch信号通路组分（如DeltaC、DeltaD和Notch1a）的突变体会表现出异步振荡5,6。在鸡或小鼠胚胎中，不仅Notch配体Delta样蛋白1（Dll1），而且Notch调节因子Lunatic fringe（Lfng）也是实现同步振荡所必需的7,8,9。然而，由于传统基因调控动态扰动的时间分辨率不足以研究时间尺度为2–3小时（超昼夜节律）的过程，因此很难检验这些分子在细胞间动态信息传递中的功能作用。
我们最近开发了一种整合方法，用于控制和监测哺乳动物细胞中的基因表达模式10。该技术能够通过在超昼夜时间尺度上进行周期性光照，诱导基因表达脉冲。本实验方案介绍了建立光敏细胞系的方法，并通过活细胞生物发光监测，观察报告细胞在细胞间通讯背景下的动态响应。该方法适用于分析许多其他信号通路。

<table><tbody><tr><td>流式细胞仪</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>光电倍增管设备</td><td>Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>蓝色LED照明器</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24（黑色24孔板）</td><td>Hi-tech</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>光度计</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A</td><td></td></tr><tr><td>抗HA-辣根过氧化物酶抗体</td><td>Roche</td><td>克隆 3F10</td><td></td></tr><tr><td>抗肌动蛋白-辣根过氧化物酶抗体</td><td>Wako</td><td>克隆 2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

一种控制和分析细胞间相互作用中基因表达模式的光遗传学方法

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

细胞应能对受周围细胞多种因素影响的时变环境做出适当响应。Notch 信号通路是介导细胞间通讯的关键分子机制之一，在胚胎正常发育过程中发挥重要作用。该通路涉及具有超昼夜节律的振荡信息在细胞间的传递，但尽管分子生物学技术已取得进展，阐明多细胞相互作用对振荡基因动态的影响仍具挑战性。本文介绍了一种可实现光遗传学控制并以精确时间分辨率实时监测基因表达模式的实验方案。该方法成功揭示了Notch信号的细胞内和细胞间周期性输入可通过频率调谐和相位移动，在单细胞水平上同步内在的振荡行为。该策略适用于分析多种信号通路的动态特征，为研究多细胞系统中基因表达程序的动态功能意义提供了独特的平台。

我们改进了LightOn系统11,12，该系统可实现哺乳动物细胞中光诱导的基因表达，用于研究周期为2至3小时的遗传振荡器。该系统包含两个部分：光诱导型转录激活因子hGAVPO和一个UAS启动子盒，用于驱动任意目的基因的转录。为了加快光诱导基因表达的脉冲动力学，UAS启动子盒中的polyA序列被小鼠Hes1的3'非翻译区（3'UTR）取代，从而使mRNA半衰期在小鼠成纤维细胞中缩短至20分钟。
为建立稳定细胞系，采用了基于Tol2转座酶系统的三顺反子载体13（图1A）。Tol2表达载体对于提高质粒盒在染色体上的整合效率至关重要14。这些载体不仅携带由UAS启动子驱动的光诱导基因表达盒，...

本文介绍了一种通过光遗传学控制和活细胞监测基因表达来分析细胞间振荡信息传递的实验方案。该方法为在多细胞系统中检验动态基因表达程序的功能意义提供了独特的研究平台。

细胞应对外界环境的时间变化做出恰当响应，而这些环境变化受到邻近细胞多种因素的影响。Notch 信号通路……

本实验的总体目标是通过光遗传学控制和基因表达的实时监测，观察细胞间振荡信息的传递。该方法有助于解答关于细胞如何通过Notch信号通路相互交流的关键问题，特别是细胞如何将振荡信息传递给彼此。该技术的主要优势在于，我们能够以极高的精度控制并监测基因表达的动态过程。演示该实验步骤的是来自我实验室的研究员Akihiro Isomura，他开发了这项新技术。为了将基于Tol2的光遗传学模块的质粒载体与转座酶表达载体共同转染到C2C12细胞中，首先使用细胞计数仪对胰蛋白酶消化后的细胞进行计数。在转染前一天，将50,000个C2C12细胞接种至12孔板的每个孔中。随后，使用脂质体转染试剂共转染0.375微克基于Tol2的光遗传学载体、0.125微克药物筛选载体以及0.5微克转座酶表达载体。转染后一天，用胰蛋白酶消化转染的细胞，并将其接种至100毫米的培养皿中。将转染细胞的培养基更换为添加了100毫克/毫升潮霉素的培养基。培养细胞三天，以清除未转染的细胞。注意，此过程中无需更换培养基。接下来，用胰蛋白酶消化转染后的细胞，并通过分选受体细胞和光敏细胞，富集表达荧光蛋白的细胞群体，具体操作详见文本方案。设置两种类型的培养箱，一种带光源，一种不带光源，分别用于光照条件或黑暗条件。使用照度计设定蓝色LED透射光源的光照强度。关闭门后测量光照强度。通过向单片机加载控制脚本，实现对光照程序的时间安排和持续时间的编程控制，从而设定可编程的光照时间表。使用细胞计数器对胰蛋白酶消化后的细胞进行计数，并将100,000个携带pAI218和pAI170的光敏感供体细胞接种至直径为35毫米的塑料培养皿中。将培养皿分别置于黑暗和光照条件的独立培养箱中。接种细胞后，应保持培养箱门关闭，直至收集细胞裂解物。接种后一天半开始进行光照。避免细胞暴露于不受控的光照下，以防止产生不必要的光刺激。因此，请在不打开门的情况下执行此步骤。注意，此处打开门仅用于演示。接种后约两天，以30分钟为间隔，将样本培养皿从培养箱转移至冰上，并开始制备细胞裂解液以进行后续分析。为了实时监测PMT光刺激下细胞的响应，首先使用标准方法对发送细胞和接收细胞进行胰蛋白酶消化并计数。制备总体积为1毫升的细胞悬液，其中包含25,000个接收细胞和125,000个发送细胞。将混合后的细胞接种至24孔黑色培养板的每个孔中，培养基中需含有1毫摩尔的荧光素。使用酶标仪对细胞进行荧光素酶检测分析，以确认输出信号不会超出记录系统的检测范围。接着，将培养板放置于记录系统中，并启动记录程序。例如，在设置记录后18小时开始光照。为了在光遗传学扰动控制下对单细胞反应进行实时成像，首先将50,000个接收细胞和250,000个发送细胞接种到直径为27毫米的玻璃底、直径为35毫米的培养皿中。确保混合比例和总细胞数量已正确调整。接种后一天，用两毫升记录培养基更换原有培养基。将玻璃底培养皿置于配备有环境控制舱的倒置显微镜上，环境控制舱设置为37摄氏度和5%二氧化碳。连接冷却式CCD相机，并确保CCD传感器的温度已降至设定值。在自动采集软件中设置多维延时成像窗口的参数，以每5分钟一次的间隔采集图像，总采集次数超过288次。在多维延时成像窗口中选择一个发光通道。确保读出模式设置为慢速50千赫兹读出模式，这对于降低读出噪声以检测微弱的生物发光信号至关重要。在多维延时成像窗口中，选择荧光通道。确保将读出模式设置为快速的1兆赫兹模式，以减少荧光成像所需时间。最后，设置2×2 binning，曝光时间为400毫秒。接下来，选择一个日志选项卡，以设置周期性蓝光照射刺激细胞的时间表。点击加号按钮以添加新的日志设置。从日志框中选择一个日志文件，选择多个时间点，并在初始点和间隔框中设置数值，以安排刺激程序。确保指定的期刊文件包含用于选择照明、打开快门、延迟、关闭快门和再次延迟的顺序化实验步骤。接下来，设置定时程序，以周期性的蓝光照射刺激细胞。最后，单击“采集”按钮开始延时记录。最后，按照文本方案所述，从延时录像中提取发光信号通道的单细胞轨迹。此处展示了光遗传学发送-接收实验的代表性结果。在周期性蓝光照射下，光诱导型发送细胞产生了预期的Delta配体表达振荡模式。当受体细胞与光敏的供体细胞共培养并暴露于重复的光照刺激时，实时生物发光记录系统可检测受体细胞在不同混合比例条件下的周期性响应。此外，结合重复光照的延时显微成像技术也揭示了受体细胞在单细胞水平上的同步响应。该技术建立后，为细胞生物学领域的研究人员探索基因表达的动态信息如何在细胞间相互作用中传递开辟了新途径。

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遗传学

细胞间相互作用中基因表达模式的控制与分析的 Optogenetic 方法

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内...

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

光遗传学已成为行为神经科学研究中的一种强大工具。本方案提供了激光系统设计与搭建的逐步指南，并给出了进行多重且同步实验操作的完整方案 体内...

in vivo 光遗传学刺激啮齿类动物中枢神经系统

本方案提供了一种工作流程，介绍如何将人工微小RNA介导的RNA干扰与光遗传学技术相结合，以特异性刺激完整神经环路中选择性基因表达降低的突触前终末。...

结合光遗传学与人工微小RNA技术在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要对光遗传学方法进行标准化。为实现这一目标，本研究以负反馈光遗传学基因回路为案例，提出了一套标准化研究光诱导基因表达的流程，包括基因回路构建、细胞工程、光遗传学设备操作以及验证性检测方法。...

在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

生物发光是指荧光素酶氧化小分子底物（荧光素）所发出的光，可用于激活光感应蛋白，从而为光刺激增加一个新的维度，并能够在时间和空间尺度上调控细胞中多种由光介导的功能。...

生物发光光遗传学2.0：利用生物发光激活光感受蛋白 体外 和 体内

光遗传学对微生物代谢的控制为发酵过程提供了灵活的动态调控手段。本方案展示了如何在不同体积规模下建立蓝光调控的发酵系统，用于化学品和蛋白质的生产。...

光控发酵用于微生物化学品与蛋白质生产

本方案涉及转染cAMP传感器和一种光遗传学蛋白bPAC-nLuc，以精确追踪其在细胞内的分布及对光刺激的响应。利用点扫描系统构建cAMP响应图谱的创新方法，有望推动光遗传学蛋白在不同研究领域的应用进展。...

使用光刺激网格绘制光遗传学蛋白的细胞分布图

利用光遗传学手段调控信号通路，是研究发育、再生、稳态及疾病过程中信号如何被解码的一种强有力策略。本方案提供了在早期斑马鱼胚胎中使用基于光-氧-电压感应结构域的 Nodal...

斑马鱼胚胎中的光遗传学信号激活

本方案描述了一种工程化的蓝光激活变构开关（LightR）结构域，可用于可逆地进行时空控制蛋白质活性。以Src酪氨酸激酶为模型，本研究提供了开发和表征光调控Src（LightR-Src）的详细方案，并展示了该方法在不同酶类中的广泛适用性。...

通过光遗传变构调控实现蛋白质活性的时空控制

本研究描述了一种利用3D打印LED阵列进行高通量实验的方法，用于优化HEK293T细胞中光诱导基因表达。...

快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

了解光遗传学控制与实时监测基因表达动态的方法，用于研究C2C12细胞间振荡信息传递。该技术可精确操控Notch信号通路，揭示多细胞系统中细胞通讯的分子机制。

一种控制和分析细胞间相互作用中基因表达模式的光遗传学方法

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