Name: 小鼠骨髓胰岛移植的一种方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学习小鼠网膜胰岛移植方法，将分离的胰岛与水凝胶混合后植入糖尿病小鼠网膜囊袋，监测血糖并进行免疫组织化学分析，为1型糖尿病治疗提供新策略。

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本工作的部分作者获得了国家重点研发计划项目资助&amp;中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201412020）、深圳市高水平医学重点学科建设项目基金（2016031638）、深圳市科技计划项目（JCJY20160229204849975，GJHZ20170314171357556，JCYJ20160425110110658）、深圳市卫生和计划生育委员会科研基金（SZXJ2017021）。

本研究中使用的所有小鼠均来自广东省医学实验动物中心。动物使用已获得深圳市第二人民医院伦理审查委员会批准，符合动物福利原则。
1. 胰岛移植至大网膜
注意：本方案需要两人协作完成。
<ol>
	<li>准备表1中列出的手术材料。在手术区域使用无菌布单和一次性无菌材料建立无菌区域，并在整个手术过程中维持无菌条件。对所有手术器械进行灭菌处理，操作人员需穿戴无菌手术衣。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用200 µL移液器吸头挑取胰岛。每只小鼠每次移植接受450–500个胰岛当量（IEQ）。为每只动物将足够一次移植使用的胰岛置于含有100 µL CMRL-1066培养基的无菌1.5 mL离心管中。 
	注意：胰岛可在移植当天分离，但建议在移植前一天分离，以便胰岛从分离过程中恢复。</li>
	<li>将含有胰岛的离心管置于冰上，直至准备进行移植。</li>
	<li>从-20 °C冰箱中取出基底膜基质水凝胶并置于冰上解冻。该水凝胶在4 °C至10 °C时呈液态，在较高温度下会凝固。</li>
	<li>称重并标记所有糖尿病受体小鼠。按60 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠。通过脚趾夹捏测试麻醉深度；若动物有反应，追加10 mg/kg戊巴比妥钠。若无回缩反射，则表明麻醉深度适合手术。</li>
	<li>使用70%乙醇擦拭腹部手术区域，用剃须刀片剃除手术部位毛发，并用碘伏消毒。麻醉期间在小鼠眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。</li>
	<li>使用眼科剪沿腹中线切开4至5 cm切口，打开腹腔。将肠管移向左侧，并用生理盐水浸湿的纱布覆盖，以防止手术过程中过度脱水。</li>
	<li>使用棉签充分暴露胃部视野，定位大网膜（位于胃下方）。使用两把精细镊子牵拉并展开大网膜，注意避免撕裂造成损伤。</li>
	<li>此时水凝胶已完全解冻。将含有胰岛的离心管在200 × g条件下离心30秒，弃去上清液。吸取50 µL水凝胶加入含胰岛的离心管中，轻柔重悬混合物，避免产生气泡。操作过程中保持离心管置于冰上。</li>
	<li>使用两把镊子夹住大网膜边缘，轻轻提起，形成位于胃壁与肠管之间的沟槽，用于容纳含胰岛移植物的少量液体。</li>
	<li>由第二位操作者协助，用200 µL移液器吸头吸取重悬后的胰岛-水凝胶混合物（即管内全部内容物），将其注入沟槽中。</li>
	<li>通过轻微抬高或降低大网膜边缘，确保混合物准确置于沟槽内。在水凝胶因体温作用而凝固前的3分钟内完成定位。水凝胶凝固后，将大网膜折叠覆盖移植物。 
	注意：随着水凝胶的凝固，大网膜将与周围胃壁粘连固定。</li>
	<li>待水凝胶完全凝固后，使用棉签将肠管复位回腹腔，注意避免触碰移植部位。</li>
	<li>向腹腔内加入20 µL头孢菌素（5~10 mg）以预防感染，随后使用4-0缝线关闭腹腔。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，并为每只受体小鼠重复上述所有步骤。保持小鼠体温，并持续观察直至其意识充分恢复，能够维持胸卧位。在完全恢复前，将小鼠与其他动物隔离饲养。</li>
	<li>术后每周每日注射50 µL头孢唑林钠（0.05 mg/mL）作为预防性抗生素。给予布比卡因与布伦诺啡镇痛：即在伤口夹固定前，局部涂抹1-3滴0.25%布比卡因。通过腹腔（IP）途径给予布伦诺啡（0.03 mg/mL溶于无菌0.9%生理盐水，剂量为0.05–0.10 mg/kg）。&#160;</li>
	<li>移植后每日使用血糖仪检测尾静脉血样中的非空腹血糖水平。当移植至大网膜时，胰岛移植物功能可能延迟，完全恢复正常血糖水平可能需要2–3周时间。</li>
	<li>实验结束后，取小鼠大网膜移植物用于组织学分析。根据组织学实验方案固定组织样本，可用于免疫组化或免疫荧光研究。</li>
</ol>
2. 大网膜移植的替代方法
注意：可使用一种在室温下应用的替代性纤维蛋白-凝血酶水凝胶来取代基底膜基质水凝胶。该水凝胶由两种组分构成：纤维蛋白封闭蛋白溶液（50 U/mL 凝血酶和 10 mg/mL 纤维蛋白原）。当这两种组分混合后，会形成凝块，从而将胰岛固定在原位。
<ol>
	<li>在室温下使用纤维蛋白-凝血酶水凝胶复合物。与步骤1.2相同，每只小鼠每次移植将接受450–500个胰岛当量（IEQ）。将胰岛置于含有100 µL CMRL-1066培养基的无菌1.5 mL离心管中。在移植前立即用无菌PE50导管吸取胰岛，导管长度为10 cm，并轻轻离心（200 × g，30秒），形成疏松的沉淀。</li>
	<li>按照上述方法准备动物（步骤1.5–1.8），并将大网膜展开。混合水凝胶组分（每种10 µL），并将其置于大网膜上。（图3D）</li>
	<li>立即将胰岛从导管中排出至水凝胶上。水凝胶会在胰岛周围形成凝块。（图3E）</li>
	<li>将大网膜折叠覆盖在水凝胶和胰岛上，形成一个囊袋。（图3F）随后继续进行步骤1.13至1.18。</li>
</ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+research+and+clinical+practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).</li>
<li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+Induction+Immunotherapy+Promotes+Long-Term+Insulin+Independence+After+Islet+Transplantation+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes.</a> American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).</li>
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<li>Beli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum+to%3A+CX3CR1+deficiency+accelerates+the+development+of+retinopathy+in+a+rodent+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes.</a> J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).</li>
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<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. , (2016).</li>
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<li>Espes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+restoration+of+vascularity+and+oxygenation+in+mouse+and+human+islets+transplanted+to+omentum+may+contribute+to+their+superior+function+compared+to+intraportally+transplanted+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets.</a> American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).</li>
<li>Hajizadeh-Saffar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+VEGF+expression+by+human+embryonic+stem+cell-derived+mesenchymal+stromal+cells+reduces+the+minimal+islet+mass+required+to+reverse+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

通过门静脉将胰岛移植至肝脏是目前人类胰岛移植最常用的方法，但仍存在移植效率与安全性方面的担忧，例如门静脉血栓形成和肝脂肪变性17。近期研究表明，大网膜可能成为肝脏之外的一个合适替代移植部位，但在进入临床转化之前，仍需开展更多研究12,14,18,19。
小鼠是测试网膜作为胰岛移植位点的合适模型。在小鼠体内，网膜位于胃壁下方，通常呈折叠状态。然而，小鼠网膜尺寸较小，且难以操作。为了将其用于移植，需要先轻柔地将其完全展开，待胰岛/水凝胶混合物接种后再将其折叠覆盖。在较大的动物中，网膜组织更为宽大，可通过缝合构建一个或多个 pouch 结构以容纳胰岛。小鼠的网膜较为脆弱，不易承受缝合而不破裂。因此，需使用水凝胶在不缝合的情况下构建 pouch。
<p class="jove_co...

根据国际糖尿病联合会（IDF）的数据，目前糖尿病影响着3.82亿人，预计到2035年将增至5.92亿人1。在同种异体和异种胰岛移植中，均需要系统性免疫抑制治疗。若不进行免疫抑制，免疫排斥是移植物丢失的主要原因2。此外，由于即时血液介导的炎症反应（IBMIR），移植胰岛的丢失也是一个严重问题3,4。然而，即使在无免疫反应的情况下（如在同基因型或自体移植模型中），通过门静脉将胰岛细胞移植至肝脏后，仍会因炎症和/或不利的微环境条件（如血供不足导致的氧合水平降低和/或营养缺乏）而发生细胞丢失5,6。因此，为了确保长期的代谢功能，必须移植更多的胰岛以弥补早期细胞丢失所导致的植入率下降7。
为了优化胰岛移植物的植入效果，研究人员已在实验和临床层面探索了多种替代性解剖位点，结果令人鼓舞，但尚无定论8。尽管部分替代位点具有易于安全操作的特点（例如，皮肤、肾包膜、胃黏膜下层和眼前房），或可为较大体积的胰岛组织提供更广阔的植入面积（例如，腹腔），但移植胰岛的存活率及其生理代谢功能仍受限，仍是当前关注的重点问题9。寻找更适宜的胰岛植入位点的研究仍在持续进行中。
在胰岛移植的早期发展中，大网膜是众多被研究的解剖位点之一，并被证明是胰岛存活的有利环境10,11,12,13,14。然而，由于门静脉内胰岛输注操作相对简便，并且在动物模型中早期取得了成功，该方法逐渐成为临床首选6。此外，在胰岛移植研究初期，该移植位点相关的不利因素——尤其是早期大量胰岛丢失问题——尚未被充分认识，限制作用也较小。随着近年来越来越多的有力证据表明血管内胰岛输注远非理想方案，大网膜正重新被视为细胞移植的一个潜在重要位点。
网膜（以网膜囊的形式）相较于肝脏具有相对优势15,16。网膜血供丰富且易于接触，允许必要时取出移植物和/或进行活检。与肝脏相比，胰岛在此处经历的缺血时间更短，且网膜能够接受相对较大的胰岛移植量，而经门静脉移植则无法实现这一点，因为门静脉压力升高可能引发并发症。
本研究中采用的实验方案使用了同系小鼠移植模型，选用6至8周龄、体重为20–25 g的C57BL/6雄性小鼠。通过腹腔注射250 mg/kg剂量的链脲佐菌素（streptozotocin）一次，使胰岛移植受体小鼠诱导为糖尿病状态。若小鼠在注射后48小时的血糖水平超过24 mmol/L，并且该水平持续至少5天，则可认为糖尿病诱导成功。
采用经改进的既往发表方法，从年龄相匹配的供体胰腺中分离同基因型胰岛。简言之，将胶原酶注射至胆囊而非胆管，此项改进旨在提高注射操作的便捷性。胶原酶灌注后，依次进行孵育、组织解离、密度梯度分离及手工挑选，以获得纯净胰岛。胰岛在移植前于T175培养瓶中用CMRL-1066培养基加10%热灭活胎牛血清（FBS）在37 °C、95%空气-5% CO2条件下培养过夜。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 英寸（12–13 cm）剪刀</td><td>RWD Life Science&amp;nbsp;</td><td>S12030-11</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>RWD Life Science</td><td>F11010-13</td><td></td></tr><tr><td>小型伤口夹</td><td>RWD Life Science</td><td>R33003-01</td><td></td></tr><tr><td>Acutenaculum</td><td>RWD Life Science</td><td>F31044-13</td><td></td></tr><tr><td>两把组织镊</td><td>RWD Life Science</td><td>&amp;nbsp;F13023-10</td><td></td></tr><tr><td>4-0 带针缝线</td><td>Chenghe，中国</td><td>17094</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液器及吸头</td><td>Gilson</td><td>PN11</td><td></td></tr><tr><td>One Touch ultraeasy Basic 血糖监测系统&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>33391713</td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td>Philips</td><td>HC1099/15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料与动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P3761</td><td>用于麻醉&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>水凝胶&amp;nbsp;</td><td>bdbiosciences.com</td><td>356234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>纤维蛋白-凝血酶水凝胶&amp;nbsp;</td><td>Baxter.com</td><td>1501250</td><td>混合后形成凝块</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Yingniu 医疗，安徽，中国</td><td>23170608</td><td></td></tr><tr><td>碘伏</td><td>利尔康医疗科技，山东，中国</td><td>170521</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Baxter.com</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>头孢菌素</td><td>鲁康医疗，山东，中国</td><td>150303</td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林</td><td>Baxter.com</td><td>2G3508</td><td></td></tr><tr><td>润滑性眼膏</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>203964</td><td></td></tr><tr><td>链脲佐菌素</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>V 型胶原酶</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066 培养基</td><td>celltrans，温州，中国</td><td>X018D1</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>10771</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>PE50 导管</td><td>Braintreesci.com</td><td>PE50 100 FT</td><td>聚乙烯 0.023&quot; × 0.038</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>C1359</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigmaaldrich.com</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度化合物（OCT）</td><td>Tissue-Tek；Miles，Naperville，IL</td><td>4583</td><td>包埋介质</td></tr><tr><td>胰岛素抗体</td><td>Cell Signaling Technology，Danvers，MA 01923</td><td>8138S</td><td></td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>Cell Signaling Technology，Danvers，MA 01923</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>伊红染色液</td><td>碧云天生物技术，中国</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 小鼠</td><td>广东省医学实验动物中心</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 扣盖管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr></tbody></table>

一种将胰岛移植至小鼠大网膜的方法

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

胰岛移植被认为是一种治疗1型糖尿病的潜在方法。近期有力的证据表明，血管内胰岛输注远非理想方案，因此，大网膜正重新成为胰岛移植的一个潜在重要部位。本实验需要分离高质量的胰岛，并将胰岛植入糖尿病受体。将胰岛移植至大网膜的过程涉及多个手术步骤，通过视觉方式展示更为清晰。本文详细介绍了该操作的具体步骤。文中描述了两种在将分离的胰岛植入糖尿病小鼠大网膜囊之前，将其与水凝胶混合的方法。不同实验条件下使用了不同的水凝胶。对接受同基因胰岛移植至大网膜的糖尿病小鼠受体，持续监测其血糖水平达35天。部分动物在术后14天被处死，以进行免疫组织化学分析。这种临床前移植方法可作为初步数据，为后续向临床移植转化提供依据。

胰腺消化后的状态如图1A所示。纯化的胰岛如图1B所示。胰岛的二苯硫腙（Dithizone）染色及活力检测结果如图2所示。胰岛移植至大网膜的主要操作步骤如图3所示。大网膜移植后受体的血糖水平如图4所示。移植物的组织学分析结果如图5所示。
<img alt="血液样本离心；细胞分离过程，显微镜结果显示已沉淀的细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57160/57160fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" ...

介绍了一种在小鼠体内进行网膜移植胰岛的方法。分离的胰岛与水凝胶混合后，将混合物植入糖尿病小鼠的网膜囊内。随后监测血糖水平，并进行免疫组织化学分析。

胰岛移植已被提出作为治疗1型糖尿病的一种潜在疗法。近期有力的证据表明，血管内胰岛……

该方法有助于解答胰岛移植领域中的关键问题，例如将胰岛移植至大网膜。该技术的意义在于为I型糖尿病的治疗提供了新方向，因为大网膜正重新被视为胰岛移植的潜在有效部位。该技术的主要优势在于，可将分离的胰岛与水凝胶混合，并将混合物植入糖尿病小鼠的大网膜囊内。首先，使用无菌布单和一次性用品等无菌材料，在手术区域建立无菌操作区。将已灭菌的手术器械放置于无菌操作区内。在体视显微镜下，用200微升移液器吸头挑选供体胰岛。每只动物收集 450 至 500 个胰岛，并转移至含有 100 µL CMRL 1066 培养基的无菌 1.5 mL 带盖离心管中。将离心管置于冰上，直至准备进行移植。胰岛收获后，将基底膜基质水凝胶置于冰上解冻。称重并标记所有糖尿病受体小鼠。根据机构批准的方案麻醉第一只小鼠后，通过施加足趾夹捏来检测麻醉深度。若无回缩反射，则表明麻醉水平适合手术。麻醉期间，向眼部涂抹兽医用眼膏以防止角膜干燥。用70%乙醇擦拭腹部，然后剃除手术部位的毛发。用无菌手术巾覆盖动物，并用碘伏擦拭消毒手术区域。使用眼科剪刀沿腹部正中线做4至5厘米的切口，将肠管移至左侧，并用生理盐水浸湿的纱布覆盖，以防止手术过程中组织脱水。然后用棉签充分暴露胃部，并在胃下方找到大网膜。此时，水凝胶应已完全解冻。将含有胰岛的离心管在200 × g条件下离心30秒。离心后，弃去上清液。然后吸取50 µL水凝胶，加入含有胰岛的离心管中，轻轻混匀，避免产生气泡。接下来，使用两把镊子夹住大网膜边缘，轻轻提起，以在胃壁与肠道之间形成一个沟槽。此时手术需要第二人协助，用200 µL移液器吸头吸取重悬的胰岛-水凝胶混合物，并将其注入沟槽中。通过轻轻抬高或降低大网膜的边缘，确保混合物准确置于槽内。在水凝胶凝固前的三分钟内完成混合物的定位。水凝胶固化后，将大网膜折叠以覆盖移植物。随着水凝胶的固化，大网膜将粘附于周围的胃壁。当水凝胶完全固化后，使用棉签将肠管复位至腹腔内，注意避免触碰移植部位。随后，向腹腔内注入200 µL适当抗生素，以预防感染。然后使用4-0缝线缝合腹部。通常，初次接触此方法的操作者会感到困难，因为小鼠大网膜的部位较小，评估起来较为费力。将小鼠放入预热的恢复笼中，直至其完全恢复体位。术后次日开始，持续一周每日注射抗生素，作为术后预防性用药。同时，每天使用血糖仪检测一次移植后尾静脉血样中的非空腹血糖水平。当胰岛移植至大网膜时，移植物功能可能延迟，需两到三周才能达到完全正常的血糖水平。移植后14天，从小鼠安乐死后获取移植物组织。经DAPI染色后，此处可见移植物表现为一群细胞核。通过抗胰岛素抗体的免疫荧光染色可揭示移植物组织的功能性。苏木精和伊红染色显示移植物组织被大网膜的脂肪细胞所包围。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一小时内完成。在进行此操作时，需注意小鼠的大网膜较为脆弱。通过该操作步骤，还可采用其他方法，例如不同高中所使用的方法，MB 的性能在所有这些方法中均能回答特定问题，例如胰岛在血管化过程中的分布情况及其性能表现。随着这一发展，该技术为研究人员在移植领域探索治疗 I 型糖尿病的方法铺平了道路，相关研究已在多个片段中有所体现。观看本视频后，您应能够充分理解如何将胰岛移植到小鼠的大网膜中。

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生物学

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