用于研究植物-微生物相互作用的实验室生态系统制造 (EcoFAB) 协议
2018年4月10日
本文描述了设备 (EcoFABs) 的生态系统制造的详细协议, 它能够在高控制的实验室条件下对植物和植物微生物相互作用进行研究。
该协议的总体目标是定义构建简化的模型植物生态系统（称为 EcoFAB）的标准化方法，该方法能够进行受控、复制的实验室实验，以研究可以在现场进一步测试的植物微生物相互作用。这种方法可用于研究受控环境中的植物微生物相互作用，这使我们能够获得对微生物组功能的详细机制见解，从而使我们能够利用它们进行可持续农业。我们帮助设计了第一个 Eco-FAB，它采用各种可用的 3D 打印技术，并对植物生长室进行消毒，从而能够实现不会分散注意力的高分辨率图像和化学分析。
这里开发的 Eco-FAB 设备非常适合分析植物微生物相互作用，因为它结合了根形态分析和质谱成像。在构建 Eco-FAB 模具之后，根据文本协议使用 3D 打印，在一次性 1 升容器中，根据实验，将 40 毫升硅氧烷弹性体基础与不同体积的固化剂混合。将容器置于真空室中至少 30 分钟，以去除弹性体混合物中的气泡。
然后，去除混合物，将其倒入组装好的 3D 打印塑料模具中。为了生成均匀的 PDMS 层，必须小心去除气泡。将混合物转移到模具中后，使用压缩空气吹掉任何空气残留物。
将模具放在 85 摄氏度的加热块上四个小时。让模具冷却 5 分钟。然后，轻轻地从模具中拉出嵌件，并使用美工刀将 PDMS 与铸造框架慢慢分离。
将带有 PDMS 的模架向上压出铸造框架。然后，使用刀或其他工具在边缘轻轻地将 PDMS 层与模架分离，并慢慢将其从模具表面剥离。使用 15 号钝针，通过在 PDMS 层上打 1.6 毫米的孔，在该层上创建一个入口通道。
然后，使用剪刀修剪 PDMS 层的边缘。要将 PDMS 层永久粘合到显微镜载玻片上，请使用甲醇在 7.6 x 5 厘米的显微镜载玻片上冲洗 PDMS 层的粘合面，然后用压缩空气或超纯氮气枪将其吹干。将显微镜载玻片和 PDMS 层放入等离子清洗剂中，使其粘合面朝上。
关闭腔室和排气阀。然后，打开真空，将腔室抽真空 1 分钟。打开等离子发生器电源，并将射频或射频电平调高一分钟。
然后，关闭真空泵和等离子体电源，并将腔室排空至大气中。从等离子室中取出显微镜载玻片和 PDMS 层，然后以均匀的压力快速将 PDMS 层的所有四个边缘压在载玻片上。确保中心椭圆区域（即根腔）不接触载玻片。
使用超纯水冲洗 Eco-FAB 设备。将一个 Eco-FAB 设备放入 Eco-FAB 容器中，加入 70% 乙醇直至设备浸没。然后，关闭容器盖并轻轻摇晃，用乙醇润湿内部的所有表面，确保 Eco-FAB 装置的根生长室充满乙醇，气泡很少或没有气泡。
将装置在室温下孵育 30 分钟后，倒出 70% 乙醇，并用 100% 乙醇替换。然后，孵育设备 5 分钟。孵育后，沥干乙醇，将灭菌的 Eco-FAB 放在层流罩中 16 小时以完全干燥。
如果可用，请打开通风橱中的紫外线灯一小时，对系统进行消毒。要进行种子灭菌和发芽，请将种子浸泡在 70% 乙醇中两分钟。然后，用移液管去除乙醇，并使用无菌水冲洗种子 3 次。
接下来，将种子浸泡在 10% 漂白剂溶液中 5 分钟。然后，去除漂白剂溶液，用无菌水彻底清洗种子 3 次。洗涤后，向种子中加入无菌水，并在 4 摄氏度下孵育试管 7 天。
将种子均匀地撒在 0.5 个 Murashige 和 Skoog 或 MS 培养基上，加入 0.6% vitagel。并用微孔胶带密封板。然后，将植物长到约 5 毫升的根长。
要将幼苗转移到 Eco-FAB 中，使用无菌注射器或微量移液管和无菌水，冲洗 Eco-FAB 装置的根室 3 次，然后用感兴趣的生长培养基（如 0.5 MS 培养基）填充根室。现在，小心地将一株幼苗插入 Eco-FAB 设备的植物储液器中。重要的是，将幼苗小心地从平板转移到 Eco-FAB，这样根部就不会折断。
在容器中加入 3 毫升无菌水，避免使用 Eco-FAB 设备。这将增加湿度并减少介质从根室蒸发。然后，关闭容器并使用微孔胶带密封盖子。
将 Eco-FAB 放入植物培养箱中，或在适合相应植物生长的受控温度环境中使用 Eco-FAB 照明系统。然后，将腔室设置为 24 摄氏度。最后，根据文本方案进行代谢物分析和质谱分析。
这些数字显示了在 Eco-FABs 中生长的 7 天龄的 Aaabidopsis thaliana、brachypodium distachyon 和 panicum virgatum。发现双子叶植物和单子叶植物在 Eco-FAB 中都达到了它们的繁殖阶段。这些幼苗分别代表一组生长在水培介质中的 14 天龄的 Brachypodium distachyon，以及补充有水培介质和水的沙子和土壤。
薄而坚固的基质层和根生长室允许光线穿透，以便对根系进行显微镜成像。在这里，将 brachypodium distachyon 幼苗转移到 Eco-FAB 设备中，其根结构由 biorad 凝胶成像仪内的相机记录。三周内总根面积的量化显示，早期逐渐增加，然后是线性增长趋势，直到结束。
在该图中，含有促进植物生长的根际细菌、模拟假单胞菌、WCS417 的 Eco-FAB 以每株植物的 10 到第 6 个细胞被添加到植物根系中。WCS147 微生物定植于整个根系的表面，微生物集中在根尖区域周围。当刷新生长培养基并从 Eco-FAB 中收集根系分泌物时，重要的是要记住在无菌罩中处理所有工作，以避免任何污染。
Eco-FAB 设备也可以使用可逆的物理密封来制造，方法是使用 3D 打印夹具或改变 PDMS 的粘度。这使得可以使用固体生长培养基和直接质谱成像。在 Eco-FAB 开发之后，该系统将允许世界各地的研究人员使用这些实验室模型生态系统，通过系统生物学和成像技术研究植物微生物的相互作用。
看完这个视频，你应该对如何构建 Eco-FAB 系统，以及它在生态系统研究中的广泛应用有一个很好的了解。我们希望这种 Eco-FAB 设计能够让其他科学家实现他们特定的科学目标。更重要的是，我们希望其他科学家能够在这种 Eco-FAB 设计的基础上改进它，并与其他科学家分享，以便作为一个社区，我们可以建立这些实验室生态系统，使我们能够更好地了解植物微生物的相互作用。
不要忘记，与微生物和尖锐物一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施。
概述
本文详细描述了EcoFABs的构建方案，这些装置有助于在受控的实验室条件下开展植物及植物-微生物相互作用的研究。
关键研究要素
科学领域
- 植物-微生物相互作用
- 可控生态系统的构建
- 实验室方案开发
背景
- EcoFAB 是为实验室实验设计的简化模型生态系统。
- 它们可用于对植物-微生物相互作用进行受控且可重复的研究。
- 该方法旨在揭示微生物组功能的作用机制。
- 利用 3D 打印技术可优化这些装置的设计。
研究目的
- 建立构建EcoFABs的标准方法。
- 在受控环境中研究植物-微生物相互作用。
- 推动在田间条件下对研究结果进行进一步验证。
使用的方法
- 使用3D打印技术构建EcoFAB模具。
- 植物生长室的制备与灭菌。
- 种子灭菌与萌发方案。
- 代谢物分析与质谱检测。
主要结果
- 多种植物物种在EcoFAB中的成功生长。
- 根系形态及相互作用的详细分析。
- EcoFAB在高分辨率成像中应用价值的展示。
- 对微生物组在可持续农业中作用的深入理解。
结论
- EcoFAB 为研究植物-微生物相互作用提供了可靠的平台。
- 所建立的实验方案可应用于多种植物物种。
- 研究成果可促进可持续农业实践的发展。
常见问题
行业重要性概述
EcoFAB为在受控实验室条件下开展植物-微生物互作机制研究提供了标准化且可重复的平台。该平台通过阐明微生物组在植物健康和应激反应中的功能作用，降低了农业生物技术中靶点验证的风险。该系统通过动态监测根系分泌物、微生物定殖位置以及植物生长表型，提高了基于微生物组的生物投入品中先导候选物筛选的可预测性与可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过调控微生物组组成（包括突变菌株），探究治疗假设，评估其对植物表型的因果影响。
- 操作价值：通过可控添加促进植物生长的根际细菌（如 Pseudomonas simiae WCS417）并量化定植模式，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：通过将微生物干预与可测量的输出（如根系形态、根系分泌物组成和生长动力学）关联，促进机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：通过实现幼苗的无菌、可重复固定以及在流通装置中对培养基进行可控更换，为下游工作流程准备经过验证的生物系统。
- 定量输出：生成标准化的量化指标，包括随时间变化的总根表面积、通过质谱成像确定的微生物定位，以及用于化合物筛选的根系分泌物谱分析。
- 平台可重复使用：设计上可扩展应用于多种植物物种（Arabidopsis、Brachypodium、Panicum）和生长培养基（水培、沙培、土壤），支持跨项目的标准化操作。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：模拟与可持续农业和生物能源原料生产相关的植物-土壤-微生物相互作用。
- 转化连续性：通过允许从无菌实验室条件过渡到添加培养基的定义明确的土壤/沙子系统，实现从发现到临床前验证的衔接。
- 风险调整型推进：在进入田间试验之前，可在受控的胁迫或营养条件下，基于可重复的表型特征支持做出推进或终止决策。
流程与工作流整合
EcoFAB 系统可融入从早期发现阶段的假设验证到先导物筛选及临床前验证的整个发现流程，支持基于微生物组的农业解决方案的迭代设计-测试循环。
- 发现生物学：通过调控微生物组组成和环境变量，同时监测植物响应，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：通过无菌制造、可控水合以及密封培养系统，实现检测就绪性和可重复性，最大限度减少蒸发和污染。
- 分析：提供定量测量，包括根系形态成像、代谢物谱分析和质谱数据，用于比较不同实验条件。
- 转化研究：支持在日益复杂的培养基（如沙子、土壤）中进行验证，同时保持变量可控，从而实现与临床前研究的衔接。
- 企业级复用：设计为可重复使用的平台而非一次性工具，模块化设计可适应不同实验室和植物模型的应用需求。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低植物-微生物互作中的机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过详细的灭菌方案、3D打印模具和受控的环境条件，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：在田间试验前实现对微生物组相关候选物的早期风险排除，从而优化决策流程并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：通过与微生物干预相关联的定量且可重复的表型，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 设备制备需要具备无菌操作技术、3D打印和聚二甲基硅氧烷（PDMS）处理的专业知识。
- 依赖于等离子清洗仪、真空腔室和成像系统等设备，用于实现键合与分析。
- 种子转移、培养基更换和污染控制等操作需跨团队统一标准化操作流程。
- 在维持无菌条件的同时，更换液体、沙质或土壤类生长培养基时需考虑适应性调整。
- 由于在渗出物取样和培养基更新过程中必须保持无菌操作，以防止生物膜形成，因此存在局限性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
EcoFAB Device Fabrication: Casting PDMS Layers
3:22
EcoFAB Device Fabrication: Chemically Attached PDMS Layers onto Microscope Slides
4:50
EcoFAB Sterilization
5:59
Growing Plants in EcoFABs
8:31
Results: Plant-microbe Interactions Using Ecosystem Fabrication Protocols
10:18
Conclusion
