由酶活化的致癌物和药物形成共价DNA加合物 体外 及其测定方法 ³²P-后标记

本方案的总体目标是描述利用细胞色素P450及其他生物转化酶催化的反应，来研究化学物质或药物被活化为可形成共价DNA加合物的代谢产物的能力。该方法有助于回答癌症发生及其治疗领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，它提供了一种评估环境化学物质或药物形成共价DNA加合物能力的方法，而此类加合物的形成代表了癌症发生的起始环节。

该技术在确定化学物质致癌强度方面的意义。环境效力、毒物以及药物，并且还可用于确定此类化合物形成共价DNA加合物的相对简便方法。尽管该方法可为癌症发生机制及其治疗提供见解，但也适用于其他科学领域。

例如分子机制研究、DNA损伤研究，以及关于化学物酶激活和毒化的口腔研究。我最初是在研究化学致癌作用起始阶段所涉及的过程时，了解到该方法的设想。首先，在4°C条件下，将所有化合物和酶系统加入，配制孵育混合液，终体积为0.75毫升。

将致癌物与DNA在细胞色素p450存在条件下进行孵育。然后，向混合物中加入微粒体或纯化的重组p450 supersome。接着，加入7.5微升溶于DMSO的0.1毫摩尔椭圆霉素药物溶液和42.5微升水，以调节终体积至0.75毫升。

然后，将各组分混合，涡旋震荡离心管5秒。紧接着，将离心管在37摄氏度下孵育30至60分钟，孵育时管盖保持打开状态。接下来，将苯酚或苯酚-氯仿与孵育后的混合物按1:1比例在Eppendorf管中混合。

这将去除孵育混合物中DNA的蛋白质污染。然后搅拌混合物以形成乳状液。接着在室温下以1600 × g离心3分钟。

离心结束后，使用移液器将上层水相转移至新的聚丙烯管中。随后，将蛋白质界面与有机相一同弃去。接下来，将水相与等体积的苯酚和氯仿按1:1比例混合。

然后重复离心操作。接着向收集的水相中加入等体积的氯仿，并再次离心。随后向水相中加入两倍体积、保存在负20摄氏度的冷乙醇，以沉淀DNA。

然后充分混匀溶液。为准备标记DNA加合物，将二乙醇甘氨酸缓冲液与放射性标记的ATP溶液混合，以标记DNA加合物。将标记混合物加入NP1溶液或正丁醇富集混合液中。

将混合物在室温下静置30分钟。然后取约20微升（µL）均匀点样于PEI-纤维素薄层色谱板上的整个样品区域。在PEI-纤维素薄层色谱板上点样后，将板置于D1方向展开，以分离纯化加合物。

待胶板干燥后，将其置于D3和D4方向进行展层。D3展层使用pH 3.5的甲酸锂缓冲液并加入尿素；D4展层则使用含氯化锂和尿素的Tris-HCl缓冲液。

为避免在 D4 方向展开时出现任何问题，还需在 D5 方向进行薄层板展开。首先，采用 P32-后标记技术研究微粒体 P450 介导的椭圆霉素生物活化形成 DNA 加合物的效率。结果显示，在大鼠和/或人肝微粒体存在下，小牛胸腺 DNA 的脱氧鸟苷中形成了共价 DNA 加合物；然而，对照组中未形成加合物。

接下来，研究了依赖过氧化物酶激活的椭圆霉素的潜在作用。图像显示，在辣根过氧化物酶、牛乳过氧化物酶和人髓过氧化物酶存在下，小牛胸腺DNA中形成了共价DNA加合物。事实上，当大鼠在体内接受每千克体重40毫克的椭圆霉素处理时，其肝脏DNA中也形成了DNA加合物。

有趣的是，人细胞色素 p450 酶 CYP3A4 也表现出高效氧化椭吖啶生成代谢产物（如 12-羟基椭吖啶和 13-羟基椭吖啶）的显著潜力。这些代谢产物可轻易与 DNA 结合形成加合物。接下来，采用核酸酶 P1 和正丁醇富集方法，研究 3-硝基苯并蒽酮在大鼠和人源细胞质还原酶（如 NQO1）激活后 DNA 加合物的形成情况。

结果表明，从大鼠、人肝细胞质和小鼠肝脏获得的牛胸腺DNA可形成多达五种DNA加合物。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成实验。进行该实验时，需特别注意所用酶系统的稳定性。

如果不将酶保存在冰上，其活性可能会降低。该技术问世后，为生物化学领域、特别是化学致癌作用生化机制的研究人员探索生物体内癌症发生起始过程这一现象的本质铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估环境化学物质或药物被酶激活后形成共价DNA加合物的代谢能力。

该过程对于癌症相关治疗的开发具有重要意义。请注意，您正在使用的化学试剂可能具有极高危险性，例如具有潜在致癌性的物质或放射性化学品，如磷-ATP。

因此，进行该操作时应始终采取实验室乳胶手套和有机玻璃板等防护措施。