Name: 用数据无关采集质谱法定量测定点特异蛋白赖氨酸乙酰化和琥珀酰化化学计量学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学习使用数据无关采集质谱法定量测定蛋白质赖氨酸乙酰化和琥珀酰化的位点特异性化学计量学。该方法可精确分析多位点肽段的修饰比例，为研究蛋白质可逆调控机制提供高准确度工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（NIH-NIDDK）资助，项目编号 R24 DK085610（项目负责人：E. Verdin）。JGM 获 NIH T32 博士后奖学金支持（T32 AG000266，项目负责人：J. Campisi）。作者感谢 NIH 共享仪器资助项目对 Buck 研究所 TripleTOF 6600 系统的资助（1S10 OD016281，项目负责人：B.W. Gibson）。

1. 使用同位素标记的乙酸酐或琥珀酸酐对蛋白质进行定量乙酰化和/或琥珀酰化
<ol>
	<li>准备3个重复样本 100 µg 平行处理牛血清白蛋白（BSA）蛋白样品，浓度为 1 µg/µL （共计 100 µL），使用尿素和三乙基碳酸氢铵（TEAB）溶液（8 M 尿素，200 mM TEAB，pH 8）。 
	注意：必须使用无胺缓冲液。本代表性结果部分所用的蛋白质样品为牛血清白蛋白（BSA）、定量琥珀酰化BSA，以及两者的混合物，从而获得琥珀酰化占有率分别为0%、1%、10%、50%和100%的BSA样品（每种样品均制备3个重复）。本方案也已使用来自细胞裂解液的蛋白质样品进行验证。 大肠杆菌 和小鼠肝脏4该方案也可应用于其他细胞或组织裂解物。</li>
	<li>减少 100 µL BSA 样品的100 µg）与 8 µL 加入250 mM二硫苏糖醇（DTT），使DTT终浓度为20 mM，并将样品在指定条件下孵育 37 °C 以1,400 rpm振荡孵育30分钟。</li>
	<li>用烷基化试剂处理还原后的 BSA 样品 21.6 µL 加入200 mM碘乙酰胺，使碘乙酰胺终浓度为40 mM，将样品置于室温避光孵育30分钟。 
	注意：碘乙酰胺的浓度应略高于二硫苏糖醇（DTT）浓度的2倍，以确保所有被还原的蛋白质巯基均被烷基化。</li>
	<li>继续准备乙酸酐-d6 （步骤 1.4.1）或丁二酸酐-d4 （步骤 1.4.2）用于样品的化学（定量）乙酰化或琥珀酰化。
	<ol>
		<li>测定1 g水相乙酸酐等分试样的摩尔浓度（M）d6 根据分子量（108.13 g/mol）和密度（1.143 g/mL，于 25 °C). 
		注意：1 g 包装包含 9,248 µmol 乙酸酐d6 在 875 µL 体积，得到用于样品全乙酰化的 10.57 M 溶液。</li>
		<li>制备5 M的丁二酸酐溶液d4 通过在反应前立即用无水DMSO溶解粉末，以避免试剂发生水解。将0.24 g丁二酸酐溶解于d4 在 461 µL 加入无水DMSO以配制5 M溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过添加进行定量化学乙酰化或琥珀酰化 60 µmol 乙酸酐d6 (6 µL 10.57 M 溶液的）或丁二酸酐-d4 (12 µL 5 M 溶液）中，分别混匀，并将样品在 4 °C 在涡旋混合器上混合20分钟。 
	注意：由于酸酐具有酸性，蛋白质可能发生沉淀。请注意，并按照步骤 1.6 中所述进行调整。</li>
	<li>添加 10 µL 加入7.25 M NaOH以将pH调至约8，从而消除任何O-酰化副产物。短暂涡旋混匀，并通过点样检测样品pH 1 µL pH试纸上 
	注意：可能需要添加超过 10 µL 加入7.25 M NaOH调节pH至8。此外，可能析出的蛋白质应重新溶解。</li>
	<li>重复步骤1.5的酰化反应和步骤1.6的pH调节，共进行三次。每次重复时记录pH值及所加入碱性溶液的体积。在上述化学酰化步骤中需快速操作，因为酸酐会水解并失去反应活性。</li>
	<li>在最后一次标记反应和pH调整后，加入 10 µL 加入50%的盐酸羟胺溶液以逆转O-酰化副反应。</li>
</ol>
2. 使用 Glu-C 内肽酶消化反应后的蛋白质样品
<ol>
	<li>使用 50 mM TEAB（pH 8）将尿素浓度稀释至 0.8 M，并调整样品体积至一致。</li>
	<li>加入内切蛋白酶 Glu-C 进行蛋白质样品消化，酶与底物蛋白的质量比为 1:50（w/w），37 °C 下振荡孵育过夜，转速为 1,400 rpm。</li>
	<li>通过加入甲酸至终体积浓度为 1%，酸化并终止蛋白质消化反应。</li>
	<li>使用亲水-疏水平衡固相萃取小柱对样品进行脱盐。每份样品使用一个 30 mg 填料的小柱，每根小柱最大上样量不超过 5 mg4,18。 
	注意：在整个脱盐过程中，必须始终保持小柱内填料处于湿润状态。必要时关闭真空泵，以减缓溶剂或样品通过小柱的速度。
	<ol>
		<li>将小柱插入 24 位玻璃真空 manifold 的端口，打开真空泵。未使用的端口应加盖密封。必要时留出一至两个端口不加盖，以维持真空表上的较低压力。</li>
		<li>每根小柱用 800 µL 的 80% 乙腈（ACN）/0.2% 甲酸/19.8% 水溶液润洗两次。确保液面始终高于填料表面 2–3 mm。确保 manifold 上的真空表读数为 16.9–67.7 kPa（5–20 in Hg）。</li>
		<li>每根小柱用水中含 0.2% 甲酸的溶液平衡三次，每次 800 µL。确保 manifold 上的真空表读数为 16.9–67.7 kPa（5–20 in Hg）。</li>
		<li>将肽段样品加载到小柱上。确保 manifold 上的真空表读数为 6.77–8.47 kPa（2–2.5 in Hg），流速不超过 1 mL/min。</li>
		<li>每根小柱用 800 µL 水中含 0.2% 甲酸的溶液洗涤三次。确保 manifold 上的真空表读数为 16.9–67.7 kPa（5–20 in Hg）。</li>
		<li>将小柱从真空 manifold 上取下，放入 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>用 800 µL 的 80% ACN/0.2% 甲酸/19.8% 水溶液洗脱肽段一次，并让溶剂与填料孵育 2–3 分钟。</li>
		<li>使用移液器推动溶剂穿过小柱内的填料层。再用 400 µL 的 80% ACN/0.2% 甲酸/19.8% 水溶液进行第二次洗脱，洗脱液收集至同一 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过真空离心浓缩干燥洗脱液（固定离心速率为 268 x g），通常需要 3 小时。 
	注意：如需保存，干燥后的洗脱液样品可在 -20 °C 冷冻储存，直至进行后续分级分离步骤。</li>
</ol>
3. 使用离线高pH值反相高效液相色谱分离肽段
<ol>
	<li>将已过乙酰化处理并经Glu-C酶解的样品（按第1和第2节所述方法制备）重悬于200 µL缓冲液A（10 mM甲酸铵水溶液，pH 10）中，在4 °C下涡旋混合10分钟，并在室温下以17,500 x g离心10分钟。 
	注意：所得肽段样品可进行高pH条件下的离线分级分离19,20。</li>
	<li>根据所使用的仪器和软件设置离线HPLC分级方法。以下方法适用于配备双波长紫外检测器、自动进样器、馏分收集器和耐pH 10的C18色谱柱（4.6 mm x 250 mm，5 µm粒径）的二元HPLC泵系统。</li>
	<li>每份样品收集40个馏分，每个馏分收集2.1分钟，然后将每第四个馏分合并，最终得到四个合并馏分4。可采用更多合并馏分以进一步降低样品复杂性，但会延长质谱数据采集时间。</li>
	<li>将合并的馏分在冻干机中干燥，将干燥后的肽段样品重悬于1 mL含50%乙腈和1%甲酸的水溶液中，转移至较小的样品容器中。通过真空离心（固定离心速率为268 x g）干燥转移后的样品，通常持续1小时。 
	注意：甲酸铵的低蒸气压可能导致完全干燥困难。若干燥后仍有大量甲酸铵盐以沉淀形式残留，需重复固相萃取步骤。</li>
	<li>将样品重悬于20 µL含0.2%甲酸的水中，并加入索引保留时间（iRT）肽标准混合物。 
	注意：样品现已准备好用于质谱分析。</li>
</ol>
4. 分级肽段样品的DIA分析
<ol>
	<li>使用DIA LC-MS/MS方法分析样品，该方法可根据可用的质谱仪器进行调整。分析采用在线连接正交四极杆飞行时间（QqTOF）质谱仪的纳米液相二维高效液相色谱（nano-LC 2D HPLC）系统进行。
	<ol>
		<li>编程仪器软件，使肽段混合物转移至C18预柱芯片（200 µm x 6 mm C18-CL芯片，3 µm，300 Å），并以加载溶剂（H2O/0.1%甲酸）在2 µL/min流速下冲洗10分钟以脱盐。</li>
		<li>在75 µm x 15 cm C18-CL芯片（3 µm，300 Å）上，以300 nL/min流速通过2小时梯度，使用典型的（且与液相系统相关的）水相和乙腈（ACN）溶剂缓冲液对肽段进行色谱分离4。</li>
		<li>生成可变窗口DIA方法，其中可变宽度（5至90 m/z）的质量范围窗口以增量方式在整个质量范围（m/z 400–1,250）内从Q1四极杆传递至碰撞池。 
		注：3.2秒的循环时间包括一次250毫秒的前体离子扫描，随后对64个SWATH片段中的每一个进行45毫秒的累积时间21,22。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过DDA MS对样品进行平行分析并构建谱图库以鉴定肽段；或者，也可使用PIQED软件直接从DIA数据中鉴定肽段23，该软件可处理数据处理、鉴定及导入Skyline进行后续定量的所有技术步骤。</li>
</ol>
5. 示例数据分析教程
<ol>
	<li>下载 Skyline 软件（http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline）并创建一个 PanoramaWeb 账户（https://panoramaweb.org）。 
	注意：有关使用 Skyline 处理数据的详细教程，请参见（https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials）。也可使用其他软件算法从 DIA 采集数据中提取轻链和重链片段离子的峰面积，例如 Open SWATH24，将 SWATH 2.0 插件导入 PeakView25，和 Spectronaut26.
	<ol>
		<li>下载用于琥珀酰化BSA代表性结果的Skyline数据文件（图3) 从 Panorama Public 获取：https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url。在 Panorama 网页上，进入“Targeted MS Runs”表格，点击右侧的 DOWNLOAD 链接，下载 sky.zip 文件。解压下载的 .zip 文件夹，双击 skyline.sky 文件以在 Skyline 中打开。检查肽段碎片离子目标树（左侧面板）以及来自不同定义比例轻度琥珀酰化修饰的四个色谱图（右侧面板）。</li>
		<li>选择“查看”菜单，进入“峰面积 | 重复比较”。“峰面积 – 重复比较”面板将显示柱状图，并出现在窗口右侧。在峰面积面板中，右键单击并选择“过渡离子 | 单一”，以显示所选片段离子的碎片离子峰面积。最后，右键单击“峰面积”面板并选择“排序 | 按文件”。</li>
		<li>在窗口左侧的目标树状面板中，右键单击肽段“E.LCKVASLRE.T | Ratios To |Oneheavy”，该肽段用于计算轻离子信号与重离子信号的比值（Light/Heavy）。 
		注意：这与光链/(重链+光链)的位点占据化学计量比不同。</li>
		<li>注意，目标树现在在轻链片段离子右侧报告 L/H 比值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定包含目标酰化位点的“差异化碎片离子”。 
	注意：如图所示 图3，以该具体实例为例，所确定的差异离子为 y7 （排名最高），y8, b3，以及 b4注意，非分化碎片离子在目标树中的比值为1。
	<ol>
		<li>在左侧目标树中，点击肽段 E.LCKVASLRE.T 的 588.30++ 子节点下的 y7 特征碎片离子 
		K [y7 ] – 902.49+（第一级）[5] 
		注意峰高和峰面积的逐渐增加。</li>
		<li>在左侧目标树状图中，点击肽段 E.LCKVASLRE.T 的 588.30++ 子节点下的 y5 非分化碎片离子 A[y5 ] – 575.31+（排名第6）[1]. 观察 y5 所有样品的碎片离子色谱图和峰面积均保持在同一范围内。</li>
		<li>在目标树状图面板中，浏览其他具有不同分化性（比例不为1）和非分化性（比例为1）的碎片离子，并观察峰面积柱状图和色谱图中相应峰的变化规律与模式。</li>
		<li>确定不同离子轻重峰对的精确峰面积，以计算化学计量比（更多细节参见 Meyer） 等4）。单击“视图 | 文档网格”，文档网格将弹出。在文档网格的左上角，单击“视图 | 转换结果”，即可查看包含碎片离子信息的多列表格，例如肽段序列、前体 m/z、重复名称 等等。</li>
		<li>再次点击文档网格中的“Views”，选择“Edit View”以打开“Customize View”窗口。在“Customize View”窗口左下角，勾选“Pivot Replicate Name”，然后选择“Ok”关闭该窗口。此时可观察到，“Document Grid: Transition Results”表格窗口已重新排列，按重复样本（1%、10%、50%、100% 丁二酰化）对重复样本名称、保留时间、峰面积、背景值、峰排名等列进行分组显示。</li>
		<li>在“文档网格：转换结果”表格中，针对肽段“E.LCKVASLRE.T”，找到“前体离子m/z”列、“碎片离子”列以及“1pct_light_sw1 峰面积（1% 丁二酰化）”列。观察到该肽段存在两个前体离子：轻型（前8行中的前体离子m/z为588.30）和重型（后8行中的前体离子m/z为590.32）。</li>
		<li>在“碎片离子”列中，找到对应于轻链和重链前体离子的 y8 碎片离子的两行。从“1pct_light_sw1 面积”列中相同行获取 y8 碎片离子的面积值，记录轻链（15,820）和重链（1,426,461）的面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据以下公式，利用这些峰面积值计算琥珀酰化化学计量比（即修饰比例），得到化学计量比为 0.01，即 1% 琥珀酰化，与该定义混合物中轻度琥珀酰化的比例相符： 
	<img alt="比值计算公式，显示通过 L 和 H 值进行定量分析的面积平衡。" src="/files/ftp_upload/57209/57209eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"></li>
	<li>使用10pct_light_sw1面积列中10%琥珀酰化对应的y8特征片段离子峰面积值，轻链为144,953（light），重链为1,188,041（heavy），计算其化学计量比，得到比值为0.10，即10%琥珀酰化。</li>
	<li>使用100pct_light_sw1 Area列中y8特征性碎片离子峰面积值（轻链：954,513；重链：16,407）计算完全琥珀酰化（100% succinylation）的化学计量比，得到比值为0.98，即98%琥珀酰化。</li>
	<li>类似地，利用1%轻链样品（1pct_light_sw1）面积列中的b3特征碎片离子峰面积值55,697（轻链）和3,149,119（重链），计算1%琥珀酰化修饰的化学计量比，得到比值为0.01，即1%琥珀酰化。</li>
	<li>使用该公式继续对所有不同的碎片离子（包括 y 离子和 b 离子）进行化学计量比计算，以获得赖氨酸琥珀酰化在 1%、10%、50% 和 100% 琥珀酰化混合物中的化学计量比值。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种新颖且精确的方法，用于定量位点特异性的赖氨酸乙酰化和琥珀酰化占有率，可应用于整个蛋白质组。该方法依赖于内源性轻肽和外源性重肽的测定，其中后者由合成产生 体外 使用氘代乙酸酐对蛋白质进行定量化学酰化d6 或琥珀酸酐-d4 (图1）。类似方法利用稳定同位素标记天然未修饰的赖氨酸残基，并基于前体离子信号进行位点占据率定量12 或DDA采集中的碎片离子13,14本方案在样品制备过程中采用多个步骤以提高酰化效率，并将化学标记扩展至琥珀酰化。使用数据非依赖采集（DIA）模式进行数据采集，可获得整个可检测质量范围内前体离子和二级碎片离子的强度，从而减少碎片离子干扰。通过Skyline软件及实验室自主开发的自定义脚本进行分析与定量，可实现对含有多个赖氨酸残基或单个位点存在多种酰化修饰的肽段的位点占有率计算。
在本实验方案的样品制备阶段，有几个关键步骤需要严格遵循。由于整个方案依赖于对所有赖氨酸残基进行高效的化学修饰，因此该步骤至关重要。酸酐会与游离的氨基发生反应，因此必须避免蛋白裂解液中含有氨基的缓冲液或污染物分子。此外，在化学全酰化步骤中，每次与酸酐试剂孵育后，需确保将反应混合物的 pH 重新调回 pH 8，因为该反应会使体系酸化，并可能导致 O-酰化副反应的发生。另外，在酶解前，应将含有 8 M 尿素的反应体系稀释至约 0.8 M 尿素，并检查 pH 是否处于最佳范围内，这对于内肽酶 Glu-C 的最佳活性至关重要。本方案的另一个关键环节是数据采集步骤，以及引入了DIA工作流程，该流程可克服DDA数据采样中的不一致性问题，并实现基于MS2片段离子水平的定量分析。DIA方法的一个主要优势在于降低了干扰信号的影响，而这类干扰在对MS1前体离子信号进行定量时通常更为显著且更具问题性（如先前一些文献所指出的）。
在制备高度复杂的样品时，可对实验流程进行多种改进。可在离线碱性pH反相高效液相色谱（HPLC）分级后减少合并的组分数目，以降低后续LC/MS分析样品的复杂性。此外，也可在检测过程中采用更长的色谱梯度，以实现更佳的肽段分离效果。或者，可使用多种蛋白酶对样品进行消化，从而产生更多种类的切割肽段，并提高对蛋白质赖氨酸残基的覆盖度。可采用含有特定乙酰化或琥珀酰化比例的商用BSA进行预实验和条件优化。
该方案的一个局限性在于，由于未考虑其他赖氨酸修饰（如甲基化或泛素化），可能导致位点 occupancy 的轻微高估。 等等。，在同一位置4根据轻链和重链酰基化修饰峰面积计算得出的 L/(L+H) 值，位点占有率基于以下假设：赖氨酸位点的总修饰水平仅由内源性的“轻”酰基化（L）和化学标记的“重”酰基化（H）组成。然而，该位点实际的总酰基化占有率 体内 可能还包括乙酰化和/或琥珀酰化以外的其他修饰。此外，所购试剂乙酸酐的报道同位素纯度d6 （99%）和丁二酸酐-d4 (&#62;98%）可能导致内源性酰化水平被轻微高估，最多达2%（琥珀酰化）或1%（乙酰化）4这些轻微的高估结果共同导致了对占据率低于1%的位点进行定量时的困难。完全化学酰化肽段与天然酰化肽段之间丰度的巨大差异也会导致潜在的位点占据率定量误差，特别是对于内源性酰化程度较低的肽段。27. Weinert 的一项近期研究 等.27 发现完全全乙酰化肽段之间丰度差异的降低可减少定量误差27.
采用本方案获得的化学计量学定量结果可精确定位特定蛋白质中的重要酰化热点，并为后续生物学实验（如对特定关注位点进行定点突变）提出假设。该方案还可揭示低酰化化学计量比位点的协同效应，这些位点可能对蛋白质结构稳定性及局部细胞环境产生间接或细微的影响。此外，将本方案应用于检测乙酰化、琥珀酰化以及其他可能的赖氨酸酰化修饰（超出乙酰化范围），将独特地揭示在不同生物学条件下蛋白质动态酰化效应的机制。

蛋白质赖氨酸残基的Nε-酰基化是调控蛋白质功能的重要机制。赖氨酸乙酰化及其他酰基化修饰（如琥珀酰化、丙二酰化和戊二酰化）被认为在代谢、细胞信号转导及其他细胞过程中发挥调控作用1,2,3,4，并可能与代谢紊乱相关5。大量研究表明，在不同条件下，哺乳动物组织和细胞系5,6,7,8以及细菌9,10,11中，赖氨酸酰基化修饰水平可发生显著的倍数变化。然而，这些相对倍数变化并不能反映被修饰蛋白占总蛋白的比例。尽管准确测定酰基化位点占据率对于深入理解修饰的生物学意义至关重要，且其提供的信息远超相对倍数变化，但相关研究报道仍十分有限12,13,14。例如，10倍的变化可能对应于占据率从0.01%升至0.1%、从1%升至10%，甚至从10%升至100%。因此，精确的化学计量学测量对于解读酰基化的生物学意义，以及预测其对蛋白质结构乃至功能改变的影响程度，具有关键作用。
一种先前用于量化位点占据率的方法利用重稳定同位素化学标记未修饰的赖氨酸残基，随后通过质谱法测量内源性与标记肽段之间的比率 &#34;光&#34; 与外源性化学标记的乙酰化相比 &#34;重&#34; 使用前体离子强度检测乙酰化赖氨酸12. 另一项近期由Zhou开展的研究 等.13 Nakayasu 描述了一种类似的方法用于评估赖氨酸乙酰化的化学计量比，该方法同样采用稳定同位素标记对蛋白质中所有未修饰的赖氨酸残基进行完全化学乙酰化，但使用 DDA 测定的碎片离子强度进行分析。 等.14 采用了一种类似的DDA方法，但定量时使用了轻链与重链乙酰化赖氨酸亚胺离子（acetyl-lysine immonium ions）的比值。基于碎片离子（包括亚胺离子或序列离子，MS2）进行定量，在大多数情况下相比处理完整的肽段前体离子（MS1）可减少信号干扰。然而，基于DDA生成的MS/MS谱图对碎片离子进行定量时，可能受到随机采样不足的影响，即高丰度的前体离子更易被选中进行MS/MS分析，从而导致前体离子采样的偏差和不完整性。
这一新型工作流程4（图1）在概念上采用了Baeza et al.12最初开发的稳定同位素化学标记方法，但随后将该流程与DIA技术结合，以在可检测的质量范围内同时采集前体离子和多个碎片离子的丰度15,16，从而实现精确的化学计量计算。
通过含有目标酰化位点的碎片离子（即“区分性碎片离子”）的峰面积来定量酰化位点的占据率（图2）。不含修饰的碎片离子具有相同的轻链和重链质荷比（m/z），可用于肽段鉴定，但不用于定量。使用Skyline软件17提取前体离子和碎片离子的峰面积。当某些碎片离子出现干扰时，多个包含特定酰化位点的碎片离子可提供分析灵活性。Skyline中的数据可视化功能可用于严格检查轻链与重链碎片离子的比值。除手动数据分析外，我们实验室还开发了一个开源R软件包StiochiolyzeR（https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR），该工具利用DIA方法获得的前体离子和碎片离子数据，对含有多个赖氨酸残基的肽段进行位点特异性酰化化学计量比的定量分析，而仅依赖前体离子强度的测量方法无法实现这一功能4。
本方案还展示了使用内切蛋白酶Glu-C，该酶特异性切割谷氨酸和天冬氨酸残基的C端，以替代胰蛋白酶或Arg-C蛋白酶；因为后两者在酰化赖氨酸残基处会阻碍胰蛋白酶的切割，从而常常产生非常大且可能多重酰化的蛋白水解肽段。化学标记步骤还进一步扩展，包括使用琥珀酸酐（图1），从而实现对琥珀酰化化学计量比的定量。除了在样品制备方面的改进外，还通过离线、高pH值、反相（bRP）肽段分离实现肽段分级，进一步减少了定量干扰，使得在全蛋白质组样品中对酰化化学计量比的解析更加准确。综上，该方法具有以下几项优势：（1）化学酰化效率提高；（2）除乙酰化外，还可测定蛋白质的琥珀酰化化学计量比；（3）定量准确性提升。定量性能的改善主要归因于与DDA前体信号相比，DIA的碎片离子信号干扰减少，以及通过bRP实现的离线肽段预分级。

<table><tbody><tr><td>乙酸酐水溶液-&lt;em&gt;d&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>175641-1G</td><td>1% 同位素纯度</td></tr><tr><td>琥珀酸酐-&lt;em&gt;d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>293741</td><td>2% 同位素纯度</td></tr><tr><td>测序级谷氨酸特异性蛋白酶 Glu-C</td><td>罗氏，美国印第安纳州印第安纳波利斯（通过Sigma）</td><td>10791156001</td><td>1:50 蛋白酶与底物蛋白比例（质量比）</td></tr><tr><td>Oasis HLB 固相萃取（SPE）小柱</td><td>Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德</td><td>WAT 094225</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级乙腈</td><td>Burdick 和 Jackson，美国密歇根州马斯基根</td><td>BJAH015-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级水</td><td>Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国</td><td>BJAH365-4</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>I1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D9779-5G</td><td></td></tr><tr><td>质谱用 FLUKA 甲酸（FA）</td><td>Thomas Scientific，美国新泽西州斯韦兹伯勒</td><td>C988C27</td><td>~98%</td></tr><tr><td>尿素</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>PI29700</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Pierce，罗克福德，伊利诺伊州，美国</td><td>88341</td><td></td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵（TEAB）</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>无水二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Alfa Aesar，特克斯伯里，马萨诸塞州，美国</td><td>43998</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>EMDMillipore，美国马萨诸塞州伯灵顿</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>50% 羟胺水溶液</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS级水</td><td>Burdick 和 Jackson，美国密歇根州马斯基根</td><td>BJLC365-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS乙腈</td><td>Burdick 和 Jackson，密歇根州马斯基根，美国</td><td>BJLC015-4</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Eppendorf AG，德国汉堡</td><td>T1317-1EA</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Savant SPD131DDA SpeedVac 浓缩仪</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr><tr><td>Waters 1525 二元高效液相色谱泵系统</td><td>Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德</td><td>WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2487 双波长紫外检测器</td><td>Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德</td><td>WAT081110</td><td></td></tr><tr><td>Waters 717plus 自动进样器</td><td>Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德</td><td>WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Waters Fraction Collector III</td><td>Waters Corp.，美国马萨诸塞州米尔福德</td><td>186001878</td><td></td></tr><tr><td>安捷伦 Zorbax 300Extend C18 色谱柱</td><td>安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉</td><td>770995-902</td><td></td></tr><tr><td>Labconco 冷冻干燥系统 Freezone 4.5 冻干机</td><td>Labconco，美国密苏里州堪萨斯城</td><td>7751000</td><td></td></tr><tr><td>保留索引保留时间（iRT）归一化肽标准品</td><td>Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦</td><td>Ki-3002-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Plus nano-LC 2D 高效液相色谱系统</td><td>美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex LLC，Eksigent 分部</td><td>型号# 845</td><td></td></tr><tr><td>正交四极杆飞行时间（QqTOF）TripleTOF 5600 质谱仪</td><td>美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex有限公司</td><td>每份报价</td><td></td></tr><tr><td>正交四极杆飞行时间（QqTOF）TripleTOF 6600 质谱仪</td><td>美国马萨诸塞州弗雷明汉市 Sciex 公司</td><td>按报价</td><td></td></tr><tr><td>C18 预柱芯片（200 &amp;mu;m &amp;times; 6 mm ChromXP C18-CL 芯片，3 &amp;mu;米，300 &amp;Aring;)</td><td>美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex有限公司</td><td>804-00006</td><td></td></tr><tr><td>SWATH 2.0 插件集成至 PeakView 2.2</td><td>美国马萨诸塞州弗雷明汉市，Sciex有限公司</td><td>软件下载 Sciex</td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut</td><td>Biognosys AG，瑞士苏黎世州施利伦</td><td>Sw-3001</td><td></td></tr><tr><td>C18-CL芯片（75 &amp;micro;m × 15 cm ChromXP, 3 &amp;micro;米，300 &amp;Aring;)</td><td>Sciex LLC，美国马萨诸塞州弗雷明汉</td><td>804-00001</td><td></td></tr></tbody></table>

使用数据非依赖性采集质谱法定量位点特异性蛋白质赖氨酸乙酰化与琥珀酰化化学计量比

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

蛋白质赖氨酸残基的NƐ-酰化翻译后修饰可诱导结构变化，从而动态调控蛋白质功能，例如通过改变酶活性或介导分子间相互作用。精确量化特定位点的蛋白质酰化占据率（即化学计量比）对于理解整体低化学计量比以及特定赖氨酸残基的个别高化学计量比酰化事件的功能意义至关重要。已有研究组报道了通过比较内源性天然丰度酰化肽段与外源性重同位素标记酰化肽段的前体离子同位素比例，来测定赖氨酸乙酰化化学计量比的方法，其中重同位素标记通过使用稳定同位素标记的乙酸酐对蛋白质进行定量化学乙酰化后引入。本实验方案描述了一种经过优化的方法，包含多项改进：（1）提高了化学酰化效率；（2）能够同时检测蛋白质琥珀酰化和乙酰化；（3）通过采用数据非依赖采集（DIA）中的碎片离子定量而非数据依赖采集（DDA）中的前体离子信号定量，减少了干扰，从而提高了定量准确性。使用碎片离子的提取峰面积进行定量，还能够独特地区分含有多个赖氨酸残基的蛋白水解肽段中各个位点的酰化化学计量比，而这是使用前体离子信号定量所无法实现的。在Skyline（一个开源的定量蛋白质组学分析平台）中进行数据可视化，便于对数据进行便捷的检查与审阅。综上，该工作流程可对整个蛋白质组中特定位点的赖氨酸乙酰化和琥珀酰化占据率实现无偏倚、精确且准确的定量，有助于发现并优先筛选具有生物学意义的酰化位点。

数据采集后，从蛋白水解产生的酰化肽段中确定不同的MS2碎片离子，随后在Skyline软件中处理相应的提取离子色谱图（XIC），导出对应的轻标和重标峰面积，最终用于计算修饰位点占有率。图2A 展示了前体离子XIC可能出现的示意图，其中包含轻标和重标肽段信号；图2B 展示了相应碎片离子XIC的一个示例，采用颜色编码（红色=轻标，蓝色=重标）以区分含有赖氨酸酰化修饰的碎片离子。
图3 显示由占有率实验所得数据，例如上述分析在内部生成的轻/重琥珀酰化BSA预定义比例（1%、10%、50%或100%），并测定其琥珀酰化修饰占有率。将DIA占有率数据导入Skyline可实现目标树的便捷可视化，同时展示轻链和重链前体离子的肽段序列及碎片离子图3A）。DIA-MS 对每种定义的琥珀酰化 BSA 比例的数据揭示了轻链与重链 y 离子比例的内在相对差异7 离子，来自已鉴定的肽段-质谱匹配中排名最高的特征性碎片离子（以红色标示， 图3B). 图4 展示了经 MS2 占有率计算处理后的结果概览，证实了输入蛋白的琥珀酰化百分比占有情况，此处的输入蛋白为预先琥珀酰化的 BSA。针对从市售的预先琥珀酰化 BSA 中获得的 20 种蛋白酶解琥珀酰化肽段，测定了其赖氨酸琥珀酰化占有水平，这些肽段在已知百分比下进行了琥珀酰化处理（例如在0、1、10、50和100%条件下显示 表2对于20种蛋白酶解产生的BSA肽段中的每一种，均采用排名最高且具有区分性的MS2碎片离子来计算赖氨酸琥珀酰化（Ksucc）的占据率，即以L/(L+H)的百分比表示。总体而言，基于MS2的定量方法在确定酰化占据率方面表现出很高的准确性，即使在低化学计量比条件下也是如此。
<img alt="化学修饰过程、HPLC-MS 图谱：全乙酰化与全琥珀酰化，GluC 消化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：化学计量比工作流程。（A）蛋白质与乙酸酐-d6孵育三次，以乙酰化未修饰的赖氨酸残基。随后，将乙酰化后的蛋白质用内切蛋白酶Glu-C消化，并通过碱性pH反相色谱对蛋白水解肽段进行HPLC分级分离。最后，采用DIA技术并结合可变前体离子窗口宽度，通过LC-MS对肽段进行分析。（B）测定琥珀酰化化学计量比时采用相同的工作流程（如（A）所述），唯一不同是将重同位素酰化试剂更换为琥珀酸酐-d4。该图改编自Meyer et al.4（J. Am. Soc. Mass Spectrom., Open Choice）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="质谱离子强度图，SWATH方法；前体离子/碎片离子XIC，肽段分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：可能获得的数据示例及化学计量计算。（A）包含一个乙酰化赖氨酸的轻链（L）和重链（H）MS1前体离子相差3个质量单位。分别对红色和蓝色标示的轻链和重链同位素峰簇生成XIC（提取离子色谱图）。（B）可通过DIA采集获得的MS2碎片离子XIC进行定量分析，使用包含乙酰化位点的“可区分”轻链和重链碎片离子（分别以红色和蓝色标示）。共有的碎片离子以黑色虚线显示，不包含修饰位点。该图改编自Meyer et al.4（J. Am. Soc. Mass Spectrom., Open Choice）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Skyline 色谱图、碎片离子数据；蛋白质分析。示意图显示强度与保留时间的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：不同占据水平下琥珀酰化蛋白水解BSA肽的Skyline可视化分析。 （A）Skyline靶标树，显示蛋白水解肽LCKsuccVASLRE及其产生的碎片离子。（B）在不同琥珀酰化占据水平下的Skyline提取碎片离子色谱图。排名最高的区分性离子y7的峰面积随预琥珀酰化BSA输入百分比（实验室自制）的增加而相应增加，分别为1%、10%、50%和100%。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="琥珀酰化-K 肽的化学计量分析图；箱线图显示 K-琥珀酰化占据率比例。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图4：评估预琥珀酰化BSA的BSA酰化化学计量比。 五种不同重修饰百分比的BSA样品（例如在0、1、10、50和100%的轻修饰比例下，对五种不同BSA样品进行了MS2占有率测定。根据五种不同BSA样品在特定轻修饰百分比下获得的最高排名差异性碎片离子，确定了20个琥珀酰化BSA肽段的位点占有率。例如在0、1、10、50和100%条件下。箱须图显示了20个琥珀酰化肽段的分布情况，其中50%的肽段数值位于“箱”内（第25百分位数至第75百分位数），上须表示第75百分位数至最大值（第100百分位数）的数值范围，下须表示第25百分位数至最小值（第0百分位数）的数值范围。（J. Am. Soc. Mass Spectrom., Open Choice）。测量值的定量结果见于 表2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45.27</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>49.27</td>
			<td>69</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65.27</td>
			<td>61</td>
			<td>39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72.27</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>86.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">流速：0.7 mL/min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">缓冲液 A：水中含 10 mM 甲酸铵，pH 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">缓冲液 B：90% 乙腈和 10% 水中含 10 mM 甲酸铵，pH 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">注：使用纯氨水将两种流动相的 pH 调整至 10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：离线碱性pH反相HPLC分级的梯度程序。 梯度时间：120 min。缓冲液A：水中含10 mM甲酸铵，pH 10。缓冲液B：90% ACN和10%水中含10 mM甲酸铵，pH 10。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>L/L+H 百分比</td>
			<td>L/L+H 百分比</td>
			<td>L/L+H 百分比</td>
			<td>L/L+H 百分比</td>
			<td>L/L+H 百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ksucc 0%</td>
			<td>Ksucc 1%</td>
			<td>Ksucc 10% </td>
			<td>Ksucc 50% </td>
			<td>Ksucc 100% </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>11.1</td>
			<td>50.9</td>
			<td>99.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2</td>
			<td>2.3</td>
			<td>12.3</td>
			<td>49.4</td>
			<td>97.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.9</td>
			<td>3.8</td>
			<td>14</td>
			<td>48.6</td>
			<td>99.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>1.8</td>
			<td>11.7</td>
			<td>50.8</td>
			<td>99.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>11.1</td>
			<td>48.3</td>
			<td>98.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>11</td>
			<td>47.5</td>
			<td>96.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3</td>
			<td>1.6</td>
			<td>12.8</td>
			<td>51</td>
			<td>99.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7</td>
			<td>5.2</td>
			<td>14.7</td>
			<td>51.9</td>
			<td>89.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5</td>
			<td>1.8</td>
			<td>12.5</td>
			<td>47.2</td>
			<td>91.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8</td>
			<td>1.5</td>
			<td>11.3</td>
			<td>48.4</td>
			<td>96.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>1.6</td>
			<td>13.9</td>
			<td>49.7</td>
			<td>98.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>10.7</td>
			<td>48.2</td>
			<td>98.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>0.9</td>
			<td>10.3</td>
			<td>49.4</td>
			<td>99.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>17.2</td>
			<td>52.3</td>
			<td>97.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1</td>
			<td>3.5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>51</td>
			<td>99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3</td>
			<td>1.9</td>
			<td>10.7</td>
			<td>49.6</td>
			<td>98.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>10.9</td>
			<td>47.7</td>
			<td>96.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3</td>
			<td>1.2</td>
			<td>10</td>
			<td>53</td>
			<td>98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.1</td>
			<td>1.8</td>
			<td>12.9</td>
			<td>57.9</td>
			<td>94.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>1.4</td>
			<td>11.6</td>
			<td>48.6</td>
			<td>98.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：20种蛋白水解琥珀酰化肽段中BSA赖氨酸琥珀酰化占有率的定量结果 从商业预琥珀酰化BSA中获得的琥珀酰化肽段，其琥珀酰化程度为已知的百分比（例如，分别在0、1、10、50和100%条件下。对于20种蛋白酶解产生的BSA肽段，采用排名最高且具有区分能力的MS2碎片离子计算赖氨酸琥珀酰化（Ksucc）的占据率，以L/(L+H)的百分比（%）表示。

本文通过内源性修饰与使用稳定同位素标记酸酐进行定量化学酰化后引入的修饰之间的比率分析，实现了对整个蛋白质组中位点特异性蛋白质乙酰化和/或琥珀酰化占有率（化学计量比）的无偏定量。结合高灵敏度的数据非依赖性采集质谱技术，可获得准确的位点占有率测量结果。

蛋白质赖氨酸残基的Nε-酰基化作为一种翻译后修饰（PTM），可诱导蛋白质发生结构变化，从而动态调控其功能……

本新型工作流程的总体目标是确定特定乙酰化位点上蛋白质翻译后修饰的占据率或化学计量比。该新型质谱工作流程可实现更高精度的定量分析。该方法有助于回答有关翻译后修饰（如赖氨酸乙酰化或琥珀酰化位点）对蛋白质可逆调控的关键问题，例如哪些位点的修饰程度最高，可能影响蛋白质功能。该技术的主要优势在于能够准确测定赖氨酸乙酰化和琥珀酰化的位点特异性化学计量比，并且该方法可对含有多个赖氨酸残基的肽段进行化学计量比分析。该技术具有高度相关性，因为它揭示的是乙酰化和琥珀酰化的化学计量比或修饰与未修饰的比例，而非仅测量无量纲的相对丰度变化。当我意识到采用数据非依赖性采集和基于MS2的定量方法进行化学计量分析将显著提高测量准确性时，首次提出了该方法的构想。准备三份100

quantification-site-specific-protein-lysine-acetylation-succinylation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

用数据无关采集质谱法定量测定点特异蛋白赖氨酸乙酰化和琥珀酰化化学计量学

我们介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离质谱结合还原性甲基化化学方法来定量分析赖氨酸甲基化变化的技术。...

MassSQUIRM 定量检测赖氨酸去甲基化酶活性的应用

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

本方案描述了执行所需的步骤 体外 和 体内...

去乙酰化实验揭示Sirtuins（SIRT2）与特定蛋白底物之间的相互作用

本方案概述了一种利用质谱法（MS）全面表征组蛋白翻译后修饰的整合工作流程。该流程包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化与消化、采用纳米流速液相色谱进行质谱分析，以及数据分析的详细说明。本方案设计可在2至3天内完成。...

使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

遗传密码子扩展是一种研究多种生物过程（包括蛋白质乙酰化）的强大工具。本文展示了一种简便的实验方案，利用该技术在大肠杆菌（Escherichia...

一种简便的定点乙酰化蛋白质制备方案 大肠杆菌

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

使用酰基树脂辅助捕获法检测蛋白质S-酰化

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

学习使用数据无关采集质谱法定量测定蛋白质赖氨酸乙酰化和琥珀酰化的位点特异性化学计量学。该方法可精确分析多位点肽段的修饰比例，为研究蛋白质可逆调控机制提供高准确度工具。

使用数据非依赖性采集质谱法定量位点特异性蛋白质赖氨酸乙酰化与琥珀酰化化学计量比

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