Pax7 和层粘连蛋白抗体免疫荧光法鉴定骨骼肌卫星细胞

该方案的总体目标是通过免疫荧光鉴定成人骨骼肌卫星细胞。这种方法可以回答与生理和病理条件下肌肉干细胞的数量和分布相关的关键问题。该技术的主要优点是，只需有限的作即可识别生理环境中的肌肉干细胞。

演示该程序的是我实验室的博士后 Faiza Naz。首先，通过将液氮倒入杜瓦瓶中来准备液氮浴。接下来，将 10 毫升甲基丁烷倒入 20 毫升塑料烧杯中，然后将烧杯转移到液氮浴中。

将解剖的胫骨前肌放在一个小塑料注射器柱塞的平面上。接下来，用几滴最佳切割温度化合物或 O.C.T.从液氮浴中取出甲基丁烷烧杯，然后用剪刀的手柄解冻表面。将 O.C.T. 覆盖的组织快速浸入融化的甲基丁烷中，使其快速冷冻。

接下来，使用镊子将嵌入的组织从柱塞上分离，并将其转移到 1.5 毫升微量离心管中。然后，将微量离心管储存在液氮中。要开始低温恒温器切片，请在低温恒温器的样品架中心加入一滴 O.C.T.化合物，并使其部分凝固。

然后，将包埋的组织插入 O.C.T.化合物中，脚踝面朝下，膝盖面朝上。接下来，将样品架安装到低温恒温器上，并以 10 微米的间隔切割组织。在每个霜冻涂层载玻片上收集 4 到 8 个冷冻切片。

在室温下干燥切片 3 小时，然后将载玻片收集在载玻片盒中并储存在零下 80 摄氏度。接下来，从载玻片盒中取出载玻片并将其加热至室温。然后，使用液体阻滞笔在冷冻切片周围标记一个区域，以防止液体从侧面流出。

在通风橱中，向标记区域添加 300 至 500 微升 4% 多聚甲醛。将玻片在室温下孵育 10 分钟以固定切片。接下来，在载玻片容器中用 PBS 冲洗载玻片上的多聚甲醛。

要开始抗原修复，请在载玻片容器中填充 200 毫升柠檬酸盐缓冲液，然后将载玻片转移到容器中。然后，将载玻片容器转移到高压锅中 10 分钟。如果切片在室温下干燥 30 分钟并立即进行，则抗原修复步骤是可选的。

那么抗原修复步骤就不是必需的。但是，如果切片在室温下干燥超过 3 小时，然后在零下 80 摄氏度下储存，则需要进行抗原修复步骤。接下来，将玻片容器在流水下冷却 10 分钟。

然后将载玻片转移到装有 200 毫升 PBST 的新容器中，并用 PBST 冲洗。将浸过水的实验室湿巾添加到托盘中，然后用 PAP 笔标记冲洗过的载玻片并将其放入托盘中。向载玻片中加入 200 微升封闭溶液。

然后盖上托盘，在室温下孵育 30 分钟。封闭步骤非常重要，因为使用的 Pax7 抗体是小鼠单克隆抗体。mouse-on-mouse blocking 步骤减少了非特异性绑定。

然后，在载玻片容器中用 PBST 冲洗载玻片并将其放回托盘中。向玻片中加入 200 μL 一抗混合物，并在室温下孵育 1 小时。接下来，用 PBST 冲洗玻片，然后加入 200 μL 二抗混合物，并在室温下避光孵育 1 小时。

孵育期后，用 PBST 冲洗载玻片。在玻片容器中稀释 DAPI，并在容器中孵育玻片 3 分钟。然后，用 PBST 冲洗 DAPI 5 分钟。

最后，用封固剂安装载玻片并盖上盖玻片。在这项研究中，卫星细胞在荧光显微镜下成功地在成人静息肌切片中可视化。通常出现在成人肌肉组织和某些类型的纤维中看到的背景噪声可以通过使用鼠标对鼠标的阻断来降低。

通过使用与明亮的 Alexa 染料偶联的二抗来增强特异性免疫染色信号。与宽视场荧光显微镜相比，双光子共聚焦显微镜可捕获更清晰的图像。相同的方案也可以应用于幼年小鼠、小鼠胚胎和受伤的成年肌肉组织的肌肉组织。

幼年和胚胎肌肉组织都描绘了更活跃的卫星细胞或具有相对更大细胞核的 Pax7 肌原前体。因此，与成年小鼠相比，年轻小鼠的卫星细胞更容易可视化。在受伤的肌肉组织中，可以看到更多活化的 Pax7 阳性细胞。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住来自自发荧光和非特异性小鼠对小鼠免疫结合的噪音不能完全消除，但通过此方案可以大大降低噪音。观看此视频后，您应该对如何在肌肉冷冻切片中识别卫星细胞有很好的了解。