柑橘叶片组织样本中柑橘黄龙病病原菌 Candidatus liberibacter spp. 的常规 PCR 特异性与准确性检测

本实验的总体目标是准确检测柑橘叶片组织中的柑橘黄龙病病原体“ Candidatus liberibacter spp.”。该方法可使柑橘种植户和研究人员快速、准确地鉴定导致柑橘黄龙病的病原体是否存在。

演示该实验操作的是我实验室的研究生 Ian Palmer。该方法高效、经济，并适用于定量分析。此外，该方法对实验室经验和技术设备的要求极低，易于开展。

首先使用干净的剪刀从柑橘树上剪下一整片新鲜叶片，并放入干净的塑料三明治袋中。然后加入少量液氮，预冷研钵和研杵。接着用剪刀将叶片组织剪成小块，每块大小约为一平方英寸。

将叶片放入研钵中，立即冷冻。迅速开始用研钵研磨叶片组织，直至液氮挥发，留下细嫩的绿色粉末。接着将金属刮刀浸入液氮中冷却10至15秒。

然后使用冰冷的刮勺将研钵中的组织粉末转移到1.5 mL微量离心管中。用1000 µL移液器向样品中加入600 µL细胞核裂解液。随后将样品涡旋振荡1至3秒。

将试管置于65摄氏度的水浴中孵育15分钟。孵育结束后，使用10 mL移液器向裂解液中加入3 mL RNA溶液以去除RNA。然后通过倒置试管2至5次，混匀管内内容物。

在培养箱中于 37 摄氏度孵育 15 分钟。15 分钟后，向样品中加入 200 µL 蛋白质沉淀溶液。将离心管高速涡旋振荡 20 秒。

接下来将样品在13000G条件下离心3分钟。在离心过程中，向一个新的1.5 mL微量离心管中加入600 µL室温保存的异丙醇。离心结束后，小心地将离心管中的上清液转移至含有异丙醇的试管中。

弃去沉淀。将离心管倒置，使DNA呈现为可见的丝状物。随后在室温下以13000G离心1分钟。

离心后弃去上清液。然后向沉淀中加入600 µL 70%乙醇。反复倒置离心管数次以洗涤沉淀。

将离心管在13000G条件下离心1分钟。离心结束后，小心吸去上清液。然后将管盖打开，倒置在吸水纸上，室温晾干15分钟。

干燥后，向沉淀中加入100 mL DNA重悬液。将DNA悬浮液置于65摄氏度的水浴中孵育1小时，期间定期轻弹管壁以混匀。

在微量比色皿中加入 1 mL 纯化水。将水作为空白对照在分光光度计上读数。然后在微量比色皿中加入 1 mL 样品。

将微量比色皿置于分光光度计上，测定DNA浓度。在一支50 µL PCR管中加入所有试剂及100纳克基因组DNA，配制PCR反应体系。轻轻弹击管壁以混匀试剂，随后进行短暂离心。

将PCR管放入热循环仪中并运行程序。准备琼脂糖凝胶时，称取0.4克琼脂糖粉末，将其加入200 mL锥形瓶中，用1×TAE缓冲液定容至50 mL。

将琼脂糖混合物在微波炉中高火加热约1.5分钟，每30秒摇动一次，直至琼脂糖完全溶解。然后向液态琼脂糖中加入2.5 mL浓度为10毫克/毫升的溴化乙锭。

然后轻轻摇晃烧瓶以混匀溴化乙锭，迅速将液态琼脂糖凝胶倒入水平的凝胶模具中。立即插入标准的12齿凝胶梳子。室温下静置冷却约20分钟，然后小心移除凝胶梳子。

现在将凝固的凝胶放入装有1× TAE缓冲液的电泳仪中。将总扩增的DNA样品和5 µL DNA分别加入凝胶的不同加样孔中。启动电泳仪，以恒定的90伏电压电泳35分钟。

然后从电泳仪中取出凝胶。接着将凝胶置于紫外透射仪上，在302纳米波长下拍摄凝胶条带模式的图像。

为了鉴定引起黄化病的细菌，将来自感病和未感病样品的PCR扩增基因组DNA进行电泳。在凝胶中，大小为500个碱基对的条带表明CLas细菌的16S核糖体DNA中存在特定区域；而大小为700个碱基对的条带则表明细菌16S核糖体β操纵子DNA序列中存在LAA2/LAJ5及插入片段。

在400个碱基对处出现的这些明显条带表明仅扩增了柑橘F-box基因，该条带代表内部扩增对照。为确保实验结果有效，此条带必须存在。相反，若仅在400个碱基对处出现条带，而在500和700个碱基对处无条带，则表明柑橘组织健康。

一旦掌握，该技术若操作得当，约需四小时即可完成。此方法可进行调整，以适用于更定量的检测手段，例如采用 RT-qPCR 来检测病原体的存在量。