Name: 利用常规 PCR 技术对柑桔叶片组织样品Candidatus liberibacter的特异和准确检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习使用常规PCR技术检测柑桔叶片组织中Candidatus liberibacter病原菌的方法。该技术高效、经济，适用于农业科研和病害管理，操作简便。

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概念化设计，H.C. 和 Z.Q.F.；调查研究，H.C.、J.C. 和 Z.Q.F.；资源支持，Z.Q.F.；撰写-初稿，I.A.P.；撰写-审稿 &amp;#38; 编辑，I. A. P.，J. C.，H. C.，S. L. T. 和 Z. Q. F.；可视化，H. C.；监督，Z. Q. F.；经费获取，Z. Q. F. 和 F. Q. L.
项目由南卡罗来纳州提高教师质量高等教育州拨款资助，项目名称为， 通过参与植物科学研究提升初中科学教师对植物过程、结构与功能的认知（植物科学）
美国教育部（联邦资助编号 84.367B）提供的资金
作者感谢佛罗里达大学的 Nian Wang 博士提供了感染的Citrus sinensis Valencia 基因组 DNA 样本。

1. 使用基因组提取试剂盒从植物组织中分离基因组DNA
<ol>
	<li>使用干净的剪刀从柑橘树上剪下一整片新鲜叶片，获取柑橘叶片组织，并将叶片放入干净的塑料密封袋中。 
	注意：采集后应尽快将装有叶片组织的袋子置于4 °C冰箱中或放入装有冰块的保温容器中，以避免组织变质。</li>
	<li>向研钵和研杵中加入少量液氮进行预冷。在预冷过程中，用剪刀剪取一小片叶片组织，大小约为1平方英寸。将剪下的组织放入研钵中，使其迅速冻结。如有需要，可补充更多液氮。 
	注意：操作液氮时应始终佩戴隔热手套。</li>
	<li>使用研钵快速将植物组织研磨成细粉。持续研磨直至液氮完全蒸发，留下细腻的绿色粉末。</li>
	<li>将金属刮勺在液氮中短暂冷却10 -&#160;15秒，然后用刮勺将研磨好的组织从研钵中转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>使用1000 µL移液器加入600 µL核裂解液（见材料表），涡旋混匀1 - 3秒，随后在65 °C水浴中孵育15分钟。</li>
	<li>使用10 µL移液器向裂解液中加入3 µL RNase溶液，轻轻颠倒离心管2 - 5次以混匀，然后在37 °C培养箱中孵育15分钟。 
	注意：继续下一步操作前，需让混合物冷却至室温。</li>
	<li>加入200 µL蛋白质沉淀液，高速涡旋20秒，然后在13,000 x g条件下离心3分钟，形成坚实的沉淀。在样品离心的同时，向一个新的1.5 mL微量离心管中加入600 µL室温异丙醇。</li>
	<li>使用1000 µL移液器小心吸取离心后的上清液，将其转移至含有异丙醇的新1.5 mL微量离心管中。此时可弃去沉淀。 
	注意：为避免蛋白质污染上清液，应在沉淀上方保留极微量的上清液。</li>
	<li>轻轻颠倒离心管，直至DNA以丝状团块形式可见，然后在室温下以13,000 x g离心1分钟。</li>
	<li>倒掉上清液，向沉淀中加入600 µL 70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次以洗涤DNA，然后在13,000 x g条件下离心1分钟。</li>
	<li>小心吸除乙醇，保留松散的DNA沉淀，然后打开离心管并倒置放置于吸水纸上。在室温下空气干燥15分钟。</li>
	<li>向干燥的DNA沉淀中加入100 µL DNA重悬液，然后将DNA样品置于65 °C水浴中孵育1小时，期间通过轻弹管壁定期混匀。</li>
	<li>取1 µL纯化水加入微量比色皿中，插入分光光度计作为空白对照。将1 µL样品加入微量比色皿并插入分光光度计，测定DNA浓度。DNA浓度（ng/µL）可按以下公式计算：(A260 - A320) × 稀释倍数 × 50 ng/µL。 
	注意：此处可暂停实验流程。样品可在4 °C条件下保存。</li>
</ol>
2. 对基因组DNA样本进行PCR
<ol>
	<li>在50 µL PCR管中加入10 µL 2x PCR预混液（见材料表）、1 µL上游引物（10 pM/µL）、1 µL下游引物（10 pM/µL）（引物序列见表2）、100 ng从样品中提取的基因组DNA，以及纯水（加至终体积20 µL），轻轻弹击混匀，并短暂离心。</li>
	<li>将PCR管放入热循环仪中，按相应程序运行（见表1）。 
	注意：此步骤可暂停。如需暂停，反应完成后可将样品在4 °C保存。</li>
</ol>
3. 在琼脂糖凝胶中电泳扩增的DNA
<ol>
	<li>称取 0.4 g 琼脂糖粉末，加入洁净的 200 mL 锥形瓶中，并加入 1x TAE 缓冲液至总体积达 50 mL。</li>
	<li>在微波炉中高火加热 1.5 分钟，每隔 30 秒摇动一次，直至琼脂糖完全溶解。 
	注意：操作液态琼脂糖时应佩戴隔热手套，以防烫伤。</li>
	<li>向液态琼脂糖中加入 2.5 µL 的 10 mg/mL 溴化乙锭溶液，轻轻振荡混匀，然后将液体琼脂糖倒入水平凝胶模具中。倾倒后立即插入标准的 12 齿凝胶梳。</li>
	<li>室温下静置冷却 20 分钟，待凝胶完全凝固后小心拔出梳子，将凝胶放入盛有 1x TAE 缓冲液的水平电泳槽中。</li>
	<li>使用微量移液器将全部扩增后的 DNA 样品加入加样孔中。另选一个加样孔加入 5 µL DNA 分子量标记物（见材料表）。</li>
	<li>在恒定 90 V 条件下电泳 35 分钟，随后取出凝胶并置于紫外透射仪中。</li>
	<li>在 302 nm 紫外光照射下拍摄并分析凝胶条带模式。</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen、Ian Arthur Palmer、Jian Chen、Ming Chang、Stephen L. Thompson、Fengquan Liu 和 Zheng Qing Fu 宣布不存在利益冲突。

必须严格遵循所有步骤，以获得最佳实验条件。本演示中使用了完整的叶片组织；然而，理论上该方案可经修改后适用于任何类型的植物组织。此前，研究人员曾从叶脉组织而非完整叶片组织中提取基因组DNA，并获得了类似的结果11。如果柑橘FBOX基因对应的条带未能出现，则结果无效，操作过程中可能存在一种或多种技术性错误。常见错误包括：使用被污染或未正确灭菌的水、微量移液器吸头或微量离心管；在PCR反应体系或基因组DNA提取过程中遗漏一种或多种必要组分；未维持正确的PCR仪循环条件；使用过期的试剂或其他成分；未向琼脂糖凝胶中添加溴化乙锭或其他DNA染料；对扩增后的DNA进行电泳时电压过高或时间过长；以及使用陈旧或配制不当的TAE缓冲液，或直接用水代替TAE缓冲液填充电泳槽。
引物 LAA2_F 和 LAJ5_R 选自先前的研究，因其在鉴定Candidatus Liberibacter asiaticum 和 africanum 方面具有成功应用。这些引物可扩增核糖体亚基基因 rplA 和 rp...

柑橘黄化病，又称黄龙病，已导致大量柑橘树死亡。一个典型的例子是美国佛罗里达州，据预测，该病将使佛罗里达州的橙子产量从1997—1998产季的2.44亿箱下降至2016—2017产季的7000万箱，降幅达70%1。佛罗里达州超过90%的柑橘树已被感染2，据估计，佛罗里达州柑橘产业每年因柑橘病害造成的损失约为10亿美元，其中柑橘黄化病起着主要作用3。柑橘黄化病主要由入侵性害虫亚洲柑橘木虱 Diaphorina citri 传播，也可通过嫁接感染组织进行传播。 该病害会导致叶脉黄化、叶片出现不对称的黄斑、过早落叶、枝条枯死、根系腐烂，并最终导致植株死亡。尤为重要的是，该病害会使柑橘植株在非正常季节开花，而这些花极少能结果。受感染柑橘植株所结出的果实未成熟、呈绿色，且味道苦涩4。
本方法的目的是准确且精确地鉴定出生活在受感染柑橘树木韧皮部内的运动细菌Candidatus liberibacter spp.，该细菌是柑橘黄化病的致病因子5。从整片叶片组织中提取基因组DNA，其中含有活细菌。提取的基因组DNA用作常规PCR的模板，使用与该细菌16S rDNA序列互补的寡核苷酸来扩增该序列。同时使用与柑橘FBOX基因互补的寡核苷酸作为内部扩增对照。我们选择该方法是因为其在先前的研究中已被证明是成功的6。
该方法具有明显的优势，即操作简单、成本相对较低，且可在任何常规配置的生物化学实验室中进行。此外，由于该病原体难以培养7，且能够在无症状宿主内长期存活并繁殖8，PCR 仍是检测该病原体最准确、最精确的方法。已有多种不同的专业 PCR 检测方法成功用于该病原体的检测；然而，常规 PCR 仍是实现准确且特异性检测的最简单方法，尤其适用于无症状宿主的检测8。

<table><tbody><tr><td>Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>细胞核裂解液、RNase、蛋白质沉淀液和 DNA 重悬液的来源</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>配备控制面板的 Mastercycler pro</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W 微波炉</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 数字水浴锅</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>金属刮勺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE 涡旋混合器</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>无菌 10 &amp;mu;L 吸头</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>无菌 200 &amp;mu;L 吸头</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>无菌 1250 &amp;mu;L 吸头</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>可调体积移液器套装</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;比色皿</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>可堆叠制胶托盘和梳子</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源供应器</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT 电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biospectrometer basic 分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 管</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR 预混液</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>正向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>反向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PCR 级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+ 凝胶成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ DNA 标准分子量标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

柑橘叶片组织样本中柑橘黄龙病病原菌 candidatus liberibacter spp. 的常规 pcr 特异性与准确性检测

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

柑橘黄龙病，又称柑橘黄化病，是一种在全球范围内严重危害柑橘种植园的毁灭性病害。该病可导致叶片出现不对称的黄斑、叶脉黄化、落叶、根系腐烂，最终致使柑橘植株死亡。感病植株生长受阻，并在非正常花期开花。这些花朵极少结果，即使结果，所产果实也通常个头小、味道苦涩、形状不规则，商品价值低。该病害由亚洲柑橘木虱传播。 Diaphorina citri 并通过嫁接感染的柑橘组织进行传播。该病原体在柑橘植株体内的潜伏期较长且具有变异性，有时可达数年，之后症状才开始显现。尝试培养该病原体 体外 由于病原体在感染的柑橘组织中浓度较低且分布不均，或因为难以模拟适合该病原体生长的环境条件，此前的培养尝试均未成功。由于该病害潜伏期较长，且研究人员无法对病原体进行体外培养，因此在病害扩散之前极难被识别。结果往往是该病突然暴发，导致柑橘种植户整季收成被彻底摧毁。本文介绍了一种准确且特异性检测柑橘黄龙病病原体的方法， 候选属 使用基因组DNA提取试剂盒和PCR检测韧皮部杆菌属（liberibacter spp.）。该方法简便、高效、成本低，且适用于定量分析。该方法可应用于任何柑橘组织，但其效果可能受限于组织中病原体的含量。尽管如此，该方法能使柑橘种植户更早地识别受感染的柑橘植株，从而在这一破坏性病害进一步扩散之前有效遏制其传播。

阳性结果会显示出一条对应于500 bp的清晰条带 候选属 Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, 和/或对应于 700 bp 的一条明显条带 Laa2/Laj5 16S 核糖体 β 操纵子中的一个插入片段9. 内参扩增对照条带也必须在400 bp处出现。该条带对应于柑橘的扩增 FBOX 基因10，且必须出现才能视为结果有效（图1 和 图2）。若500 bp和700 bp条带均未出现，而仅出现400 bp条带，则表示结果为阴性。对健康样本进行PCR扩增时，可能会在700 bp和400 bp附近出现一些非特异性条带；然而，只有当出现对应于这些分子量的单一清晰强条带...

柑橘黄龙病是一种对全球柑橘作物具有严重破坏性的病害。本文介绍一种简单的方法，通过提取柑橘叶片组织的基因组DNA并进行PCR检测，准确且精确地鉴定引起柑橘黄龙病的病原体Candidatus liberibacter spp.

柑橘叶片组织样本中柑橘黄龙病病原菌 Candidatus liberibacter spp. 的常规 PCR 特异性与准确性检测

柑橘黄龙病，又称柑橘黄化病，是一种具有破坏性的柑橘病害，正在全球范围内严重危害柑橘种植园。该病害导致叶片出现不对称黄化……

本实验的总体目标是准确检测柑橘叶片组织中的柑橘黄龙病病原体“ Candidatus liberibacter spp.”。该方法可使柑橘种植户和研究人员快速、准确地鉴定导致柑橘黄龙病的病原体是否存在。演示该实验操作的是我实验室的研究生 Ian Palmer。该方法高效、经济，并适用于定量分析。此外，该方法对实验室经验和技术设备的要求极低，易于开展。首先使用干净的剪刀从柑橘树上剪下一整片新鲜叶片，并放入干净的塑料三明治袋中。然后加入少量液氮，预冷研钵和研杵。接着用剪刀将叶片组织剪成小块，每块大小约为一平方英寸。将叶片放入研钵中，立即冷冻。迅速开始用研钵研磨叶片组织，直至液氮挥发，留下细嫩的绿色粉末。接着将金属刮刀浸入液氮中冷却10至15秒。然后使用冰冷的刮勺将研钵中的组织粉末转移到1.5 mL微量离心管中。用1000 µL移液器向样品中加入600 µL细胞核裂解液。随后将样品涡旋振荡1至3秒。将试管置于65摄氏度的水浴中孵育15分钟。孵育结束后，使用10 mL移液器向裂解液中加入3 mL RNA溶液以去除RNA。然后通过倒置试管2至5次，混匀管内内容物。在培养箱中于 37 摄氏度孵育 15 分钟。15 分钟后，向样品中加入 200 µL 蛋白质沉淀溶液。将离心管高速涡旋振荡 20 秒。接下来将样品在13000G条件下离心3分钟。在离心过程中，向一个新的1.5 mL微量离心管中加入600 µL室温保存的异丙醇。离心结束后，小心地将离心管中的上清液转移至含有异丙醇的试管中。弃去沉淀。将离心管倒置，使DNA呈现为可见的丝状物。随后在室温下以13000G离心1分钟。离心后弃去上清液。然后向沉淀中加入600 µL 70%乙醇。反复倒置离心管数次以洗涤沉淀。将离心管在13000G条件下离心1分钟。离心结束后，小心吸去上清液。然后将管盖打开，倒置在吸水纸上，室温晾干15分钟。干燥后，向沉淀中加入100 mL DNA重悬液。将DNA悬浮液置于65摄氏度的水浴中孵育1小时，期间定期轻弹管壁以混匀。在微量比色皿中加入 1 mL 纯化水。将水作为空白对照在分光光度计上读数。然后在微量比色皿中加入 1 mL 样品。将微量比色皿置于分光光度计上，测定DNA浓度。在一支50 µL PCR管中加入所有试剂及100纳克基因组DNA，配制PCR反应体系。轻轻弹击管壁以混匀试剂，随后进行短暂离心。将PCR管放入热循环仪中并运行程序。准备琼脂糖凝胶时，称取0.4克琼脂糖粉末，将其加入200 mL锥形瓶中，用1×TAE缓冲液定容至50 mL。将琼脂糖混合物在微波炉中高火加热约1.5分钟，每30秒摇动一次，直至琼脂糖完全溶解。然后向液态琼脂糖中加入2.5 mL浓度为10毫克/毫升的溴化乙锭。然后轻轻摇晃烧瓶以混匀溴化乙锭，迅速将液态琼脂糖凝胶倒入水平的凝胶模具中。立即插入标准的12齿凝胶梳子。室温下静置冷却约20分钟，然后小心移除凝胶梳子。现在将凝固的凝胶放入装有1× TAE缓冲液的电泳仪中。将总扩增的DNA样品和5 µL DNA分别加入凝胶的不同加样孔中。启动电泳仪，以恒定的90伏电压电泳35分钟。然后从电泳仪中取出凝胶。接着将凝胶置于紫外透射仪上，在302纳米波长下拍摄凝胶条带模式的图像。为了鉴定引起黄化病的细菌，将来自感病和未感病样品的PCR扩增基因组DNA进行电泳。在凝胶中，大小为500个碱基对的条带表明CLas细菌的16S核糖体DNA中存在特定区域；而大小为700个碱基对的条带则表明细菌16S核糖体β操纵子DNA序列中存在LAA2/LAJ5及插入片段。在400个碱基对处出现的这些明显条带表明仅扩增了柑橘F-box基因，该条带代表内部扩增对照。为确保实验结果有效，此条带必须存在。相反，若仅在400个碱基对处出现条带，而在500和700个碱基对处无条带，则表明柑橘组织健康。一旦掌握，该技术若操作得当，约需四小时即可完成。此方法可进行调整，以适用于更定量的检测手段，例如采用 RT-qPCR 来检测病原体的存在量。

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科研

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Environment

环境

利用常规 PCR 技术对柑桔叶片组织样品Candidatus liberibacter的特异和准确检测

来源：Gulla, S., 等. 利用多重PCR和毛细管电泳对鱼类致病性细菌Yersinia ruckeri进行多位点可变数目串联重复序列分析。J. Vis. Exp. (2019)。本方案通过将分离的菌落悬浮于超纯水中并加热裂解细胞，从而提取 Yersinia ruckeri...

从感染致病细菌的植物叶片组织中提取基因组DNA

来源：Chen, H., 等．利用常规PCR对柑橘叶片组织样本中柑橘黄龙病病原菌Candidatus liberibacter spp.进行特异且准确的检测．J. Vis. Exp.

从叶片中提取总DNA以检测细菌感染

病原菌生长的定量分析是表征多种Arabidopsis thaliana（以下简称：拟南芥）免疫反应的有力工具。本文所述方法提供了一种优化的注射浸润实验，用于定量测定丁香假单胞菌致病变种（Pseudomonas syringae pv. maculicola）ES4326...

利用细菌叶片浸润实验精细表征植物防御反应 拟南芥-丁香假单胞菌 病理系统

巢式PCR是一种灵敏、特异且操作简便的技术，可用于检测蜱虫DNA提取物中的莱姆病病原体——伯氏疏螺旋体（Borrelia...

使用巢式 PCR 在蜱虫中检测莱姆病螺旋体 Borrelia burgdorferi

本文报道了一种基于环介导等温扩增（LAMP）技术的烟粉虱（Bemisia...

一种用于快速鉴定烟粉虱（Bemisia tabaci）的环介导等温扩增（LAMP）检测方法

我们开发了一种利用滤纸DNA提取法结合环介导等温扩增（LAMP）检测技术来检测水源中Phytophthora...

使用环介导等温扩增法检测灌溉水中的Phytophthora capsici

本研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增联合CRISPR-Cas12a的快速、灵敏且便携的Candidatus Liberibacter...

可现场部署的结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR-Cas12a技术的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法

我们设计、制造并验证了一种可快速处理富含韧皮部的柑橘接穗组织的仪器。与现有方法相比，接穗组织提取仪（BTE）提高了样品通量，同时降低了所需的人力和设备成本。...

通过仪器工程实现柑橘接穗加工自动化以进行下游病原体检测

本文描述了一种新型的直接植物输注装置，用于筛选分子对细菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）或其昆虫媒介（Diaphorina citri,...

用于植物分子递送的直接灌注装置

本方案介绍了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测技术的方法，用于检测侵入性植物病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense...

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