一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物
2018年3月10日
本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。
基于细胞的检测方法的总体目标是鉴定能够与G蛋白偶联受体结合的分子，其原理是检测这些分子是否能够与荧光标记的配体竞争结合该受体。竞争性结合实验可支持G蛋白偶联受体相关的药物发现研究。
正如我们将通过本趋化因子受体CXCR4的实验方案所展示的那样，该方法的主要优势在于使用活细胞来分析受体结合，而非使用固定细胞样本，同时避免了放射性标记探针的使用。
尽管该方法最初是为研究与趋化因子受体 CXCR4 的结合而建立的，但也可开发用于其他已有荧光标记配体的 GPCR。首先，根据预设的实验设计，将 100 微升化合物溶液加入透明的 96 孔圆底板中。然后使用多通道移液器，从试剂储液槽中向 96 孔板加入 50 微升细胞悬液。
将培养板在避光条件下于室温孵育15分钟。孵育结束后，从同一试剂储液槽中向96孔板的各孔加入50微升荧光标记的CXCL12（浓度为100纳克/毫升）。在避光条件下于室温继续孵育30分钟。
接下来，在室温下将96孔板以400 × g离心5分钟。通过翻转孔板去除沉淀细胞中的上清液。将孔板在纸巾上干燥。
使用多通道移液器，从试剂储液槽中向各孔加入 200 微升新鲜的 SA 缓冲液。立即再次将酶标板以 400 × g 离心 5 分钟，温度为室温。再次通过翻转酶标板并在纸巾上干燥的方式去除上清液。
最后，将细胞沉淀轻轻重悬于200 µL含1%多聚甲醛的PBS溶液中。此步骤可固定细胞。若需通过流式细胞术分析样品，需启动仪器并打开相应的软件。
选择以点阵图形式显示的细胞参数，如前向散射面积、侧向散射面积，以及以直方图形式显示的荧光四通道检测信号。选择一个样本，例如阴性对照样本，根据前向散射和侧向散射参数对特定的均一细胞群体进行设门。
调整将细胞上样至流式细胞仪的设置。在进样前选择三次混匀。选择自动进样100微升固定后的细胞，样品流速设为1.5微升每秒。
通过选择“采集数据”来运行样本。该样本的前向散射和侧向散射参数，以及荧光四通道检测结果将显示在屏幕上。现在，选择软件设门工具。
根据前向散射和侧向散射点图的可视化结果，通过设门预定义一个均一且具有活力的细胞群体。选择每样本分析 20,000 个事件。这意味着对于每个样本，最终将分析位于预设门控范围内的 20,000 个细胞。
数据采集将持续进行，直到达到此事件数量为止。首先选择要分析的孔，然后点击运行孔开始实验。
流式细胞仪将逐个分析这些样本，记录每个样本的平均荧光强度，该强度对应于位于预设门控范围内的20,000个细胞所产生的平均荧光信号。最后，按照实验方案中所述进行数据分析。
在用高浓度AMD3100（一种尚未明确且特异性的CXCR4拮抗剂）预孵育Jurkat细胞后，反映标记CXCL12结合水平的平均荧光强度几乎完全降低至背景水平。这表明CXCL12与Jurkat细胞表面表达的CXCR4之间具有高度特异性结合。
无法与标记的 CXCL12 在 CXCR4 受体上竞争结合的化合物（如 CCR5 拮抗剂马拉维若）不会影响平均荧光强度。相反，高活性化合物则会以剂量依赖的方式产生影响。观看视频后，您应能充分理解如何利用活细胞和流式细胞术进行竞争性受体结合实验。
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概述
本文介绍了一种基于流式细胞术的细胞结合实验方法，旨在鉴定能够抑制CXCL12与CXCR4结合的化合物。该方法利用活细胞分析受体结合，避免了放射性标记的使用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞结合实验
- G蛋白偶联受体
- 药物发现
背景
- CXCL12 是一种趋化因子，可与 G 蛋白偶联受体 CXCR4 结合。
- 鉴定抑制这种结合的分子有助于药物开发。
- 传统方法通常涉及放射性物质，而本实验旨在避免使用此类物质。
- 使用活细胞能够更真实地反映生物体内的相互作用。
研究目的
- 开发一种用于筛选抑制CXCL12与CXCR4结合的化合物的检测工具。
- 展示在结合实验中使用活细胞的优势。
- 支持G蛋白偶联受体药物发现的研究工作。
使用的方法
- 采用流式细胞术分析细胞结合。
- 使用荧光标记配体评估结合竞争。
- 利用活细胞实验评估受体相互作用。
- 实验设计中避免使用放射性标记。
主要结果
- 该检测方法可成功鉴定抑制 CXCL12 结合的化合物。
- 与传统方法相比，活细胞分析可提供更具相关性的数据。
- 该方法适用于潜在药物候选物的筛选。
- 实验结果支持将该检测方法应用于药物发现的可行性。
结论
- 基于流式细胞术的检测方法是鉴定CXCR4抑制剂的有效工具。
- 使用活细胞可提高结合研究的准确性。
- 避免使用放射性物质可简化实验流程。
常见问题
行业重要性概述
这种基于流式细胞术的竞争性结合实验可帮助生物制药团队鉴定能够阻断CXCL12-CXCR4相互作用的小分子，该靶点在肿瘤学和炎症性疾病研发管线中具有重要意义。该方法采用活细胞和荧光标记配体，避免了放射性物质的使用，同时提供符合生理条件的结合数据。通过提供定量且可重复的检测结果，该技术可支持早期靶点验证和先导化合物的筛选与优先排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在天然细胞环境中测量化合物对受体-配体结合的直接作用，能够验证治疗假设。
- 操作价值：通过机制性确认化合物活性，提供功能性读数，降低以CXCR4为靶点的研发风险。
- 预测价值：通过识别具有剂量依赖性抑制特征的化合物，指示靶点参与情况，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过平均荧光强度生成定量的结合抑制数据，从而支持构效关系分析。
- 操作价值：可适配于96孔板格式，在保持检测一致性的前提下提高筛选实验的通量。
- 可重复使用性：在荧光配体可用的情况下，该方法可作为适用于其他G蛋白偶联受体（GPCR）的标准化平台，减少重新开发的工作量。
转化与临床前研究
- 科学价值：采用活体Jurkat细胞反映生理条件下的受体表达与结合动力学，提高转化相关性。
- 操作价值：通过确认靶点特异性化合物效应，生成可与下游临床前评估兼容的数据。
- 风险控制：通过区分特异性CXCR4抑制剂与非特异性化合物（例如，Maraviroc无效应），减少假阳性结果。
流程与工作流整合
该检测方法适用于从靶点验证到先导化合物发现的整个研究流程，可提供结合数据，为苗头化合物向先导化合物的推进提供依据。它通过为化合物表征增加作用机制层面的深度，从而补充了表型筛选。
- 发现生物学：通过定量检测化合物对活细胞中CXCL12与CXCR4结合的干扰作用，支持假设验证。
- 筛选：采用标准化的孵育、洗涤和固定步骤，适用于流式细胞术检测，确保检测的可重复性和就绪性。
- 分析：以平均荧光强度作为定量输出指标，用于比较不同剂量下化合物的效价和功效。
- 转化研究：使用表达CXCR4的疾病相关细胞系（Jurkat），将结合数据与癌症和炎症中的潜在治疗效应相关联。
- 企业级复用：作为一个模块化的结合检测平台，可转移应用于其他GPCR靶点，最大化检测开发投入的回报。
运营与企业影响
- 科学价值：通过证明CXCL12与CXCR4之间具有特异性且可被置换的结合，提高对靶点结合的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的细胞处理、孵育时间以及流式细胞术设门流程，确保实验的可重复性。
- 战略价值：在药物发现早期筛选掉缺乏靶点特异性活性的化合物，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：通过识别具有明确剂量依赖性抑制特征的化合物，实现基于风险评估的项目推进。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术操作、补偿调节以及活细胞群体设门策略的专业知识。
- 依赖于可检测相应通道（例如 FITC 或等效通道）荧光信号的流式细胞仪设备。
- 需要在不同筛选批次间对细胞制备、化合物稀释及孵育条件进行标准化。
- 若拓展至其他 GPCR 靶点，需开发或获取针对目标受体的荧光标记配体。
- 实际限制因素包括实验耗时（约 90 分钟，另加数据分析时间）以及需优化配体浓度以确保足够的信噪比。
