胆盐诱导的肠道病原体生物膜形成：鉴定与定量技术

本生物膜形成与评估方案的总体目标是确定肠道细菌病原体形成生物膜的能力，尤其是在模拟胃肠道转运及胆盐暴露的条件下。该方法有助于解答细菌致病性研究领域中的关键问题，例如肠道病原体在胃肠道严苛胆盐环境中存活的能力。该技术的主要优势在于，三项检测的联合结果可为每种病原体在胆盐暴露条件下生物膜形成的响应提供深入的表征。

我们最初提出这一联合方法的想法，是鉴于需要对福氏志贺菌中胆盐诱导的生物膜形成进行完全定量。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为该检测方法的某些环节可能会影响可重复性。因此，请务必关注关键步骤，以确保实验结果的可重复性。

演示实验操作的是我实验室的成员，博士后研究员 Kourtney Nicherson 和临床研究研究员 Alejandro Llanos。首先，将两支 1.5 毫升离心管分别标记为 TSB 和 TSB 加 BS。然后，向对应的离心管中分别加入 1 毫升 TSB 或 TSB 加 BS。接下来，以 1 比 50 的稀释比例，向离心管中接种 20 微升过夜培养物。

然后向无菌、透明、平底、经组织培养处理的96孔板中的三个孔各加入130微升未接种的对照培养基。此为空白对照。向另外三个孔中各加入130微升已接种的培养物。

将对照和接种培养物分别加入相应孔中后，将96孔板在37摄氏度下静置培养4至24小时。培养结束后，在酶标仪上以对照孔作为空白对照。随后，吸去每个孔中的培养基。

然后用 200 微升无菌 PBS 轻柔地洗涤各孔一次。洗涤后，吸去 PBS，将培养板倒置于吸水纸上，静置约 20 分钟使其干燥。必须确保轻柔地移除培养基并进行轻柔洗涤，以避免干扰 EPS 基质。

随后，向每个实验孔和对照孔中加入 150 µL 的 0.5% 结晶紫溶液。然后在室温下孵育 5 分钟。5 分钟后，用 400 µL 蒸馏水洗涤各孔一次。

加入 200 微升蒸馏水，洗涤各孔五次。完成全部五次洗涤后，将板倒置并完全干燥，避免光照。为了获得一致的结果，样品在继续下一步操作前必须彻底干燥。

待酶标板完全干燥后，使用 200 µL 95% 乙醇对孔进行脱色。随后将酶标板置于 4 °C 摇床中孵育 30 分钟，以避免蒸发。30 分钟后，在酶标仪上测定 540 nm 处的吸光度（OD 540）。

为了对 EPS 进行半定量检测，使用多通道移液器将培养基转移至透明的 96 孔板中。然后加入 200 µL 固定剂，在室温下固定黑色孔板 15 分钟。接着将对照孔设为空白对照，记录 OD 600 的读数以进行标准化。

在贴壁细胞固定的同时，记录培养基的读数。固定完成后，移除试剂并将其弃置于有害废物容器中。随后用 200 µL 无菌 PBS 轻柔地洗涤孔板两次。

洗涤后，吸去 PBS。随后加入 150 微升浓度为 25 微克/毫升的 ConA-FITC。将培养板在室温下孵育 15 分钟。

孵育结束后，用 200 微升 PBS 轻轻洗涤各孔。然后向每孔加入 150 微升 PBS，并在 488 纳米波长下记录荧光信号。在配制新鲜试剂后，将 PBS、含葡萄糖的 PBS、含胆盐的 PBS 以及含葡萄糖和胆盐的 PBS 均预热至 27 摄氏度。

然后，将过夜培养的生物膜板放入酶标仪中，以对照孔作为空白，记录OD 600值。接着，使用真空泵抽吸去除培养基，注意不要扰动塑料表面贴壁的菌群。用200微升无菌PBS轻轻洗涤各孔两次。

用 PBS 洗涤后，向每个三个孔中分别加入 130 微升预热的 PBS、含葡萄糖的 PBS、含胆盐的 PBS 以及含胆盐和葡萄糖的 PBS，然后将板在 37 摄氏度孵育 30 分钟。30 分钟后，从孵育箱中取出板。用移液器将上清液转移至新的无菌 96 孔板中。

最后，用 PBS 在 96 孔板或稀释板中对上清液进行 1 到 10 倍的系列稀释。然后使用多通道移液器将每种稀释液各 5 µL 转移至 LB 琼脂平板上。将平板在 37 °C 下过夜培养。

第二天，计数菌落数量。通过绘制各菌株在培养基中添加与不添加胆盐条件下的OD 540值柱状图，以定量分析肠道病原菌的胆盐依赖性生物膜形成能力。

该图显示，除肠集聚性大肠杆菌（Enteroaggrative E.Coli）外，大多数病原菌株的生物膜形成均显著增加。接下来，通过测定EPS对ConA-FITC的滞留量来检测生物膜形成过程中产生的胞外多糖（EPS）。柱状图显示，在胆盐存在条件下，荧光信号显著增强。

这证实了病原体志贺氏菌（Shigella flexneri）产生胞外多糖（EPS）。在此，当暴露于胆盐时，依赖ConA-FITC的EPS基质染色显著增强。这表明形成了以富含多糖的EPS基质为特征的细菌生物膜。

使用一倍浓度的PBS和DAPI分别显示FITC依赖性的特异性以及细菌DNA的存在。最后，通过计数菌落形成单位的数量，分析胆盐依赖性的细菌从生物膜中的分散情况。图中显示，细菌在PBS以及含葡萄糖的PBS中能够迅速从生物膜中分散出来。

然而，细菌暴露于胆盐会显著抑制其从生物膜中的扩散。这些检测方法旨在捕获并量化肠道病原体（特别是福氏志贺菌）在进入结肠感染前，因小肠中胆盐暴露而形成的短暂致病性生物膜。根据病原体的不同以及其在胃肠道内的感染部位，可能需要对检测方法进行若干修改，例如基础培养基类型、所用胆盐的成分以及细菌的培养条件等。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何完成各项实验，以全面评估目标细菌或突变菌株的生物膜形成能力。请务必注意，操作病原体及某些溶液时可能存在极高风险。在进行这些实验时，应始终采取适当的预防措施，包括规范的操作和废弃物处理方法。

此外，新鲜胆盐培养基的配制、适当的对照设置以及确保实验的可重复性，对于数据分析和确认胆盐诱导的生物膜表型至关重要。这些技术是对传统方法进行的独特且富有创意的高通量应用，将有助于对肠道病原体中胆盐诱导生物膜形成的复杂而动态的过程进行准确量化。