Name: 稳定蝇及其他 Muscoid 双翅目的实验室饲养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解稳定蝇（Stomoxys calcitrans）的实验室饲养方法，使用本地材料配制四种成分的培养基。该技术简便经济，适用于畜牧业害虫管理与昆虫发育研究。

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我们感谢Anthony Weinhold以及多年来与我们合作的众多学生在技术支持方面所做的贡献，以及在改进昆虫饲养流程方面提出的建议。

1. 卵的收集（图1）
<ol>
	<li>准备产卵杯，将一块布的一端放入盛有约500 mL温水（约40 °C）的烧杯中。将布的边缘重叠覆盖在杯口，并用橡皮筋固定。将布的松散端折回并覆盖在杯口上方。</li>
	<li>将产卵杯放入装有8–10日龄成虫的笼中约2小时。饱卵的雌性厩蝇会在布上产卵。</li>
	<li>从笼中取出产卵杯，用挤压洗瓶将卵从产卵布上冲洗至小盘中。</li>
</ol>
2. 准备幼虫饲养盘
<ol>
	<li>准备培养基（每培养皿用量）
	<ol>
		<li>将麦麸（500 g）、木屑（200 g）和鱼粉（115 g）加入10 L塑料培养皿中，充分混合。</li>
		<li>将碳酸氢铵（50 g）加入水（约25 °C，1600 mL）中，搅拌至完全溶解。</li>
		<li>将水溶液倒入干性成分中，充分混合以确保无干结颗粒。将培养基在培养皿中铺平，但不要压实。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种厩螫蝇卵
	<ol>
		<li>在培养基表面沿培养皿长度方向挖一条浅沟。</li>
		<li>用卵转移移液管将1 mL厩螫蝇卵（约8,000枚卵）接种至沟中（图2）。 
		注：卵转移移液管由塑料刻度移液管在所需位置截断后，插入100目筛网并用胶水重新粘合而成。</li>
		<li>用一层薄薄的培养基覆盖虫卵，以防干燥。</li>
		<li>用枕套覆盖培养皿，橡皮筋扎紧并贴上标签。将培养皿置于幼虫培养室（23 ± 2 °C，30–50% 相对湿度，12:12 [光:暗] h 光照周期）。 
		注：从产卵开始，幼虫发育需10–14天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 蛹的处理：产卵后7–9天，幼虫移至培养基边缘，并在第13或14天化蛹
<ol>
	<li>将主要位于培养皿边缘、培养基表面形成的结皮下方的蛹壳舀出，并置于干净的培养皿中。</li>
	<li>用蛹体填满托盘 &#189; 至 &#190; 充满水。打散蛹壳和培养基的结块。培养基中的小麦麸皮和蛋白质组分下沉，而蛹壳 &#62;1日龄浮游幼虫19.</li>
	<li>用漏勺去除漂浮物、蛹壳及部分培养基成分，再通过一系列筛子（#5、#7、#12、#20）冲洗，以清除残留的培养基。其中，#12 筛子用于收集蛹壳，#20 筛子可防止固体废物进入下水道。使用水槽喷头在筛子之间冲洗蛹壳。</li>
	<li>将蛹壳用12号筛子冲洗至干净的托盘中。向托盘中加水至充满 &#189; 充满水。将漂浮的蛹壳倒入滤网中，沥去多余的水分。</li>
	<li>将滤干的蛹壳转移至带风扇的干燥筛上，直至干燥（图3).</li>
</ol>
4. 蛹架法，一种使用蛹架收集蛹壳的替代方法18
注意：支架由一个10升洗盘末端切下的塑料片制成（高10.2厘米 × 宽10.2厘米 × 长31.9厘米）。
<ol>
	<li>按 2.1 中所述制备培养基。将培养皿中的培养基一端由约 2.5 cm 深度逐渐倾斜至另一端约 7.5 cm 深度。</li>
	<li>在饲养盘的浅端将架子放置于培养基上，并用胶带固定，以防止幼虫沿架子边缘爬行（图 4）。
	<ol>
		<li>将海绵（约 14.5 × 9.0 × 4.5 cm3，再生纤维素）浸透水，用湿润的棉布（30.5 × 42 cm2）包裹，并置于架子上，距培养基约半英寸处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按 2.2 中所述加入卵，并按前述步骤继续操作。
	<ol>
		<li>每天检查饲养盘，确保海绵保持湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在产卵后第 14 天，将架子、海绵和棉布上的蛹壳冲洗至干净的盆中，然后倒入滤筛内。</li>
</ol>
5. 质量控制
<ol>
	<li>称量每个培养皿中产生的所有蛹壳（总重量）。</li>
	<li>随机选取100个蛹壳，称重后放入一个9 cm的培养皿中。</li>
	<li>约5–8天后统计成虫数量并鉴定性别，以确定羽化率和性别比例。如需延迟计数，可将已羽化成虫的培养皿存于冰箱中。通过复眼形状、额眶板宽度20，或在低倍镜下观察外生殖器来鉴定蝇类性别。</li>
	<li>记录蛹壳总重量、100个蛹壳的重量，以及羽化出的雄性和雌性成虫数量。</li>
</ol>
6. 血液的制备
<ol>
	<li>从当地屠宰场采集新鲜牛血，放入盛有 500 mL 水和 70 g 柠檬酸钠三水合物的 19 L 塑料桶中。剧烈搅拌血液 5–10 分钟，然后运回实验室。</li>
	<li>将血液通过滤网过滤以去除凝块，并分装至 2 L 容器中，标注采集日期后置于 -20 °C 冰箱中冷冻保存。</li>
	<li>使用前 2 天，将容器从冷冻室取出并放入冷藏室解冻。解冻后的血液可在冷藏条件下使用约 2 周；冷冻保存可维持长达 1 年。</li>
</ol>
7. 成虫维持
<ol>
	<li>准备笼子，并用牛皮纸铺垫笼底，以便清洁。</li>
	<li>每个笼子中放入 50 g 干燥的厩蝇蛹（约 3,500 头）。成虫在蛹处理后数小时至数天内羽化。</li>
	<li>在每个笼子顶部放置一片浸有新鲜血液的卫生巾用于喂饲。在成虫羽化后 24 小时内开始喂饲，并每日更换，直至产卵前一日（羽化后 9–10 天）。</li>
	<li>产卵后（第 1 节），将笼子放入冰箱冷冻 4–8 小时，然后移除垫纸，用热水冲洗笼壁和底部的虫粪，再用洗衣粉和含氯漂白剂刷洗所有表面，最后用热水冲洗干净并晾干。</li>
</ol>

<ol><li>Cook, D. F., Dadour, I. R., Keals, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+fly%2C+house+fly+%28Diptera%3A+Muscidae%29%2C+and+other+nuisance+fly+development+in+poultry+litter+associated+with+horticultural+crop+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable fly, house fly (Diptera: Muscidae), and other nuisance fly development in poultry litter associated with horticultural crop production.</a> J. Econ. Entomol. 92 (6), 1352-1357 (1999).</li>
<li>Dominghetti, T. F., de Barros, A. T., Soares, C. O., Cançado, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomoxys+calcitrans+%28Diptera%3A+Muscidae%29+outbreaks%3A+current+situation+and+future+outlook+with+emphasis+on+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Bras.+Parasitol.+Vet%22%5BJournal%5D)">Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae) outbreaks: current situation and future outlook with emphasis on Brazil.</a> Rev. Bras. Parasitol. Vet. 24 (4), 387-395 (2015).</li>
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<li>Berkebile, D. R., Weinhold, A. P., Taylor, D. B. <a target="_blank" href="http://www.bioone.org/doi/abs/10.3958/059.034.0410">A new method for collecting clean stable fly (Diptera:Muscidae) pupae of known age.</a> Southwest. Entomol. 34 (4), 469-476 (2009).</li>
<li>Champlain, R. A., Fisk, F. W., Dowdy, A. C. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/47/5/940/2205735">Some improvements in rearing stable flies.</a> J. Econ. Entomol. 47 (5), 940-941 (1954).</li>
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<li>Friesen, K., Berkebile, D. R., Wienhold, B. J., Durso, L., Zhu, J., Taylor, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+parameters+associated+with+stable+fly+%28Diptera%3A+Muscidae%29+development+at+hay+feeding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Environmental parameters associated with stable fly (Diptera: Muscidae) development at hay feeding sites.</a> Environ. Entomol. 45 (3), 570-576 (2016).</li>
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<li>Bailey, D. L., Whitfield, T. L., LaBrecque, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+biology+and+techniques+for+mass+producing+the+stable+fly%2C+Stomoxys+calcitrans+%28L.%29+%28Diptera%3A+Muscidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Laboratory biology and techniques for mass producing the stable fly, Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae).</a> J. Med. Entomol. 12 (2), 189-193 (1975).</li>
<li>Smith, J. P., Hall, R. D., Thomas, G. D. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ee/article-abstract/14/6/881/336737">Field studies on mortality of the immature stages of the stable fly (Diptera: Muscidae).</a> Environ. Entomol. 14 (6), 881-890 (1985).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

稳定蝇在自然界中可在多种基质中发育，并可在实验室中用多种培养基进行饲养。我们曾使用木屑和蛭石作为填充剂。蛭石效果良好，但使蛹壳与培养基的分离变得困难，且成本较高（约0.60美元/盘）。可能由于从培养基中分离蛹壳的操作更为繁琐，使用蛭石时的羽化率也较低，为57%，而木屑为75%。棉白杨木屑的效果与蛭石相近，但有时难以获取。最重要的组分似乎是可发酵并维持环境的植物性或纤维素类物质 &#34;开放&#34; 或通气良好的培养基和氨态氮21,22厩蝇幼虫不会在纯粪便中被发现，而是偏好与植物残渣混合的老化粪便。考虑到这一点，此处所述的饲养方法可根据当地可获取的材料进行调整，以建立经济有效的厩蝇饲养流程。
采用这些方法饲养的家蝇在体型上与野外采集的家蝇相当。翅长与家蝇体重具有相关性23。由于野生家蝇的翅缘常有磨损，我们采用中室（discal-medial cell）的长度作为翅长的指标。采用本方法饲养的249只家蝇中，中室平均长度...

厩蝇（Stomoxys calcitrans (L.)）是一类吸血性蝇类，其叮咬具有疼痛感，会干扰家畜的放牧行为，导致伴侣动物疼痛与痛苦，并在全球范围内影响人类的户外休闲活动。厩蝇幼虫在发酵的植物性物质中发育，这些基质常被动物排泄物污染。农业耕作方式和作物种类的变化，已导致在澳大利亚的农作物残余物和蔬菜1、巴西的甘蔗2以及哥斯达黎加的菠萝种植区3中暴发严重的厩蝇疫情。尽管每只动物身上仅14只厩蝇即被视为造成经济损失的阈值4，但在近期暴发中，已观测到每只动物身上超过2000只蝇类的极端情况5。如此高水平的侵染可使宿主生产力降至接近零，并可能导致死亡6。由于与农业活动相关的暴发日益频繁，厩蝇正重新受到关注，对实验室种群的需求也急剧增加。
与其他完全变态昆虫一样，厩蝇在幼体或幼虫阶段获取生长所需的全部营养。因此，饲养系统的一个重要组成部分是幼虫的食物或基质。在野外已观察到厩蝇幼虫可在多种基质中发育7，且其发育依赖于基质中的微生物群落8,9。天然幼虫基质主要由正在分解或发酵的植物性材料组成，通常还含有氮素废物污染物。
在实验室饲养条件下，厩蝇幼虫的培养基通常由植物性材料和添加的氮源组成。已有多种材料被用于配制厩蝇幼虫饲料。早期的幼虫饲料模拟自然基质，包括发酵的燕麦秸秆以及马粪或牛粪10,11。碳水化合物来源包括麦麸12,13,14、苜蓿粉12,13,14，以及由化学品专业制造商协会（CSMA）开发的一种商业配方（33%麦麸、27%苜蓿粉、40%啤酒酵母颗粒）13,14,15,16。氮源包括酵母悬液12、鱼粉和碳酸氢铵17。饲料中常加入惰性填充材料，如燕麦壳12、甘蔗渣13、蛭石16、木屑13,18和颗粒化花生壳14。
实验室饲养的一个主要目标是尽可能生产出生理特征与&#34;野生型&#34;相似的个体，以便实验室实验的结果能够反映野外种群的真实情况。为此，必须尽量减少近亲繁殖和人工选择，以维持遗传多样性，并确保营养资源与野外条件相近。次要目标是尽量减少人力和成本支出。降低开支的一个重要方面是利用本地可获取的饲料成分。本文介绍的厩蝇饲养系统即为实现上述目标而设计。

<table><tbody><tr><td>Diamalt</td><td>Premier Malt Products, Inc.，新泽西州萨德尔布鲁克</td><td>2540</td><td></td></tr><tr><td>CSMA 果蝇培养基</td><td>普瑞纳动物营养，明尼苏达州阿登山</td><td>5S6Z</td><td></td></tr><tr><td>薄型超长卫生巾</td><td>美国俄亥俄州克利夫兰市，Tranzonic 公司</td><td>5001M</td><td></td></tr><tr><td>Calf Manna</td><td>MannaPro，美国密苏里州切斯特菲尔德</td><td>Manna Pro</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Spectrum Chemical Manufacturing Corp，加利福尼亚州加登纳</td><td>A1125</td><td></td></tr><tr><td>小麦麸，粗粒</td><td>Siemer Milling Company，伊利诺伊州特乌托波利斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>木屑</td><td>Tractor Supply Company，布伦特伍德，田纳西州</td><td>502770699</td><td></td></tr><tr><td>鱼粉</td><td>Consumer Supply Distributing，南达科他州北苏城</td><td>F1550</td><td></td></tr><tr><td>成虫饲养笼</td><td>林肯铝窗公司，内布拉斯加州</td><td>自定义</td><td>45 &amp;times; 45 &amp;times; 45 厘米，18 &amp;times; 16 目铝筛，针织套管开口</td></tr><tr><td>9 &amp;times; 28 cm 黑色棉布</td><td>Robert Kaufman Fabrics，洛杉矶，加利福尼亚州</td><td>K040-114</td><td>蛋布</td></tr><tr><td>10 L 塑料托盘</td><td>Rubbermaid，纽约州萨拉托加斯普林斯</td><td>FG2951ARWHT</td><td>幼虫培养皿</td></tr><tr><td>棉质纱布，12 英寸 × 25 码卷装</td><td>Tex-Care 医疗公司，北卡罗来纳州伯灵顿</td><td>91311-225</td><td></td></tr></tbody></table>

稳定蝇及其他蝇样双翅目的实验室饲养

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

厩蝇（Stomoxys calcitrans）是全球范围内对家畜、人类、伴侣动物和野生动物造成严重危害的害虫。在过去20多年中，由于农艺实践的改变，多个国家出现了厩蝇的大规模暴发。这些暴发事件严重影响了畜牧业生产和人类户外活动，导致公众要求加强对该害虫的研究和防控力度。本文介绍了一种简单且低成本的厩蝇实验室饲养方法。该方法使用本地易得的饲料成分、设备和耗材，也可根据需要调整用于饲养其他蝇科昆虫，包括眼蝇（Musca autumnalis）、角蝇（Haematobia irritans）和家蝇（Musca domestica）。采用该方法饲养的厩蝇蛹平均重量为12.5 mg，卵至成虫的存活率约为35%。每个饲养盘可获得约3000只成虫。

幼虫在产卵后10–14天化蛹，成虫在产卵后14–16天羽化。世代周期（卵至卵）约为24天。2013年5月至2017年1月期间，使用三种不同填充材料及两个果蝇群体的饲养数据见图5。以杨木屑作为填充材料时产量最高，获得蛹的数量为3867 ±1442（<img alt="平均值计算公式，x̄ = Σx/n，统计学数据分析，示意图。" src="/files/ftp_upload/57341/57341eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation"> ± 标准差），蛹重12.5 ±1.6 mg，羽化率为74 ±19%，每个培养皿可获得2872 ±1294只成虫（来自已建立的实验室群体）。性别比例略偏向雌性，为0.97:1（雄:雌，共记录1,184个培养皿中的77,141只果蝇性别）。卵至成虫的存活率约为36%。遗憾的是，杨木屑近年来越来越难以获取，迫使我们频繁使用松木屑。尽管使用松木屑时产量较低，每皿约1,700只成虫，但个体体型略大，达13 ...

本文介绍了一种饲养厩蝇（Stomoxys calcitrans）的稳定方法。该方法采用当地易得的材料作为饲料成分、设备和耗材。

厩蝇（Stomoxys calcitrans）是全球范围内对家畜、人类、伴侣动物及野生动物造成严重危害的害虫。在过去20多年中，随着……

该方法有助于解答畜牧昆虫学中的关键问题，例如厩蝇发育所需的条件。此技术的主要优势在于其简便性，培养基仅由四种成分组成。繁殖家蝇（Stomoxys calcitrans）首先需要从种群中收集卵。这一步骤包括准备一个产卵杯。将一块布的末端浸入装有40°C水的250毫升广口瓶中。然后用布包裹在罐子外侧，并用橡皮筋固定布片。将布的松散端折叠覆盖在罐口上方，以限制接触水源。现在将此杯子放入装有8至10日龄果蝇的笼子中。两小时后，怀卵雌蝇将产下足够用于下一代的卵。通常情况下，2,500只果蝇在两小时内可产下8,000至40,000枚卵。接下来，用水将卵从产卵布上冲洗至一个小型的空盘中。理论上，卵在水中可存活 8 到 12 小时。然而，最好将时间控制在 5 小时或更短。为了从卵中培育幼虫，需在 10 升的塑料培养皿中配制新鲜的果蝇培养基。然后沿培养皿的长度方向在培养基中开一条浅沟，用于放置卵。转移卵时，需制作专用的卵移液管，方法是将网筛插入移液管中。只需在所需位置剪断移液管，并将一个100目筛网粘接到移液管的该位置。然后，使用该卵移液管收集约一毫升卵，并将其注入到沟槽中。这相当于约 8,000 个卵。然后用一层薄薄的培养基覆盖卵，以防止其干燥。接下来，用一个标准的棉质枕套盖住培养皿，并用橡皮筋固定。在标准培养条件下，培养皿中的幼虫约两周内发育。九天内，幼虫将移动至培养基边缘；到第14天，幼虫将化蛹。许多蛹可在培养皿边缘的食物结痂下找到。定期将蛹从培养皿中捞出，并转移至一个干净的10升培养皿中。加入水以打散成团的蛹和培养基。大部分食物会下沉，而蛹则会浮起。将所有漂浮物转移至一组筛子上，并冲洗掉残留的培养基。蛹将收集在12号筛中。冲洗蛹直至其看起来干净，然后将其置于清水中漂浮。现在用滤网收集清理干净的漂浮蛹。然后将蛹转移到干燥筛网上，置于风扇产生的稳定气流下使其干燥。部分成虫将在几小时内开始羽化，而另一些则需要数天时间。收集蛹的另一种方法是使用蛹架，该蛹架由一个10升洗涤盘末端截取的塑料片制成。使用时，将10升洗涤盘中装入培养基，使其一端深度约为2.5厘米，另一端深度约为7.5厘米，形成逐渐倾斜的结构。然后将蛹架放置在较浅的一端，并用胶带封住边缘，以防止幼虫沿蛹架边缘爬行。接下来，将一块海绵用水浸透，并用湿布包裹。将其放置在距离培养基约1/2英寸的架子上。重要的是，需每天检查海绵，确保其保持湿润。将幼虫放置在架子上化蛹，使海绵和布料远离食物，以尽量减少清理工作。作为种群健康状况的评估指标，从每代中收集100个蛹，称量蛹的重量，并记录其羽化情况和性别比例。在将蛹装入空的成虫饲养笼之前，先用牛皮纸衬垫笼子。然后将50克干燥的稳定蛹装入笼中。在首批蝇类羽化后24小时内，开始喂食血液。将 20 至 25 毫升牛血浸透女性卫生巾，置于笼子顶部。从产卵前一日开始每日更换，直至产卵前一天为

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