土壤样品多涨价可能分析的 MPLEx 协议

该方法用于蛋白质组学、代谢组学和脂质组学领域，有助于获得有关由于环境扰动而导致土壤相关微生物群落发生的分子变化的全面信息。该技术的主要优点是，从单个土壤样品中获得多种分析物可以提高精密度和准确度，同时减少样品制备时间和工作量。首先，对于每个 20 克土壤样品，称取 10 克重量放入两个单独的 50 毫升甲醇/氯仿兼容管中。

使用由 PTFE 制成的塑料管，因为氯仿会浸出大多数塑料，从而污染样品。向每个试管中加入大约 10 毫升氯仿洗涤的不锈钢和石榴石珠。然后，在冰上，向每根试管中加入 4 毫升冷超纯水，并将冰桶中的样品转移到通风橱中。

使用 25 毫升玻璃血清移液管，将 20 毫升冰冷的二比一氯仿快速加入甲醇体积/体积中。拧紧盖子，将土壤混合物涡旋成溶液。氯仿-甲醇有助于分解原核生物的细胞壁，还可以灭活酶活性。

接下来，将试管连接到 50 毫升试管涡旋附件上，如果可能，请在冰箱内以 4 摄氏度水平涡旋 10 分钟。然后，将样品放入零下 80 摄氏度的冰箱中约 15 分钟，以使其完全冷却。然后，使用通风橱内的探针超声仪，用 6 毫米、1/4 英寸的探针以 60% 的振幅在冰上对每个样品进行 30 秒的超声处理。

超声处理后，将样品置于 80 摄氏度的负低温冰箱中，因为超声处理会产生大量热量。重复水平涡旋、超声处理和冷冻步骤后，将样品以 4， 000 倍重力和 4 摄氏度离心 5 分钟。此时，样品将被分离为上代谢物层、蛋白质中间层和下层脂质层。

将样品放在冰上。然后，在通风橱内，使用 10 毫升玻璃血清移液管将上层代谢物从两个 50 毫升试管转移到一个大玻璃小瓶中。现在，稍微倾斜 50 毫升试管以释放蛋白质夹层，使其自由漂浮在下层脂质层上。

然后，使用干净的不锈钢平头实验室刮刀，小心地舀取两个蛋白质夹层，并将它们一起放入一个新的 50 毫升试管中。使用 25 毫升玻璃血清移液管，将下层脂质转移到一个大玻璃瓶中。将 20 毫升冰冷的甲醇添加到两个带有碎片的试管中，以及一个带有蛋白质夹层的试管中。

短暂涡旋试管，并在 4， 000 倍重力和 4 摄氏度下离心碎片沉淀和蛋白质夹层 5 分钟。然后，将甲醇倒入通风橱内的危险废物容器中。将蛋白质和碎片沉淀物在液氮中冷冻，然后在冻干机中干燥约两小时。

每个碎片沉淀中加入 20 毫升蛋白质增溶缓冲液，溶于 50 毫摩尔 tris 缓冲液（pH 值为 8.0）中，向蛋白质夹层管中加入 10 毫升。在通风橱中，探针以 20% 振幅对样品进行超声处理 30 秒，使其溶解。涡旋样品 2 分钟。

然后，将蛋白质夹层样品放入 50 摄氏度的实验室试管旋转器中 30 分钟以溶解蛋白质。将碎片样品水平涡旋 10 分钟，以裂解任何剩余的完整细胞。然后，与蛋白质夹层样品一起旋转剩余的 20 分钟。

室温下以 4， 500 倍重力离心所有样品 10 分钟，然后将每个样品中每个样品管中的上清液收集到两个 50 mL 试管中。向蛋白质层间沉淀中加入 10 毫升增溶缓冲液。然后，对沉淀物进行超声处理并涡旋回溶液中。

离心后，将上清液与碎片沉淀上清液均匀混合到两个 50 mL 试管中，并在固定角桶式转子中以 8， 000 倍重力和 4 摄氏度离心 10 分钟，以沉淀任何残留的碎片。将上清液分成两个 50 毫升的试管。然后，使用 10 毫升玻璃血清移液管，向每个试管中加入 7.5 毫升 TCA。

将样品涡旋到溶液中。然后，将样品放入负 20 摄氏度的冰箱中 2 小时至过夜。要沉淀的蛋白质沉淀，请将样品在 4， 500 倍重力和 4 摄氏度下离心 10 分钟，然后将上清液倒入废液中。

向每个蛋白质沉淀中加入 10 毫升 100% 冰冷的丙酮。涡旋试管，并将颗粒状混合成一个试管。离心，然后倒出丙酮。

使用较小体积的丙酮，洗涤沉淀两次，然后将悬浮液转移到 1.5 或 2 mL 的试管中进行最后旋转。将上清液倒入废液中，让沉淀在通风橱中的纸巾上倒置干燥约 20 分钟。根据沉淀的大小，添加 100 至 200 μL 的蛋白质增溶缓冲液。

对沉淀物进行超声处理并涡旋成溶液。请注意，由于腐殖质物质与蛋白质一起沉淀，样品可能呈粘性，这些物质将在随后的离心中被去除。最后，在培养箱或摇床中以 300 rpm 和 40 摄氏度摇动样品 30 分钟，使蛋白质溶解成溶液，然后再进行蛋白质消化或快速冷冻以备将来处理。

使用本视频中演示的 MPLEx 方案，从堪萨斯州原生草原土壤中提取了 3， 376 种肽、105 种脂质和 102 种极性代谢物，并将该方案的蛋白质提取与蛋白质提取试剂盒和使用反相 LC-MS/MS 的 SDS 提取进行了比较。最初比较市售蛋白质提取试剂盒和 SDS 方法的三个重复样品时，两种技术之间只有 12% 的肽重叠，显示出微生物群落的复杂性和不同的提取效果。将 MPLEx 与市售蛋白提取试剂盒和 SDS 提取物进行比较后，使用 SDS 和/或市售试剂盒提取时，使用 MPLEx 方法观察到的约 38% 的肽也被检测到。

考虑到堪萨斯州土壤细菌群落的物种数量及其宏基因组，肽鉴定的重叠是合理的。如此处所示，MPLEx 方法的广泛适用性之前已经使用古细菌 S.acidocaldarius、单蓝细菌联盟、小鼠脑皮层组织、人类尿液和 A.thaliana 的叶子进行了评估。在所有情况下，从 MPLEx 方法观察到的蛋白质数量与对照相似，表明其适用于许多不同样品类型。

看完这个视频，您应该对如何从单个土壤样品中获得蛋白质、代谢物和脂质有很好的了解。在尝试此过程时，保持灵活性很重要，因为所有土壤类型都不同。例如，蛋白质夹层的大小会有所不同，具体取决于土壤生物量和土壤中存在的腐殖质物质。

不要忘记，使用氯仿可能非常危险，因此在尝试此过程时应始终采取预防措施，例如在通风橱中工作。