Name: 土壤样品多涨价可能分析的 MPLEx 协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习从单一土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质的MPLEx方法，用于多组学质谱分析。该技术可提高分析精度并减少样品制备时间，适用于土壤微生物群落研究。

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作者感谢 Nathan Johnson 在准备图表过程中提供的帮助。本研究由美国能源部生物与环境研究办公室（基因组科学计划）资助的泛组学计划（Pan-omics Program）、太平洋西北国家实验室（PNNL）的过渡期微生物组（Microbiomes in Transition, MinT）实验室自主研究开发计划，以及美国国立卫生研究院环境健康科学国家研究所（R01 ES022190）和美国国立卫生研究院（P42 ES027704）提供支持。KEBJ 感谢 R21 HD084788 提供的资金支持，用于开发和验证新型多组学提取技术。本工作在太平洋西北国家实验室（PNNL）的 W. R. Wiley 环境分子科学实验室（EMSL）完成，EMSL 是美国能源部下属的国家级科学用户设施。PNNL 是由 Battelle 公司根据合同 DE-AC06-76RL01830 为美国能源部运营的多项目国家实验室。

注意：非常潮湿的土壤可在提取前进行冻干处理，这不会影响提取效果。也可直接使用湿土，但在按特定比例添加试剂时应考虑其含水量。
注意：建议每次提取使用 20 g 干土重量，需将土壤分装至两个 50 mL 离心管中（每管最多加入 10 g 土壤）。可根据样品量的多少相应放大或缩小提取规模。
注意：干燥的土壤样品可通过3 mm筛网进行筛分，以实现均质化并去除细小的根系和石块。请勿筛分湿润的土壤样品，因为样品会堵塞筛网。
1. 土壤细胞裂解及代谢物、蛋白质和脂质的提取（耗时约1天）
<ol>
	<li>每20 g土壤样品，称取10 g分别加入两个可耐受甲醇/氯仿的50 mL离心管中。选择离心管时需格外谨慎，因为氯仿会溶出大多数塑料中的成分，导致样品污染。应尽可能使用玻璃管，或由聚丙烯（polypropylene）或聚四氟乙烯（PTFE）制成的塑料管。 
	注意：在初始称重和均质化步骤期间，应将土壤保持在冰上并尽可能低温。</li>
	<li>向每个管中加入10 mL经氯仿洗涤的不锈钢珠和石榴石珠。在冰上，加入4 mL预冷的超纯水（见 材料表 向每管（一个样品分装至两管）加入纯化系统所需试剂，并将样品置于冰桶中，转移至通风橱内。</li>
	<li>使用 25 mL 玻璃刻度吸管，迅速加入 20 mL 冰冷的 2:1 氯仿:甲醇（v/v）。 
	注意：氯仿:甲醇具有急性健康危害：可引起皮肤刺激、可能造成化学灼伤，并对呼吸系统产生刺激。可能影响肾脏、肝脏和心脏。操作时应佩戴适当的防护眼镜、防护服和手套，并始终在通风橱中进行。</li>
	<li>拧紧管盖并涡旋至溶液均匀。2:1 的氯仿:甲醇有助于破坏原核生物的细胞壁，同时使酶活性失活。</li>
	<li>将试管连接至50 mL试管涡旋振荡装置，尽可能在4 °C冰箱内水平涡旋振荡10分钟。随后，将样品置于-80 °C超低温冰箱中约15分钟，以确保其完全冷却。</li>
	<li>在通风橱内使用探头式超声仪，将每个样品置于冰上，用6 mm（1/4英寸）探头以60%的振幅超声处理30秒。 
	注意：超声处理时，建议使用隔音罩并佩戴听力保护装置。电源和高频电缆中含有高压电。避免将激活的探头接触样品容器的底部或侧壁，否则可能导致塑料容器开裂或熔化。</li>
	<li>将样品置于 -80 °C 冰箱中约 15 分钟，因为超声处理会产生大量热量。</li>
	<li>重复步骤 1.5 - 1.7。 
	注意：裂解过程中务必保持样品处于低温状态。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 4,000 x g 离心 5 分钟。此时，样品将分为上层代谢物层、中间蛋白质层、下层脂质层（以及底部残留的沉淀物）。参见 图1.</li>
	<li>将样品置于冰桶中的冰上，在通风橱内使用10 mL玻璃刻度移液管，从两个50 mL离心管中吸取上层代谢物层，合并至一个大玻璃瓶中。 
	注意：避免将蛋白质层吸入移液器中；必要时可保留少量代谢物层。</li>
	<li>将50 mL离心管略微倾斜，使蛋白中间层脱离，自由漂浮于下层脂质层之上。使用一支洁净的不锈钢平头实验刮刀，小心地将两层蛋白中间层一同刮出，并转移至同一个新的50 mL离心管中。</li>
	<li>使用25 mL玻璃刻度移液管，将下层脂质移至一个大玻璃瓶中。 
	注意：尽量避免吸入土壤颗粒；然而，随脂质一同吸入的一些土壤碎屑和颗粒将在后续步骤中被去除。</li>
	<li>将透气膜覆盖在代谢物和脂质玻璃小瓶的瓶口，置于真空浓缩仪中干燥至完全干燥（脂质约4-5小时，代谢物过夜）。</li>
	<li>向蛋白质样品管和剩余的碎片沉淀管中分别加入20 mL预冷的甲醇，并涡旋混匀。对碎片沉淀进行此操作的目的是在丢弃沉淀前，用甲醇冲洗掉其中的氯仿，以便尝试溶解可能残留在沉淀中的蛋白质。</li>
	<li>将碎片沉淀和蛋白质中间层在 4,000 x g、4 °C 条件下离心 5 分钟，然后在通风橱内将甲醇倾倒至危险废物容器中。</li>
	<li>将蛋白和碎片沉淀物在液氮中速冻，随后在冷冻干燥机中干燥（由于甲醇的冰点极低，为-98 °C，因此需使用冷凝器温度可达-105 °C的冻干机），干燥时间约为2小时。 
	注意：切勿将沉淀物过度干燥，否则将更难溶解。</li>
	<li>加入10 mL蛋白溶解缓冲液（4% SDS，100 mM DTT（DL-二硫苏糖醇）溶于50 mM Tris缓冲液，pH 8.0；参见 补充试剂准备将蛋白中间层管加入 )，并向每份残渣沉淀物中加入 20 mL。 
	注意：SDS 具有急性毒性且易燃，对皮肤、眼睛和呼吸道有刺激性。操作时需佩戴手套和护目镜。</li>
	<li>在通风橱中，将样品以20%的振幅进行探头超声处理30秒，使其充分溶解。随后涡旋振荡2分钟。</li>
	<li>将蛋白中间层样品放入实验室管式旋转仪中，在300 rpm、50 °C条件下旋转30分钟，以溶解蛋白。</li>
	<li>将碎片样品水平涡旋振荡额外10分钟，以裂解任何残留的完整细胞，然后与蛋白质中间层样品一起旋转剩余的20分钟。</li>
	<li>将所有样品在4,500 x g离心10分钟，室温（RT），按每份样品收集各管上清液至两个50 mL离心管中。</li>
	<li>向蛋白质中间层沉淀中加入10 mL溶解缓冲液，随后超声处理并涡旋振荡使其重新溶解，再按前述条件离心。</li>
	<li>将上清液均等地合并至两个50 mL离心管中，在4 °C条件下，使用固定角转子于8,000 x g离心10分钟。 
	注意：最终的离心步骤是必要的，以去除过量的腐殖质污染物。</li>
	<li>将上清液分别倒入两个50 mL离心管中，每管30 mL。然后使用10 mL玻璃刻度吸管，向每管中加入7.5 mL三氯乙酸（TCA）。涡旋混匀至溶液均匀。每管30 mL样品中TCA终浓度为20%（根据实际情况相应调整）。 
	注意：三氯乙酸（TCA）具有腐蚀性、毒性，可能引起皮肤灼伤。操作时应佩戴手套和护目镜。</li>
	<li>将样品置于 -20 °C 冰箱中冷冻 2 小时至过夜。 
	注意：蛋白质通常在1小时内沉淀，但也可放置过夜（最长18小时）。 
	注意：由于三氯乙酸可能引起蛋白质的酸水解，TCA提取时间不应超过18小时。若样品处于冷冻状态，需在冰上解冻；避免样品解冻后温度升高。</li>
	<li>为沉淀蛋白质，将样品在4 °C下以4,500 x g离心10分钟，然后将上清液倾倒至废液容器中。</li>
	<li>向每份蛋白质沉淀中加入10 mL预冷的100%丙酮，涡旋混匀，将相同类型的沉淀合并至同一离心管中。</li>
	<li>将含有合并沉淀的离心管配平后离心，然后将上清液倾倒至废液容器中。 
	注意：丙酮可能引起呼吸道、皮肤和眼睛刺激，且为易燃液体和蒸气。请佩戴安全眼镜、手套并穿上实验服，在通风橱中操作。</li>
	<li>将沉淀物洗涤两次&#160;使用1.5 mL丙酮&#160;最后转移至2 mL离心管中，在10,000 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>将上清液倒入废液容器中，将沉淀物倒置在通风橱内的纸巾上干燥约20分钟，或在氮气流下干燥，直至沉淀物表面开始出现轻微裂纹。</li>
	<li>根据沉淀物的大小，加入 100 - 200 µL 蛋白质溶解缓冲液。 
	注意：加入样品中的溶解缓冲液体积应尽可能小。后续的滤辅助样品制备（FASP）每根柱最多只能使用50 μL溶解后的样品；若超过此量，则必须分至多个FASP柱中进行处理。</li>
	<li>将沉淀物超声并涡旋至溶解。注意，由于腐殖物质随蛋白质一同析出，样品可能呈黏稠状，此黏稠物将在后续离心步骤中被去除。</li>
	<li>在300 rpm、40 °C条件下，将样品置于培养摇床中振荡30分钟，使蛋白质溶解于溶液中，随后进行蛋白质消化。</li>
	<li>将样品在液氮中速冻，随后于 -80 °C 冰箱中保存，直至进行蛋白质消化。</li>
</ol>
2. 脂质制备（耗时约20分钟）
<ol>
	<li>脂质样品干燥后，向小瓶中加入 200 μL 的 2:1 氯仿:甲醇溶液，涡旋混匀后转移至 1.5 mL 聚丙烯管中；再向玻璃小瓶中加入额外的 200 μL 溶液，涡旋混匀，用移液器将残留的脂质转移至同一管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 5 分钟，去除样品中的不溶物。</li>
	<li>将上清液转移至玻璃脂质小瓶中，并于 -20 °C 保存，直至进行 LC-MS/MS 分析（LC-MS/MS 的更多细节见补充方法）。</li>
	<li>若样品无法在制备后立即分析，需将脂质溶于溶剂中并于 -20 °C 保存，以防止氧化和降解。</li>
</ol>
3. 代谢物制备与衍生化（耗时约5小时）
<ol>
	<li>提取后的第二天，从真空离心浓缩仪中取出代谢物样品，并在 -20 °C 下干燥保存，直至准备进行气相色谱（GC）分析前的衍生化处理。若不使用气相色谱分析代谢物，则应根据所用仪器的相应方案进行样品制备。</li>
	<li>在对代谢物进行气相色谱分析前的衍生化处理之前，立即将样品从大玻璃瓶中转移：加入 200 μL 甲醇，涡旋混匀后转移至 1.5 mL 聚丙烯管中。重复一次。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至较小的玻璃小瓶中，在瓶口覆盖透气膜，然后在真空离心浓缩仪中完全干燥。</li>
	<li>向样品瓶中加入 20 µL 甲氧胺溶液，并在中等速度的涡旋振荡器上涡旋 30 秒，以对代谢物进行衍生化处理。 
	注意：甲氧胺盐酸盐可引起严重灼伤和眼睛严重损伤，可能通过皮肤接触导致致敏。操作时需佩戴护目镜、手套和实验服，并在通风橱中进行。</li>
	<li>使用水浴超声仪确保样品完全溶解。</li>
	<li>将样品置于带有防冷凝盖的培养箱中，在 37 °C 下孵育 1 小时 30 分钟，同时以 1,000 rpm 振荡。</li>
	<li>将小瓶倒置一次，使样品与瓶盖内表面的冷凝液滴混合。在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟，使样品沉降至管底。</li>
	<li>用注射器向样品中加入 80 µL 含 1% 三甲基氯硅烷的 N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺（MSTFA + 1% TMCS），进行硅烷化反应，涡旋 10 秒。 
	注意：MSTFA + 1% TMCS 可导致皮肤腐蚀、严重眼损伤和特定靶器官毒性，且为易燃液体和蒸气。操作时需佩戴护目镜、手套和实验服，并在通风橱中进行。</li>
	<li>将样品置于带有防冷凝盖的培养箱中，在 37 °C 下孵育 30 分钟，同时以 1,000 rpm 振荡。</li>
	<li>将小瓶倒置一次，使样品与瓶盖内表面的冷凝液滴混合。</li>
	<li>在室温下以 2,000 × g 离心 5 分钟，使样品沉降。</li>
	<li>将反应后的溶液转移至适用于气相色谱-质谱（GC-MS）分析的进样小瓶中。</li>
</ol>
4. 蛋白质消化（耗时约1天）
<ol>
	<li>在室温下以 15,000 × g 离心样品 5 分钟，使任何碎片沉淀。</li>
	<li>使用 FASP 试剂盒（见材料表）按照改良的制造商说明书进行滤辅助样品制备（FASP）以完成消化31,32：
	<ol>
		<li>向 FASP 柱（500 μL 30K MWCO 离心滤器）中加入 400 μL 8 M 尿素缓冲液。</li>
		<li>样品完成离心后，用移液器吸走上清液（弃去沉淀），并将最多 50 μL 样品加入柱中含 400 μL 8 M 尿素的溶液中。 
		注意：每根柱子最多只加 50 μL 样品。如果样品体积超过 50 μL，请使用多根柱子，并在消化后合并肽段。为确保 FASP 柱能完全去除可能严重干扰质谱分析的 SDS，应尽可能保持该体积较低（理想为 30 µL）。</li>
		<li>将柱子放入配套的 1.5 mL 离心管中，在室温下以 14,000 × g 离心 30 分钟。</li>
		<li>将穿流液弃入废液，向柱中加入 400 μL 8 M 尿素，再次离心。</li>
		<li>重复上一步一次，共进行 3 次尿素洗涤。 
		注意：确保样品在柱上接近干燥；若每次离心后滤膜上残留液体超过约 30 µL，需继续离心。</li>
		<li>向柱中加入 400 μL 50 mM NH4HCO3，在 14,000 × g 下离心 20 分钟，弃去废液，再重复一次。</li>
		<li>将柱子转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>向柱中加入 75 μL 胰蛋白酶消化缓冲液，在 37 °C 恒温振荡器中孵育 3 小时，转速为 750 rpm，并使用防冷凝盖。</li>
		<li>向柱中加入 40 µL 50 mM NH4HCO3。</li>
		<li>以 14,000 × g 离心 15 分钟，将肽段收集至管中，同时将高分子量污染物保留在柱上。</li>
		<li>向柱中加入 40 μL 50 mM NH4HCO3，再次离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弃去柱子，使用真空浓缩仪将管中的肽段浓缩至约 30 µL，然后使用 BCA 蛋白质定量法（Bicinchoninic acid protein assay kit；见材料表）测定肽段浓度。</li>
	<li>若怀疑存在 SDS 污染（可见气泡），可选择进行纯化步骤33。若选择此步骤，则后续必须进行固相萃取。有关该纯化方法的详细信息请参见补充方法。</li>
	<li>将样品稀释后用于质谱分析，或可选地进行高效液相色谱（HPLC）分级（接下来两个步骤）。</li>
	<li>如需分级，用 10 mM 甲酸铵缓冲液（pH 10.0）将样品稀释至 400 µL。</li>
	<li>使用 HPLC 系统在 C18 柱上进行分离（见材料表），流速为 0.5 mL/min，流动相分别为：(A) 10 mM 甲酸铵，pH 10.0；(B) 10 mM 甲酸铵，pH 10.0/乙腈（10:90）。
	<ol>
		<li>在前 10 分钟内将梯度从 100% A 调整至 95% A，10 至 70 分钟内从 95% A 降至 65% A，70 至 85 分钟内从 65% A 降至 30% A，85 至 95 分钟维持在 30% A。</li>
		<li>在 95 至 105 分钟内用 100% A 重新平衡，并在 100% A 下保持至 120 分钟。</li>
		<li>每 1.25 分钟收集一次组分（整个梯度共收集 96 个组分），最终可将每行合并得到共 12 个样品，或每隔一行合并得到 24 个样品（每个样品包含 n = 8 或 n = 4 个组分的混合物）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有组分在真空下干燥，每管加入 15 µL 超纯水，于 -20 °C 保存，直至进行 LC-MS/MS 分析。</li>
</ol>

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<li>Kim, S., Pevzner, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-GF%2B+makes+progress+towards+a+universal+database+search+tool+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics.</a> Nat Commun. 5, 5277(2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

需要注意，并非所有实验室都具备相同的设备，因此某些步骤（例如裂解步骤）可以进行适当调整。本文中我们采用涡旋振荡和超声处理，但使用大型50 mL珠磨机同样可行。如果无法获得冷凝器温度可达到-105 °C的冷冻干燥机，则可使用氮气流对样品进行干燥。此外，土壤类型差异很大，可能包括沙土、粉土、黏土、泥炭、壤土（etc.），并且在pH值、盐度和有机质含量方面也可能有所不同。这些差异中的每一种都可能对实验方案产生影响，因此在操作中保持灵活性并根据需要进行调整非常重要。然而，必须严格保持各试剂的比例和百分比不变。
MPLEx 方案在多种生物和环境系统中展现出广阔的应用前景，能够实现对土壤微生物群落的多组学分析。此前将 MPLEx 与其他适用于不同系统的提取方案进行比较的研究表明，其在肽段覆盖度方面具有很高的重叠性10。然而，一个已观察到的局限性是，MPLEx 不适用于需要去除的血液血浆蛋白。在这些情况下，沉淀的蛋白质无法被免疫耗竭柱中的抗体有效识别，而此类抗体是实现血浆蛋白质组广泛覆盖所必需的。因此，在此类情况下应采用更为标准的...

评估土壤微生物群落对于理解碳循环和气候变化具有重要意义。然而，近期研究强调了若干困难，例如多种土壤类型中微生物群落缺乏测序完成的基因组，以及所检测到的许多蛋白质功能尚不明确。这些挑战的根源在于土壤是迄今已知最复杂的微生物群落1,2,3。近年来，多组学分析——整合宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学、代谢组学和脂质组学研究结果的方法——已被广泛应用于多项土壤研究中，以更深入地了解存在的微生物，并全面获取因环境扰动所引发的分子变化信息1,4,5。多组学研究面临的一个挑战是，基于质谱（MS）的宏蛋白质组学、代谢组学和脂质组学检测通常需要针对每种组学分别进行特定的提取流程，以确保与质谱兼容6,7,8,9。这些精确的步骤在样品量有限的情况下，往往难以甚至无法实施。这些困难促使我们探索一种可同时提取代谢物、蛋白质和脂质（MPLEx）的方法，该方法能够使用更小的样品体积或质量，提高准确性，并为这三项分析提供更快的样品制备流程10。迄今为止，尚无其他土壤提取方法能够同时实现这些目标。
为了实现对单个土壤样本的全球多组学分析，采用了一种基于氯仿、甲醇和水相分离的有机溶剂提取方法10。该方法最初用于总脂质的提取9,11，最近被改进为可从单一样本中同时提取代谢物、蛋白质和脂质12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30，从而减少样本用量并降低实验变异性10。在MPLEx方案中，氯仿与水不互溶，由此形成三相体系，使样本组分发生化学分离并分布于不同相层中。最上层的水相含有亲水性代谢物，中间为蛋白质圆盘层，最下层的氯仿相则为脂质层（图1）。当MPLEx应用于大多数土壤时，颗粒状残渣会沉积在采样管最底部，在收集完所有相层后可将其弃去。然而，不同土壤类型存在差异；在泥炭等高有机质土壤中，土壤残渣会停留在中间层，不会沉降至采样管底部。MPLEx在从同一样本中分离多种分子类型时具有多项优势：1）可用于多组学分析的样本量更小；2）对同一样本进行多组学提取可降低整体实验变异性；3）可在更短时间内制备更多样本，从而提高通量研究的效率10。这些优势共同为更精确地评估土壤样本及其复杂的微生物群落提供了关键的测量能力。

<table><tbody><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td>储存于 -20&amp;deg;C！警告：氯仿具有急性健康危害，可引起皮肤刺激及可能的化学灼伤，对呼吸系统有刺激作用，可能影响肾脏、肝脏和心脏。佩戴合适的防护眼镜、防护服和手套，并在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>储存于 -20&amp;deg;C！警告：甲醇可能引起呼吸道、皮肤和眼睛刺激，可能损害神经、肾脏和肝脏。佩戴合适的防护眼镜、防护服和手套，并在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>Millipore纯水</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>水纯化系统。</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td>！警告：SDS具有急性毒性且易燃。对皮肤、眼睛和呼吸道具有刺激性。佩戴手套和安全眼镜。</td></tr><tr><td>土壤蛋白提取试剂盒</td><td>MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>！警告：TCA具有腐蚀性、毒性，可能引起皮肤灼伤。佩戴手套和安全眼镜。</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>储存于 -20&amp;deg;C！警告：丙酮可能引起呼吸道、皮肤和眼睛刺激。易燃液体和蒸气。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td>！警告：尿素对眼睛和皮肤有刺激性，使用时应佩戴手套和安全眼镜</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V528A</td><td>20&amp;micro;g 小瓶</td></tr><tr><td>双辛酸蛋白测定试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09735</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>！警告：乙腈对皮肤和眼睛有刺激性。高度易燃。佩戴手套和安全眼镜。在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>！警告：TFA在皮肤接触、眼睛接触、摄入或吸入时具有极高危险性。可能造成组织损伤，尤其对眼睛、口腔和呼吸道黏膜。皮肤接触可能导致灼伤。佩戴手套、实验服、安全眼镜，并在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>盐酸甲氧胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904</td><td>！警告：盐酸甲氧胺可引起严重灼伤和严重眼部损伤，皮肤接触可能引起致敏反应。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>！警告：吡啶可引起皮肤和眼睛刺激，导致中枢神经系统抑制。蒸气可能引发闪燃。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺含1%三甲基氯硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69478</td><td>！警告：MSTFA + 1% TMCS可引起皮肤腐蚀、严重眼部损伤和特定靶器官毒性。易燃液体和蒸气。佩戴安全眼镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 水纯化系统</td><td>Millipore</td><td></td><td>型号 MPGP04001</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>探头式超声破碎仪</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>型号 FB505</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>型号 5810R</td></tr><tr><td>50 mL 摆桶转子</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 固定角转子</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>OHAUS</td><td></td><td>型号 V22PWE150IT</td></tr><tr><td>移液管控制器（血清学移液管）</td><td>Eppendorf</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL、25 mL 玻璃血清学移液管</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>带 Thermotop 的恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015, 5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0.9 &amp;ndash; 2.0 mm 不锈钢混合珠</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mm 石榴石珠</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>FisherBrand</td><td>14512130</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸条，pH 范围 0&amp;ndash;14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15 mL、50 mL 锥形聚丙烯离心管</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>耐氯仿</td></tr><tr><td>50 mL 涡旋附件</td><td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>27.25x70 mm 玻璃小瓶</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Breathe Easier 板膜</td><td>Midwest Scientific</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>酒精擦拭巾</td><td>Diversified Biotech</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>加热振荡培养箱</td><td>Benchmark, Incu-Shaker Mini</td><td></td><td></td></tr><tr><td>模拟旋转管式混匀仪</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>滤膜辅助样品制备试剂盒</td><td>FASP; Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Biotek, EPOCH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 摄氏度冰箱</td><td>Fisher</td><td>13986149</td><td></td></tr><tr><td>-80 摄氏度冰箱</td><td>Stirling Ultracold</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive 离子阱质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A 气相色谱仪，配备单四极杆 5975C 质谱仪</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters NanoEquityTM 超高效液相色谱系统</td><td>Millford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 培养瓶</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>Waters 小瓶</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>玻璃质谱样品瓶及内插管</td><td>MicroSolv</td><td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>玻璃高效液相色谱瓶及压盖</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱 96 孔板</td><td>Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>大玻璃瓶 27.25x70 mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>抛光不锈钢平头刮勺</td><td>Spoonula; FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kim 擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 &amp;mu;M，配 4.6x20 mm 保护柱</td><td>Waters</td><td>186003117, 186003064</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 系列高效液相色谱系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 离心管</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 玻璃注射器，5 mL、50&amp;micro;L 和 250&amp;micro;L</td><td>Hamilton</td><td>81517, 80975, 81175</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管橡胶吸头</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>Branson 1800 Ultrasonic Cleaner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型离心柱，C18 硅胶</td><td>The Nest Group</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

用于土壤样本多组学分析的 mplex 方案

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

基于质谱（MS）的整合宏蛋白质组学、代谢组学和脂质组学（多组学）研究正在改变我们理解和表征环境与生物系统中微生物群落的能力。这些检测甚至能够对复杂的土壤微生物群落进行更深入的分析，而土壤微生物群落是迄今已知最复杂的微生物系统。然而，多组学分析在样品制备方面仍存在挑战，因为通常每种组学研究都需要独立的提取步骤，从而显著增加了制备时间和所需样品量。为解决这一局限性，研究人员通过改进一种基于溶剂的方法，开发出一种“三合一”技术——可从同一样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质（MPLEx）。该MPLEx方案已被证明对多种样品类型均简单且稳健，即使在处理少量复杂土壤样品时也表现良好。MPLEx方法还极大地促进了快速多组学检测的实现，有助于更深入地理解各微生物群落的组成成员，并评估其在生物和环境扰动下发生的变化。

当使用 MPLEx 方案从美国堪萨斯州本土草原土壤（一种软土，Mollisol）中提取分子时，三次重复分析共鉴定出 3376 种肽段、105 种脂质和 102 种极性代谢物（均为唯一性鉴定结果）。尽管 MPLEx 方案已被广泛用于脂质和代谢物的通用提取12,13,14,15,16,17,18,19,20,21</sup...

本文介绍了一种从单个土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质的实验方案，可缩短样品前处理时间，并实现对样品量有限的样本进行多组学质谱分析。

用于土壤样本多组学分析的 MPLEx 方案

基于质谱（MS）的整合宏蛋白质组学、代谢组学和脂质组学（多组学）研究正在改变我们理解和……的能力

该方法通过帮助获取与土壤相关的微生物群落在环境扰动下发生的分子变化的全面信息，被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学和脂质组学领域。该技术的主要优势在于，从单个土壤样品中同时获取多种分析物，可提高检测的精确性和准确性，同时减少样品制备所需的时间和工作量。开始操作时，针对每个20克的土壤样品，分别称取10克至两个可耐受甲醇/氯仿的50毫升离心管中。使用聚四氟乙烯（PTFE）制成的塑料管，因为氯仿会浸出大多数塑料，从而污染样品。向每根管中加入约10毫升经氯仿清洗过的不锈钢珠和石榴石珠。然后在冰上操作，向每根管中加入4毫升冰冷的超纯水，并将装有样品的管子置于冰桶中，转移至通风橱内。使用25毫升玻璃刻度移液管，迅速向各管中加入20毫升预冷的氯仿-甲醇（2:1，体积比）溶液。盖紧管盖，涡旋振荡使土壤混合物充分溶解。氯仿-甲醇溶液有助于破坏原核生物的细胞壁，并能抑制酶活性。接下来，将离心管连接到50毫升离心管涡旋振荡装置上，如果可能，置于冰箱内4°C条件下水平涡旋振荡10分钟。然后，将样品放入-80°C超低温冰箱中约15分钟，以使其充分冷却。随后，在通风橱内使用探头式超声破碎仪，用直径6毫米（1/4英寸）探头在冰上以60%的振幅对每个样品超声处理30秒。超声处理后，应将样品置于 -80 摄氏度的低温冰箱中，因为超声过程会产生大量热量。重复水平涡旋、超声和冷冻步骤后，在 4 摄氏度条件下以 4,000 ×g 离心 5 分钟。此时，样品将分为上层的代谢物层、中间的蛋白质层和下层的脂质层。将样品置于冰上。然后在通风橱内，使用10毫升玻璃刻度移液管，将两个50毫升离心管中的上层代谢物层转移至一个大的玻璃样品瓶中。接着，轻轻倾斜50毫升离心管，使中间的蛋白层释放，使其自由漂浮于下层脂质层之上。然后，使用一把洁净的不锈钢平头实验铲，小心地将两层蛋白质中间层一起刮出，并转移至一个新的50毫升离心管中。使用一支25毫升玻璃刻度移液管，将下层的脂质层转移至一个大的玻璃瓶中。向含有残渣的两个离心管以及含有蛋白质中间层的一个离心管中各加入20毫升预冷的甲醇。短暂涡旋混匀各管，然后在4,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，以收集沉淀物和蛋白质中间层。随后，在通风橱内将甲醇上清液倾倒至有害废物容器中。用液氮冷冻蛋白质和沉淀物，再在冻干机中干燥约2小时。向每个碎片沉淀中加入20毫升蛋白质溶解缓冲液（50毫摩尔Tris缓冲液，pH 8.0），向蛋白质中间层管中加入10毫升。在通风橱中，将样品以20%的振幅进行探头超声处理30秒，使其溶解。将样品涡旋振荡两分钟。然后，将蛋白质中间层样品放入50摄氏度的实验室管式旋转仪中旋转30分钟，以溶解蛋白质。将残渣样品水平涡旋额外10分钟，以裂解任何残留的完整细胞。接着，将蛋白质中间层样品继续旋转剩余的20分钟。将所有样品在室温下以4,500 × g离心10分钟，每份样品收集上清液至两个50毫升离心管中。向蛋白质中间层沉淀中加入10毫升溶解缓冲液，随后进行超声处理，并涡旋振荡使沉淀重新溶解。离心后，将上清液等量合并至两个含有碎片沉淀上清液的50毫升离心管中，在4°C条件下，使用固定角转子以8,000 × g离心10分钟，以沉淀任何残留的碎片。将上清液分装至两个50毫升离心管中。然后，使用10毫升玻璃刻度移液管，向每根离心管中加入7.5毫升三氯乙酸（TCA）。将样品涡旋振荡至溶解。随后，将样品置于负20摄氏度冰箱中冷冻2小时至过夜。为沉淀蛋白质，于4摄氏度条件下以4,500 × g离心10分钟，收集沉淀，并将上清液倾入废液容器中。向每份蛋白质沉淀中加入10毫升100%预冷的丙酮。涡旋振荡各管，将相同的沉淀合并至同一管中。离心后小心倾去丙酮。使用较少量的丙酮洗涤沉淀物两次，并将悬液转移至1.5或2毫升离心管中进行最终离心。将上清液倒入废液容器中，然后将沉淀物倒置在通风橱内的纸巾上干燥约20分钟。根据沉淀物的大小，加入100至200微升蛋白溶解缓冲液。将沉淀物超声并涡旋至溶解。注意，由于腐殖物质随蛋白质一同沉淀，样品可能呈黏稠状，后续离心步骤将去除这些物质。最后，在300 rpm、40摄氏度条件下于摇床或培养箱中振荡样品30分钟，使蛋白质充分溶解，随后即可进行蛋白质消化或速冻保存以备后续处理。通过本视频展示的MPLEx方案，从堪萨斯州本土草原土壤中提取出3,376种肽段、105种脂质和102种极性代谢物，并通过反相液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）将该方案的蛋白质提取效果与市售蛋白质提取试剂盒及SDS提取法进行了比较。在初步比较市售蛋白质提取试剂盒和SDS方法的三个重复样本时，两种技术之间仅有12%的肽段重叠，表明微生物群落的复杂性以及不同提取方法带来的差异。将MPLEx方法与市售蛋白质提取试剂盒及SDS提取物进行比较时，使用MPLEx方法检测到的肽段中约有38%在SDS和/或市售试剂盒提取中也被检测到。考虑到堪萨斯州土壤细菌群落及其宏基因组中的物种数量，肽段鉴定结果的重叠是合理的。如前所示，MPLEx 方法的广泛适用性已通过多种样本进行了评估，包括古菌 S.acidocaldarius、单细胞蓝藻群落、小鼠脑皮层组织、人尿液以及 A.thaliana 叶片。在所有情况下，MPLEx 方法检测到的蛋白质数量与对照组相似，表明该方法适用于多种不同类型的样本。观看本视频后，您应能够充分了解如何从单个土壤样品中提取蛋白质、代谢物和脂质。在进行该实验操作时，需保持灵活性，因为不同类型的土壤存在差异。例如，蛋白质中间层的大小将因土壤中的生物量及腐殖质成分的不同而有所变化。请注意，使用氯仿可能具有极高危险性，进行本实验操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作。

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