利用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡

本实验的总体目标是观察两栖动物真菌病原体蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）对青蛙表皮组织中细胞凋亡和细胞死亡的影响。该方法有助于我们理解野生动物疾病，例如感染是否引起细胞死亡，或者相反地，是否存在针对感染的免疫机制。该技术的主要优势在于，它可用于微小的组织活检样本，从而能够在感染过程中对小型个体进行多次重复取样。

开始此操作前，按照文本方案中的说明制备带有样本组织的亲水性玻片。为脱去组织切片中的石蜡，将玻片置于考普林瓶中，用二甲苯洗涤三次，每次五分钟。接着，用100%乙醇将玻片洗涤两次，每次五分钟。

此后，将切片分别用95%乙醇和70%乙醇各洗涤3分钟。然后用PBS洗涤切片一次，持续5分钟。为制备实验组和阴性对照组切片，需通过直接向切片添加新配制的蛋白酶K对组织进行预处理。

将切片在室温下孵育10分钟。然后用PBS洗涤切片，每次2分钟，共洗两次。为制备阳性对照切片，先用DN缓冲液预处理组织，然后将切片在室温下孵育5分钟。

此后，将DNase I溶解于DN缓冲液中，使其终浓度为0.1微克/毫升。将制备好的DNase溶液加入载玻片中。室温孵育15分钟。

然后，将载玻片置于考普林瓶中，用蒸馏水洗涤五次，每次三分钟。在含3%过氧化氢的PBS溶液中室温孵育五分钟以淬灭反应。接着，将载玻片在PBS中洗涤两次，每次两分钟。

然后，向载玻片上的组织加入平衡缓冲液。室温孵育10秒。随后，吸去组织切片周围的多余液体。

将末端脱氧核苷酸转移酶用反应缓冲液稀释，然后加入实验组和阳性对照组玻片上的组织中。在37摄氏度的湿化孵育盒中孵育一小时。

此后，将切片放入盛有工作浓度终止缓冲液的考兰罐中，振荡15秒，然后在室温下孵育10分钟。接着用PBS洗涤切片三次，每次1分钟，轻拍去除多余液体。

接下来，将预先温育至室温的抗地高辛配体直接加到组织上。将切片置于湿盒中，室温避光孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤切片4次，每次2分钟。

轻敲去除多余液体。然后向切片上加入封片剂。向切片上的封片剂中加入15微升DAPI溶液。

用盖玻片覆盖每张载玻片，并用指甲油封片。将载玻片置于避光环境中干燥。使用荧光显微镜，在静置过程完成后立即观察载玻片。

在每块皮肤切片上随机选取位置，以400倍放大倍数拍摄照片。计数经DAPI染色的蓝色细胞，确保每只动物每块皮肤切片中至少有100个细胞可见。接着，计数呈红色单个细胞且细胞边界清晰的TUNEL阳性细胞数量。

首先，使用倒置光学显微镜在40倍下拍摄每只青蛙脚趾的照片。在脚趾夹边缘周围画线，并使用成像软件估算该形状内的面积。为评估三维皮肤样本的表面积，将估算面积乘以π。

为了从冷冻的青蛙脚趾样本中提取蛋白质，将样本放入含有100微升样本缓冲液和两颗不锈钢珠的1.5毫升螺口微量离心管中。使用珠磨机以最高速度裂解细胞。随后，将离心管置于冰上静置3分钟。

然后，离心试管以收集上清液。在384孔板中进行caspase 3/7检测时，每孔加入10 µL样品缓冲液作为空白对照，并以三复孔形式加入10 µL蛋白提取物。随后，向蛋白提取物孔和空白对照孔中各加入10 µL市售的caspase 3/7试剂。

然后，轻轻振荡平板15秒以混匀两种试剂。在室温避光条件下孵育30分钟。最后，使用化学发光酶标仪检测样品的发光值。

本研究中，与对照组动物相比，感染动物表现出显著更多的TUNEL阳性细胞，这些细胞呈红色或粉红色染色。在对照组动物中，TUNEL阳性细胞较少，且未集中在表皮层。而在感染动物中，TUNEL阳性细胞在表皮层中更为常见。

TUNEL 阳性细胞更集中于感染细胞所在位置及其紧邻区域。此外，在表皮以及比真菌病原体定植位置更深的表皮层中，TUNEL 阳性细胞的分布更为广泛。在感染动物中，三种皮肤类型中均出现更多的 TUNEL 阳性细胞，尤其在大腿和腹部皮肤中水平显著升高。

在caspase检测中，感染强度与caspase 3/7活性呈正相关。此外，感染动物与未感染动物的caspase 3/7活性随时间变化存在差异。感染动物在接种后的最初几周内caspase 3/7活性下降，随后在第七周结束前逐渐升高。

未感染个体中的caspase 3/7活性保持恒定。进行TUNEL检测时，为避免灵敏度下降，应在检测当天观察切片，并将切片保存在阴凉避光处以保护染料。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用两种不同的检测方法，在两栖动物皮肤等小型组织样本中检测细胞凋亡和细胞死亡。