Name: 用末端转移酶介导的 dUTP 尼克末端标记 (Caspase 3/7) 测定青蛙壶菌病的表皮细胞死亡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 了解TUNEL组织学染色和Caspase 3/7蛋白分析方法，用于检测蛙类壶菌感染引起的表皮细胞凋亡。该技术可在小组织活检样本上进行重复采样，为野生动物疾病研究提供重要数据。

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感谢以下人员在饲养和数据收集方面提供的帮助：D. Tegtmeier、C. De Jong、J. Hawkes、K. Fossen、S. Percival、M. McWilliams、L. Bertola、M. Stewart、N. Harney 和 T. Knavel；以及 M. Merces 在解剖方面的协助。我们还要感谢 M. McFadden、P. Harlow 和塔龙加动物园（Taronga Zoo）对高山蛙（L. v. alpina）的繁育工作，以及 G. Marantelli 对喧蛙（P. corroboree）的繁育支持。感谢 F. Pasmans 和 A. Martel 在细胞凋亡检测方面的建议，感谢 C. Constantine、A. Kladnik 和 R. Webb 在TUNEL检测中的协助，以及 T. Emeto 和 W. Weßels 在caspase 3/7 检测方案和试剂盒方面的帮助。本稿件和实验方案改编自 Brannelly et al 2017 年发表于 Peer J22。

詹姆斯·库克大学批准了动物伦理申请，P. corroboree 的申请编号为 A1875，L. v. alpina 的申请编号为 A1897 和 A2171。
1. 动物饲养与监测
<ol>
	<li>将动物单独饲养，提供适合该物种的环境，并制定适当的供水、喂食和清洁计划。每天检查动物状况。
	<ol>
		<li>使用来自人工繁育设施捐赠的成年个体，包括极危物种Pseudophryne corroboree（用于TUNEL检测，第4节）和濒危物种Litoria verreauxii alpina（用于Caspase 3/7检测，第5节）。将动物维持在15–18 °C环境中，底材使用苔藓和碎石，每日用反渗透水喷雾保湿，每周喂食三次肠道富集的蟋蟀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周对每只个体采集一次数据。按照步骤2.1所述方法对个体进行Bd拭子取样。使用天平称量每只动物的体重，精确至0.1 g，并使用数显卡尺测量其吻肛长（SVL），精确至0.01 mm。</li>
	<li>接种后（如第3节所述），应每天检查动物是否出现感染的临床症状（皮肤异常脱落、食欲减退、腿部发红、精神萎靡或翻正反射延迟），并遵守动物伦理指南。若动物出现临床症状和明显病态，应实施安乐死。
	<ol>
		<li>使用过量三卡因甲磺酸盐（MS222）实施安乐死（在陈化自来水中配制0.1% w/v MS222溶液，用碳酸氢钠调节pH至6–&#160;7）。在动物所有活动停止且对外界刺激无反应后，继续将其留在MS222溶液中10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 检测 Bd 感染
<ol>
	<li>对 Bd 进行拭子采样
	<ol>
		<li>使用新的无菌人造丝拭子对每只动物进行采样（每只动物使用一个拭子）。采样方法如下：腹部擦拭5次，每个大腿、体侧和四肢各擦拭5次。总共45次擦拭动作。</li>
		<li>在擦拭过程中及每次擦拭之间轻轻旋转拭子，以确保有效捕获DNA。将拭子头折断放入1.5 mL微量离心管中，并于-20 °C保存直至提取DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA提取与qPCR检测
	<ol>
		<li>通过向含有30 - 40 mg 0.5 mm二氧化硅珠的50 µL商用DNA提取试剂中加入拭子样本，提取基因组DNA。在珠磨仪细胞破碎仪中以最大速度震荡样品2 min。珠磨步骤完成后，以2,000 x g离心1 min。</li>
		<li>将样品在100 °C孵育10 min，随后冷却。以5,000 x g离心3 min，然后将上清液转移至各自的1.5 mL微量离心管中，并于-20 °C保存直至进行qPCR。</li>
		<li>按照Boyle et al. 200418的方法进行定量PCR（qPCR）以分析感染负荷。采用以下修改：
		<ol>
			<li>用双蒸水将DNA提取样本稀释6:100。向每个孔中加入0.7 µL牛血清白蛋白（BSA），以帮助防止PCR抑制。每个样本单次运行。每块板上均设置阴性（无模板）对照和阳性对照，并使用一系列稀释标准品来估算游动孢子（感染）负荷。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 接种
<ol>
	<li>培养 Bd
	<ol>
		<li>通过将 16 g 胰蛋白胨、2 g 明胶水解物和 4 g 乳糖（TGHL）加入 1 L 去离子水中制备培养液。在 121 °C 下高压灭菌 40 分钟，然后让培养液冷却。</li>
		<li>将 Bd 分离株（本例中为来自新南威尔士州的分离株 AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1，传代次数为 11）接种至 TGHL 培养液中，在 23 °C 下培养 7 天，随后将液体培养物转移至 TGHL 琼脂平板上。</li>
		<li>制备平板时，向 1 L 去离子水中加入 16 g 胰蛋白胨、2 g 明胶水解物、4 g 乳糖（TGHL）和 10 g 细菌学琼脂，高压灭菌（121 °C，40 分钟）。待混合物冷却至可触碰但尚未凝固时，在 II 级生物安全柜中将 TGHL 琼脂倒入直径为 92 mm 的培养皿中，填充至 1/4 至 1/3 满。</li>
		<li>待琼脂完全凝固并冷却后，每块平板接种 0.5 mL 来自液体培养液的 Bd，并均匀涂布。让 Bd 培养液混合物在平板上干燥约 1 小时，然后用塑料封口膜密封平板。将平板倒置，在 23 °C 下培养 5–7 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备游动孢子接种液的平板冲洗
	<ol>
		<li>接种前每日在倒置光学显微镜下检查游动孢子的运动性以确保其活性。当游动孢子释放量高，大量游动孢子在孢子囊外游动时，表明培养物已准备好用于接种。</li>
		<li>向每块平板加入 3 mL 陈化自来水或人工池水，将水倒入平板后在室温下孵育 10 分钟，使游动孢子释放到水中。孵育结束后，将游动孢子悬液倾入新的无菌容器中。</li>
		<li>按照血球计数板制造商的说明估算游动孢子浓度。确定游动孢子悬液浓度后，用陈化自来水将其稀释至每 3 mL 含 1 × 106 个游动孢子的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物接种
	<ol>
		<li>将 3 mL 接种液混合物倾倒于各动物腹侧19，置于独立的 50 mL 容器中进行接种。让多余的接种液积聚在接种容器底部。每只动物在独立的接种容器中放置 24 小时以确保感染成功；24 小时接种结束后，将每只动物转移回已消毒的饲养箱。
		<ol>
			<li>使用体积分数为 13% 的商用漂白剂溶液对饲养箱进行消毒20，用水至少冲洗两次，然后静置干燥不少于 24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于 Bd 阴性对照组，采用与步骤 3.2–3.3 相同的方法进行模拟接种，但使用 5 mL 陈化自来水冲洗未接种 Bd 的琼脂平板，而非接种了 Bd 的琼脂平板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. TUNEL 检测
<ol>
	<li>对出现步骤1.3.1中所述壶菌病临床症状的动物实施安乐死，并对同等数量的 Bd阴性对照动物</li>
	<li>从每只动物身上采集皮肤样本（背部、腹部和大腿部）。将皮肤样本在4%（v/v）磷酸盐缓冲甲醛中固定2 h。较短且一致的固定时间可确保组织充分固定，同时有利于实现有效且准确的免疫组织化学染色。随后转移至80%乙醇中保存，直至包埋切片。</li>
	<li>按照标准方法将皮肤组织包埋于石蜡中以进行组织学制备21简要而言，实验步骤如下：
	<ol>
		<li>将组织置于梯度浓度的乙醇中脱水，并用二甲苯清除乙醇。将组织包埋于石蜡中，将每个个体的三个皮肤样本置于同一石蜡块中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用切片机按照标准组织学制备方法对皮肤进行切片21将组织以5 µm厚度连续切片，然后贴附于亲水性玻璃载玻片上。每张载玻片上放置每种皮肤类型连续的4张组织切片。每个个体制备3张载玻片，每张载玻片均含有每种组织的4张连续切片。</li>
	<li>按以下顺序对玻片进行染色：
	<ol>
		<li>用苏木精对第一张玻片进行染色，随后进行伊红复染（H&E）&amp;#38;E）。此幻灯片用于可视化定位 Bd 皮肤内的孢子囊。</li>
		<li>按照市售的TUNEL检测试剂盒对第二张载玻片进行染色，用于组织学制备，并遵循制造商提供的说明，如下所述。
		<ol>
			<li>首先，在 Coplin 染色缸中进行脱蜡：将切片用二甲苯洗涤三次，每次 5 分钟，每次更换新液；随后用 100% 乙醇洗涤两次，每次 5 分钟，每次更换新液。接着用 95% 乙醇洗涤一次，持续 3 分钟，再用 70% 乙醇洗涤一次，持续 3 分钟。最后用 PBS 洗涤一次，持续 5 分钟。</li>
			<li>用新配制的蛋白消化酶（蛋白酶K，以PBS稀释至浓度为20 μg/mL）对组织进行预处理，直接加至载玻片上，孵育15分钟。在Coplin染色缸中用PBS洗涤两次，每次2分钟。</li>
			<li>轻拍去除多余液体，将切片浸入盛有 PBS 配制的 3.0% 过氧化氢的考普林瓶中，室温下淬灭 2 分钟。用 PBS 漂洗两次，每次 5 分钟。</li>
			<li>轻敲去除多余液体，然后每5 cm加入75 µL2 将平衡缓冲液直接加到载玻片上的组织上，孵育10秒。轻轻吸去切片周围多余的液体，然后每5 cm²加入55 µL2&#160;含有具有活性的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）酶。在37 °C下于湿化密闭容器中孵育1小时。</li>
			<li>TdT孵育后，将玻片放入盛有工作浓度终止/洗涤缓冲液的考普林瓶中，振荡15秒，室温孵育10分钟。用PBS洗涤三次，每次1分钟。轻拍去除多余液体。</li>
			<li>将已升温至室温的抗地高辛配基偶联物（罗丹明）加入组织，每5 cm加入65 µL2在湿盒中室温孵育30分钟，避免光照。用PBS洗涤四次，每次2分钟。吸去多余液体。</li>
			<li>最后，在载玻片上加入15 µL浓度为0.5–1 µg/mL的DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）封片介质，用作复染剂。随后加盖盖玻片，并用指甲油或橡胶胶水密封。由于该检测对光敏感，需将载玻片置于避光环境中干燥。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第三张载玻片采用TUNEL检测法染色，并用DAPI复染，每份样本均需设置阳性和阴性对照。 
		注意：对照载玻片上的4个组织切片中，前2个为阳性对照重复样本，后2个为阴性对照重复样本。
		<ol>
			<li>对于阳性对照，无需执行步骤 4.5.2.2，而是使用 DN 缓冲液（30 mM Trizma base，pH 7.2，4 mM MgCl₂）对组织进行预处理2，0.1 mM DDT），室温孵育5分钟。然后将DNase I溶于DN缓冲液中，终浓度为0.1 μg/mL，直接加至载玻片上，室温孵育15分钟。&#160; 然后，用5次去离子水洗涤载玻片2每次洗涤3分钟，吸去多余液体。然后按照第4.5.2.3节的指示继续进行TUNEL检测。</li>
			<li>对于阴性对照，不要向这些样品中加入末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）（如第4.5.2.4节所述）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验完成后立即观察TUNEL切片。
	<ol>
		<li>使用荧光显微镜在200倍放大下，对每块皮肤切片随机间隔拍照，分别采用罗丹明染色滤光片（显示凋亡细胞，呈红色）和DAPI滤光片（显示所有细胞核，呈蓝色），以便生成细胞叠加图像。确保每份样本的每块皮肤切片至少拍摄100个细胞。将载玻片置于暗盒中，于-20 °C保存。</li>
		<li>每张图像中计数细胞（蓝色DAPI染色）。确保每份皮肤切片至少计数100个细胞。若单张图像中细胞数不足100个，则继续计数另一张图像，直至每只动物每份皮肤切片的细胞总数达到至少100个。</li>
		<li>接下来，在相同的图像中计数TUNEL阳性细胞的数量（红色罗丹明染色）。TUNEL阳性细胞指示凋亡，而非坏死或背景信号，表现为具有清晰细胞边界的单个细胞（细胞膜完整，无裂解）。有时细胞会收缩形成凋亡小体。</li>
		<li>定位TUNEL染色中计数的区域，并分析其在H中的对应区域&amp;#38;E 染色的组织切片。确认 H&amp;#38;E 染色切片对应于位点 Bd 感染，以确保 Bd在TUNEL检测中计数凋亡细胞时，使用感染位点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Caspase 3/7 检测
<ol>
	<li>从每只动物（包括暴露于Bd和未感染Bd的个体）中每周采集一次脚趾尖样本，持续至接种后第3周，之后每两周采集一次直至实验结束，每次最多采集8个脚趾尖。
	<ol>
		<li>使用火焰灭菌的剪刀在第二指节处剪下脚趾尖，放入1.5 mL微量离心管中，并立即在-80 °C下冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从冷冻的脚趾样本中提取蛋白质。
	<ol>
		<li>将样本置于含有两颗不锈钢珠（3.2 mm）的1.5 mL螺口微量离心管中，加入100 µL样品缓冲液（25 mM HEPES，pH 7，5 mM MgCl2）。使用珠磨仪以最大速度进行4次珠磨处理，每次1分钟，每次间隔在冰上放置3分钟。裂解完成后，在4 °C下以12,000 x g离心5分钟。收集上清液用于后续检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Bradford法测定每个样本的蛋白浓度。
	<ol>
		<li>在384孔板中，将10 µL蛋白提取物与10 µL Bradford试剂混合，在室温下孵育2分钟。每个样本设两个复孔，并同时设置一系列5倍稀释的BSA标准品。使用吸光度酶标仪在595 nm波长下读取吸光值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若脚趾尖样本过小（根据步骤4.3.1中Bradford测定结果，蛋白浓度接近最低标准值，或所采样的蛙总重量低于3 g），可改用拍照估算皮肤表面积的方法对样本进行标准化处理，而非采用Bradford法。
	<ol>
		<li>在为caspase检测提取蛋白前，使用倒置光学显微镜以40倍放大倍数拍摄每个脚趾尖的照片。</li>
		<li>使用计算机图像分析软件分析脚趾样本，通过估算脚趾面积进行测量：沿脚趾剪切样本边缘绘制轮廓线，由图像软件计算该轮廓内的面积，再将此面积乘以π（3.14），从而估算出三维皮肤样本的表面积（因为管状结构的外表面积等于长度乘以横截面周长，即π×直径）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行caspase 3/7活性检测。
	<ol>
		<li>在384孔发光检测板中，每孔加入10 µL commercially available caspase 3/7试剂和10 µL蛋白提取物。每个样本设三个复孔。</li>
		<li>缓慢振荡酶标板15秒以混匀试剂。将板避光孵育30分钟，室温条件下进行。使用发光酶标仪测定发光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li>
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<li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925(2017).</li>
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作者声明不存在竞争性财务利益。

我们探讨了表皮细胞凋亡和细胞死亡作为致命性疾病壶菌病的潜在病理机制或疾病抗性机制的可能性 Bd 易感物种。我们采用两种方法评估表皮细胞死亡，即TUNEL检测法 原位 表皮细胞死亡分析及半胱天冬酶3/7检测用于监测感染过程中表皮细胞死亡情况。我们发现，细胞死亡和凋亡与感染负荷相关，且在感染部位细胞死亡显著升高。在感染早期，表皮中凋亡水平下降，但随着感染组织内病原体负荷增加，凋亡水平随之上升。
细胞凋亡可通过多种不同方法进行检测，每种方法均有其优势与局限性。为了验证研究结果，采用多种检测手段来研究细胞凋亡和细胞死亡至关重要。在本研究中，我们采用了两种不同的检测方法来探究患壶菌病青蛙表皮细胞的死亡与凋亡情况。首先，我们尝试使用TUNEL检测法评估细胞死亡 原位该检测方法耗时较长，每份样品的成本较高，且载玻片必须立即读取，因为荧光信号会迅速衰减。尽管存在这些局限性，该方法的结果仍具有较高的可靠性。 原位 实验对于进一步理解宿主-病原体相互作用的机制至关重要。通过该方法可确定定位信息，在本研究中，真菌感染部位出现高水平的...

两栖动物目前正经历着所有脊椎动物类群中最严重的全球生物多样性丧失之一1。导致这一衰退的主要原因是由真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis, Bd引起的致命性皮肤疾病——壶菌病2。该病原体浅表感染表皮，可能导致皮肤功能紊乱，进而引发严重的电解质流失、心脏骤停甚至死亡3。目前，针对Bd的多种潜在宿主免疫机制正在被研究，例如抗菌肽4,5、皮肤细菌群落6、免疫细胞受体7,8以及淋巴细胞活性9,10。然而，很少有研究探讨表皮细胞凋亡和细胞死亡是否是抵抗这种致命病原体的一种免疫机制。
细胞死亡，无论是通过凋亡（程序性细胞死亡）还是坏死（非程序性死亡），在表皮中均可能是一种病理表现 Bd 感染。先前的研究表明 Bd 感染可能诱导细胞凋亡，因为当皮肤外植体暴露于游动孢子上清液时，可观察到细胞内连接结构的破坏。 体外11. 此外，表皮的退行性改变在 Bd使用电子显微镜观察感染的青蛙12,13转录组学分析表明，感染皮肤中凋亡通路被上调14，当两栖动物的脾细胞暴露于以下条件时会发生凋亡 Bd 上清液 体外15尽管越来越多的证据表明 Bd 可诱导凋亡和宿主细胞死亡 体外, 体内 通过感染进程探究或量化凋亡机制的研究尚且缺乏。此外，尚不清楚宿主是否将凋亡作为一种防御性免疫策略来对抗 Bd 感染，或细胞凋亡是否为疾病的病理特征。
在本研究中，我们旨在通过两种方法在感染动物体内（in vivo）检测表皮细胞死亡和凋亡：半胱天冬酶3/7（caspase 3/7）蛋白检测法，以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）原位检测法。由于每种检测方法可识别细胞死亡的不同方面16，联合使用这些方法可全面理解细胞死亡的机制，并确保对效应的准确评估。caspase 3/7检测法可定量效应caspase 3和7的活性，从而量化内源性和外源性凋亡通路。相比之下，TUNEL检测法可检测DNA片段化，这种片段化可由包括凋亡、坏死和焦亡在内的多种细胞死亡机制引起17。我们使用TUNEL检测法，通过三种不同皮肤切片——Pseudophryne corroboree的背部、腹部和大腿部位，研究临床感染与未感染动物表皮内细胞死亡的位置。该方法可确定细胞死亡的解剖位置，并区分其在特定表皮层中的分布。随后，我们采用caspase 3/7检测法对Litoria verreauxii alpina在8周感染期间的凋亡进行时间序列定量分析。我们对同一批动物每两周采集一次脚趾尖样本，从而将病原体感染负荷与caspase 3/7活性进行关联分析。

<table><tbody><tr><td>POLARstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>化学发光酶标仪</td></tr><tr><td>384孔平底透明板</td><td>Corning</td><td>3707</td><td></td></tr><tr><td>384孔低边白色平底板</td><td>Corning</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>细菌用琼脂（Oxoid）</td><td>Fisher</td><td>OXLP0011B</td><td></td></tr><tr><td>10%中性缓冲福尔马林（Formal-Fixx）</td><td>Fisher</td><td>6764254</td><td></td></tr><tr><td>乳糖肉汤（Oxoid）</td><td>Fisher</td><td>OXCM0137B</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Tricane-S（MS-222）</td><td>Fisher</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>无菌人造丝拭子</td><td>Medical Wire &amp; Equipment</td><td>MW-113</td><td></td></tr><tr><td>ApopTag 红色原位细胞凋亡检测试剂盒</td><td>Merck Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Bradford 试剂</td><td>Pierce</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Caspase Glo&amp;nbsp; 3/7</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887-20ML</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1374248-1G</td><td></td></tr><tr><td>酶解明胶水解物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0262</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.2（1X）</td><td>Thermo/Life</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Prepman</td><td>Thermo/Life</td><td>4318930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444556</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Clorox漂白剂</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200度，分子生物学级</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Scan 荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>3.2 mm不锈钢珠</td><td>BioSpec</td><td>11079132SS</td><td></td></tr><tr><td>引物 ITSI-3 Chytr（5&amp;prime;-CCTTGAT&lt;br /&gt;ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&amp;prime;）</td><td>Taqman</td><td></td><td>引物和探针的个性化设计</td></tr><tr><td>引物 5.8S Chytr（5&amp;prime;-TCGGTT&lt;br /&gt;CTCTAGGCAACAGTTT-3&amp;prime;）</td><td>Taqman</td><td></td><td>引物和探针的个性化设计</td></tr><tr><td>小沟结合探针 Chytr MGB2（5&amp;prime;-CGAGTCGAAC-3&amp;prime;）</td><td>Taqman</td><td></td><td>引物和探针的个性化设计</td></tr><tr><td>Rotor-Gene qPCR 仪器</td><td>Qiagen</td><td></td><td>qPCR仪</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>02-681-372</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养培养皿</td><td>Nunc</td><td>263991</td><td></td></tr><tr><td>Mini-beadBeater 锆硅酸盐珠，0.5 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105Z</td><td></td></tr></tbody></table>

利用末端转移酶介导的dutp缺口末端标记（tunel）和caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

两栖动物在全球范围内正经历严重的生物多样性丧失，其中主要原因是传染病壶菌病。该疾病由真菌病原体引起 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd），会感染并破坏蛙类表皮；然而，其病理变化尚未被明确表征。细胞凋亡（程序性细胞死亡）既可被病原体利用以损伤宿主组织，也可作为宿主抵抗疾病、清除病原体的防御机制。本研究中，我们采用两种不同的检测方法——末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）和caspase 3/7检测，对感染与未感染动物的表皮细胞死亡情况进行定量分析。在TUNEL检测中，利用腹部、背部和大腿皮肤组织，我们观察到表皮细胞中存在细胞死亡现象 原位 对临床感染动物和未感染动物进行荧光显微镜观察，比较其细胞死亡情况。为了确定感染过程中表皮细胞凋亡水平的变化，我们在8周内每两周采集一次趾尖组织样本，提取蛋白质后采用caspase 3/7检测试剂盒定量分析样本中的酶活性，并将caspase 3/7活性与感染负荷进行相关性分析。TUNEL检测可用于细胞死亡的定位分析。 原位但每个样本的成本较高且耗时较长。半胱天冬酶3/7（caspase 3/7）检测适用于大样本量和时间序列实验。然而，由于蛙类趾尖活检样本较小，通过 Bradford 法等蛋白定量方法进行样本标准化时可获得的提取物有限。因此，我们建议通过趾部活检照片分析估算皮肤表面积，以避免在样本标准化过程中消耗提取物。

TUNEL 检测
感染动物中TUNEL阳性细胞数量多于未感染的对照动物。 原位 感染组与对照组动物中TUNEL阳性细胞的分布位置存在差异。在对照组动物中，TUNEL阳性细胞在真皮层和表皮层中呈均匀分布，且水平较低（见 图1A），但在感染动物中，TUNEL阳性细胞在表皮中更为常见（图1B）。感染部位（如H&amp;E染色的载玻片）上观察到成团的 Bd 孢子囊分散分布于大腿和腹侧皮肤切片中，背部皮肤切片中未见。而TUNEL阳性细胞则更集中于感染细胞所在部位及其紧邻区域。图1C），在表皮以及比该位置更深的表皮层中也出现了更广泛的TUNEL阳性细胞 Bd 居住于. 在 Bd 感...

我们采用两种方法量化患壶菌病青蛙的表皮细胞死亡。首先，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL） 原位 组织学分析以确定临床感染动物与未感染动物之间的差异；其次，通过caspase 3/7蛋白分析，对感染过程中细胞凋亡进行时间序列研究。

利用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡

两栖动物在全球范围内正经历严重的生物多样性丧失，其主要原因是传染病壶菌病。该疾病是……

本实验的总体目标是观察两栖动物真菌病原体蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）对青蛙表皮组织中细胞凋亡和细胞死亡的影响。该方法有助于我们理解野生动物疾病，例如感染是否引起细胞死亡，或者相反地，是否存在针对感染的免疫机制。该技术的主要优势在于，它可用于微小的组织活检样本，从而能够在感染过程中对小型个体进行多次重复取样。开始此操作前，按照文本方案中的说明制备带有样本组织的亲水性玻片。为脱去组织切片中的石蜡，将玻片置于考普林瓶中，用二甲苯洗涤三次，每次五分钟。接着，用100%乙醇将玻片洗涤两次，每次五分钟。此后，将切片分别用95%乙醇和70%乙醇各洗涤3分钟。然后用PBS洗涤切片一次，持续5分钟。为制备实验组和阴性对照组切片，需通过直接向切片添加新配制的蛋白酶K对组织进行预处理。将切片在室温下孵育10分钟。然后用PBS洗涤切片，每次2分钟，共洗两次。为制备阳性对照切片，先用DN缓冲液预处理组织，然后将切片在室温下孵育5分钟。此后，将DNase I溶解于DN缓冲液中，使其终浓度为0.1微克/毫升。将制备好的DNase溶液加入载玻片中。室温孵育15分钟。然后，将载玻片置于考普林瓶中，用蒸馏水洗涤五次，每次三分钟。在含3%过氧化氢的PBS溶液中室温孵育五分钟以淬灭反应。接着，将载玻片在PBS中洗涤两次，每次两分钟。然后，向载玻片上的组织加入平衡缓冲液。室温孵育10秒。随后，吸去组织切片周围的多余液体。将末端脱氧核苷酸转移酶用反应缓冲液稀释，然后加入实验组和阳性对照组玻片上的组织中。在37摄氏度的湿化孵育盒中孵育一小时。此后，将切片放入盛有工作浓度终止缓冲液的考兰罐中，振荡15秒，然后在室温下孵育10分钟。接着用PBS洗涤切片三次，每次1分钟，轻拍去除多余液体。接下来，将预先温育至室温的抗地高辛配体直接加到组织上。将切片置于湿盒中，室温避光孵育30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤切片4次，每次2分钟。轻敲去除多余液体。然后向切片上加入封片剂。向切片上的封片剂中加入15微升DAPI溶液。用盖玻片覆盖每张载玻片，并用指甲油封片。将载玻片置于避光环境中干燥。使用荧光显微镜，在静置过程完成后立即观察载玻片。在每块皮肤切片上随机选取位置，以400倍放大倍数拍摄照片。计数经DAPI染色的蓝色细胞，确保每只动物每块皮肤切片中至少有100个细胞可见。接着，计数呈红色单个细胞且细胞边界清晰的TUNEL阳性细胞数量。首先，使用倒置光学显微镜在40倍下拍摄每只青蛙脚趾的照片。在脚趾夹边缘周围画线，并使用成像软件估算该形状内的面积。为评估三维皮肤样本的表面积，将估算面积乘以π。为了从冷冻的青蛙脚趾样本中提取蛋白质，将样本放入含有100微升样本缓冲液和两颗不锈钢珠的1.5毫升螺口微量离心管中。使用珠磨机以最高速度裂解细胞。随后，将离心管置于冰上静置3分钟。然后，离心试管以收集上清液。在384孔板中进行caspase 3/7检测时，每孔加入10 µL样品缓冲液作为空白对照，并以三复孔形式加入10 µL蛋白提取物。随后，向蛋白提取物孔和空白对照孔中各加入10 µL市售的caspase 3/7试剂。然后，轻轻振荡平板15秒以混匀两种试剂。在室温避光条件下孵育30分钟。最后，使用化学发光酶标仪检测样品的发光值。本研究中，与对照组动物相比，感染动物表现出显著更多的TUNEL阳性细胞，这些细胞呈红色或粉红色染色。在对照组动物中，TUNEL阳性细胞较少，且未集中在表皮层。而在感染动物中，TUNEL阳性细胞在表皮层中更为常见。TUNEL 阳性细胞更集中于感染细胞所在位置及其紧邻区域。此外，在表皮以及比真菌病原体定植位置更深的表皮层中，TUNEL 阳性细胞的分布更为广泛。在感染动物中，三种皮肤类型中均出现更多的 TUNEL 阳性细胞，尤其在大腿和腹部皮肤中水平显著升高。在caspase检测中，感染强度与caspase 3/7活性呈正相关。此外，感染动物与未感染动物的caspase 3/7活性随时间变化存在差异。感染动物在接种后的最初几周内caspase 3/7活性下降，随后在第七周结束前逐渐升高。未感染个体中的caspase 3/7活性保持恒定。进行TUNEL检测时，为避免灵敏度下降，应在检测当天观察切片，并将切片保存在阴凉避光处以保护染料。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用两种不同的检测方法，在两栖动物皮肤等小型组织样本中检测细胞凋亡和细胞死亡。

using-terminal-transferase-mediated-dutp-nick-end-labelling-tunel

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用末端转移酶介导的 dUTP 尼克末端标记 (Caspase 3/7) 测定青蛙壶菌病的表皮细胞死亡

利用 NucView 488 caspase-3 底物对永生化 N19-少突胶质细胞培养物中 caspase-3...

通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡

活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

我们介绍一种简单的方法，利用一种高溶解性的染料LysoTracker，对小鼠胚胎以及分化中的胚胎干细胞（ES细胞）培养物中程序性细胞死亡（PCD）的区域进行可视化观察。...

利用LysoTracker检测胚胎及分化中的胚胎干细胞的程序性细胞死亡

在本视频中，通过TUNEL实验检测样品中凋亡细胞的存在。该研究使用一种特殊的DNA聚合酶——末端脱氧核苷酸转移酶，该酶可催化标记的dUTP添加到断裂DNA的3'末端，随后可在荧光显微镜下观察并识别。...

末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记——TUNEL检测：一种原位检测凋亡细胞中DNA片段化的方法

本视频介绍了一种 体外 用于定量细胞死亡或凋亡的 Caspase-3/7 发光检测试剂盒。该检测通过 Caspase-3/7 对发光型 DEVD 底物的切割作用产生发光信号，所生成的发光强度与 Caspase-3/7...

Caspase-3/7 检测：一种基于发光法的检测技术，通过测定青蛙皮肤外植体中 Caspase-3/7 活性来定量凋亡

某些基因扰动或毒素暴露可能破坏正常的发育过程，导致特定细胞类型的死亡。通过对斑马鱼胚胎进行整体免疫荧光分析活化的Caspase...

通过全胚胎免疫荧光检测活化型 Caspase 3 分析斑马鱼胚胎中的细胞凋亡

降低伊曲康唑浓度和处理时间在治疗两栖动物蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）感染中具有显著疗效

多重检测可为细胞基本机制提供有益信息 并减少试剂浪费和不必要的重复实验。本文介绍一种多重caspase-3/7活性检测方法，采用基于荧光和发光的技术，用于测定细胞活力 体外...

利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法。同时介绍了一种TUNEL标记的半自动化分析方法。...

小鼠骨骼肌中DNA损伤的检测与分析 原位 使用TUNEL法

检测细胞回生现象在技术上具有挑战性 体内 因为经历细胞死亡逆转过程的细胞在形态上可能与正常的健康细胞难以区分。本文介绍了利用我们新开发的方法在活体动物中检测和追踪发生anastasis细胞的实验方案。 体内 CaspaseTracker...

检测细胞复苏 在体 内 通过CaspaseTracker生物传感器

我们描述了一种高通量比色法，用于检测引起恰加斯病的病原体——克氏锥虫（Trypanosoma...

体外药物筛选靶向表达β-半乳糖苷酶的克氏锥虫全生命周期阶段

了解TUNEL组织学染色和Caspase 3/7蛋白分析方法，用于检测蛙类壶菌感染引起的表皮细胞凋亡。该技术可在小组织活检样本上进行重复采样，为野生动物疾病研究提供重要数据。

利用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡

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