Name: 具有量身定做多样性的合成噬菌体展示库的构建 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学习构建具有量身定做多样性的合成噬菌体展示抗体库，用于开发治疗性单克隆抗体。该方法通过噬菌体展示技术筛选高亲和力抗体，无需动物免疫，为诊断和治疗应用提供新途径。

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作者感谢Sidhu实验室的Frederic Fellouse博士对基于Kunkel法的合成Fab噬菌体文库构建提出的宝贵意见。作者感谢Sidhu实验室的Alevtina Pavlenco女士及其他成员在制备高效电转化感受态E. coli细胞和高质量含尿嘧啶单链DNA（dU-ssDNA）过程中提供的帮助。本研究工作得到国家自然科学基金（项目编号：81572698，31771006）对DW的资助，以及上海科技大学（项目编号：F-0301-13-005）对抗体工程实验室的资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

为构建高多样性噬菌体展示Fab文库，需要设置质量控制检查点，以监控文库构建过程中的各个阶段，包括电转感受态细胞的转化能力、dU-ssDNA模板的质量、CCC-dsDNA合成效率、电转化后的滴度、Fab的正确折叠，以及通过Fab噬菌体克隆序列分析评估互补决定区（CDR）的氨基酸多样性。
高产量和高纯度的含尿嘧啶单链DNA（dU-ssDNA）对于实现高突变率至关重要。根据我们的经验，25 °C过夜诱导噬菌体产生的dU-ssDNA量高于37 °C过夜诱导的结果，这与先前的一项报道一致19。关于单链DNA的提取，最初的质粒Spin试剂盒（QIAprep）含有用于噬菌体裂解和结合的MLB缓冲液。此后，MLB因未知原因停产，并被PB缓冲液取代。我们发现，使用PB处理所获得的dU-ssDNA产量显著低于使用MLB处理的结果。在本方案中，我们采用一种名为UT-MLB20的试剂替代MLB，发现其dU-ssDNA产量与最初Spin试剂盒中的MLB相当。
<p class="jove_content"...

单克隆抗体（mAbs）在基础研究、疾病诊断与治疗中具有广泛的应用。截至2016年，美国食品药品监督管理局（USFDA）已批准超过60种单克隆抗体用于自身免疫性疾病、癌症和传染病的临床治疗1,2。
1975年，Kohler 和 Milstein 报道了一种从称为“杂交瘤”的细胞来源持续产生具有单一克隆特异性抗体的技术，该技术随后成为医学和工业领域的基石3,4通过该方法生成单克隆抗体需要多个步骤，包括抗原制备、小鼠免疫、B淋巴细胞提取、B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成永生化杂交瘤细胞、克隆筛选，以及在治疗应用中，为避免人抗小鼠抗体（HAMA）反应，还需进行人源化处理。4,5然而，对于该技术而言，包括毒素、病原体和高度保守蛋白在内的抗原在诱导免疫应答方面相对较弱 在体内 用于单克隆抗体生产的免疫应答5.
1978年，Hutchison 等 报道了使用寡核苷酸定向突变单链噬菌体病毒中某一残基的方法6。1985年，Smith报道了外源基因片段可与编码噬菌体外壳蛋白III的基因进行同框融合，从而在不损害其感染性的前提下展示于噬菌体表面7。这些开创性工作为后续构建免疫型、天然型和合成型的噬菌体展示抗体文库奠定了基础，这些文库以单链可变区片段（scFv）和抗原结合片段（Fab）等形式被用于治疗性单克隆抗体的开发8,9。从技术角度来看，基于噬菌体展示的抗体开发为基于杂交瘤的单克隆抗体开发提供了一种互补方法，有助于克服某些抗原可能带来的限制以及杂交瘤来源抗体通常所需的人源化过程5。截至2016年，已有6种噬菌体展示技术衍生的单克隆抗体获批上市，包括用于治疗类风湿性关节炎最成功的单抗之一Humira，此外还有多种噬菌体展示来源的抗体候选药物正处于临床研究的不同阶段10。
对于免疫型和天然型噬菌体抗体文库，轻链和重链的互补决定区（CDRs）多样性来源于天然免疫组库（即，来自B细胞）。相比之下，合成型噬菌体抗体文库中CDRs的多样性完全是人工设计的。通过合成方法构建文库可精确控制序列多样性的设计，并为抗体结构与功能的机制研究提供机会11,12。此外，合成文库的框架可在文库构建前进行优化，以促进后续大规模的工业开发11,12。
1985年，Kunkel 报道了一种基于单链DNA（ssDNA）模板的诱变方法，可高效地将定点突变引入M13噬菌体13。该方法随后被广泛用于构建噬菌体展示文库。设计用于在Fab互补决定区（CDR）中引入多样性的化学合成DNA寡核苷酸被整合到含有抗体骨架模板的噬粒中。在此过程中，噬粒表达为含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA），寡核苷酸退火至CDR区域，并在T7 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶存在下延伸，合成双链DNA（dsDNA）。最后，生成的dsDNA可通过电穿孔导入Escherichia coli中。
为了获得高多样性，构建噬菌体展示文库时，应谨慎制备电转感受态细胞与共价闭合环状双链DNA（CCC-dsDNA）的双组分混合物的高压电穿孔。Sidhu et al. 对电转感受态细胞和DNA的制备方法进行了改进，相较于传统方法显著提高了文库的多样性14。
本方案描述了一种构建合成噬菌体展示Fab文库的方法，通过单次电穿孔即可获得多样性达109-1010的文库。图1展示了文库构建的整体流程，包括：1）高效电转化感受态细胞的制备；2）含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）的提取；3）基于Kunkel法的寡核苷酸定向诱变；4）电穿孔及文库大小的计算；5）基于蛋白A/L的酶联免疫吸附试验（ELISA）对折叠能力与功能多样性的评估；以及6）多样性的DNA序列分析。所有试剂、菌株和设备均列于材料表中。表1展示了试剂的配置情况。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 二硫苏糖醇</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP 混合液</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td><td>含有 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 25 mM 的溶液。</td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;,5,5&amp;rsquo;四甲基联苯胺（TMB）</td><td>Kirkegaard &amp;amp; Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>羧苄西林，carb</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg/mL，溶于水&amp;nbsp; 0.22 &amp;mu;m 滤器除菌，工作浓度：100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>氯霉素，cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/mL，乙醇中，0.22 &amp;mu;m 滤器除菌，工作浓度：10 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>颗粒状琼脂</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 过氧化物酶底物</td><td>Kirkegaard &amp;amp; Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素，kan</td><td>Fisher</td><td>AC61129</td><td>50 mg/mL，溶于水&amp;nbsp; 0.22 &amp;mu;m 滤器除菌，工作浓度：50 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>! 警告：NaOH 会引起灼伤。</td></tr><tr><td>非脂肪奶粉</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的蛋白A</td><td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin M13 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>重组蛋白L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>四环素，tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>50 mg/mL 水溶液，0.22 &amp;mu;m 滤器除菌，工作浓度：10 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>超纯甘油</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg/mL（乙醇中），工作浓度：0.25 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司 &lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.coli&lt;/em&gt; CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>基因型： &lt;em&gt;dut&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; ung&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;F' cam&lt;sup&gt;r&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;用于制备含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.coli&lt;/em&gt; SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>基因型：[&lt;em&gt;F'proAB+lacIq lacZ&amp;Delta;M15 Tn10 (tet&lt;sup&gt;r&lt;/sup&gt;)&lt;/em&gt;] &lt;em&gt;hsdR mcrB araD139 &amp;Delta;(araABC-leu)7679 &amp;Delta;lacX74 galU galK rpsL thi&lt;/em&gt;适用于高效电穿孔和丝状噬菌体生产的优化条件。</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司 &lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm 间隙电穿孔比色皿</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔2 mL深孔板</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 Maxisorp 免疫板</td><td>Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>带挡板的锥形瓶</td><td>康宁</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>离心瓶</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 电穿孔仪</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher 离心机</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速摇床</td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>96孔和384孔液体处理仪</td><td>RAININ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>RAININ</td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 浓缩器</td><td>默克</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

构建具有定制多样性的合成噬菌体展示fab文库

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

单克隆抗体（mAbs）在基础研究和医学领域的应用需求逐年增长。自1975年首次报道以来，杂交瘤技术一直是单克隆抗体开发的主要方法。作为一种替代技术，噬菌体展示技术在单克隆抗体开发中的吸引力日益增强，自2002年首个噬菌体来源的抗体——修美乐（Humira）获批用于类风湿关节炎的临床治疗以来尤其如此。作为一种非动物源性的单克隆抗体开发技术，噬菌体展示规避了传统杂交瘤技术所必需的抗原免疫原性、人源化以及动物饲养等环节。在本实验方案中，我们描述了一种构建合成型噬菌体展示Fab文库的方法，通过单次电穿孔即可获得多样性达109-1010的文库。该方案包括以下步骤：1）高效电转化感受态细胞的制备；2）含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）的提取；3）基于Kunkel方法的寡核苷酸定向诱变；4）电穿孔及文库规模计算；5）基于蛋白A/L的酶联免疫吸附测定（ELISA）评估蛋白折叠与功能多样性；以及6）多样性DNA序列分析。

按照Fab文库构建的流程图（见图1），我们准备了预先感染M13KO7辅助噬菌体的E. coli SS320电转化感受态细胞。当使用用于文库构建的Fab噬菌粒骨架时，这些电转化感受态细胞的转化效率估计为2 × 109 cfu/µg（图4）。
通过比较在 E. coli CJ236 和 E. coli SS320 细胞中的滴度，检测了尿嘧啶掺入效率。将含有dU-ssDNA的噬菌体感染 E. coli CJ236 和 E. coli SS320 细胞。E. coli SS320 含有可降解含尿嘧啶DNA的酶（dUTPase和尿嘧啶糖基化酶），而 E. coli CJ236 缺乏这些酶，无法降解含...

本方案详细描述了构建具有定制多样性的噬菌体展示合成抗体文库的步骤。合成抗体在基础研究、疾病诊断和治疗中具有广泛的应用。

构建具有定制多样性的合成噬菌体展示Fab文库

单克隆抗体（mAbs）在基础研究和医学领域的应用需求逐年增长。自1975年首次报道以来，杂交瘤技术一直是单克隆抗体开发的主要方法。作为一种替代技术，噬菌体展示技术在单克隆抗体开发中的吸引力日益增强，特别是2002年首个由噬菌体展示技术获得的抗体——阿达木单抗（Humira）获批用于类风湿关节炎的临床治疗后。作为一种非动物源性的单克隆抗体开发技术，噬菌体展示技术规避了传统杂交瘤技术所需的抗原免疫原性、人源化改造以及动物饲养等环节。本实验方案描述了一种构建合成型噬菌体展示Fab文库的方法，通过单次电转化即可获得多样性达10⁹–10¹⁰的文库。该方案包括：1）高效电转化感受态细胞的制备；2）含尿嘧啶的单链DNA（dU-ssDNA）的提取；3）基于Kunkel方法的寡核苷酸定向诱变；4）电转化及文库规模计算；5）基于蛋白A/L的酶联免疫吸附测定（ELISA）评估蛋白折叠能力与功能多样性；以及6）多样性DNA序列分析。

本实验的总体目标是为读者提供构建具有定制多样性的噬菌体展示合成人源抗体文库的详细实操经验。合成型噬菌体展示抗体文库具有巨大潜力，可通过避免动物免疫及后续抗体人源化过程，取代传统的杂交瘤技术用于治疗性单克隆抗体的开发。合成抗体文库的优势在于，可基于对支持高亲和力结合及理想蛋白特性的位点多样性认识，将定制化的多样性引入抗体骨架中。除了实际应用价值之外，合成抗体文库还可用于实验性探究特定氨基酸在生物分子相互作用中的作用，从而支持其自身的持续优化。本实验操作将由本实验室的研究生Zhenwei Zhong和博士Shin-chen Hou进行演示。接下来是

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

具有量身定做多样性的合成噬菌体展示库的构建

在本视频中，我们演示了噬菌体展示技术，用于分离表达对目标蛋白具有高亲和力蛋白的预先改造噬菌体。...

利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。...

使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

新一代无细胞转录-翻译平台已被设计用于构建生化系统 体外 通过基因回路的执行。在本文中，我们描述了如何利用全基因组合成方法，从其基因组合成噬菌体，如MS2、ΦΧ174和T7 E. coli...

合成具有感染性的噬菌体 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统

本文所述方案可用于构建、表征和筛选（针对特定目标）来源于任意DNA样本的“"结构域组"文库。该流程通过整合多种技术实现：噬菌体展示技术、折叠报告系统、高通量测序以及用于数据分析的网络工具。...

相互作用组测序：通过噬菌体展示与下一代测序进行结构域组文库构建、验证与筛选的实验方案

构建具有理想亲和力和特异性的、可被任意给定小分子配体化学诱导的蛋白质二聚化系统，在生物学检测与调控方面具有广泛的应用前景。本文中，我们描述了一种高效且可推广的从头设计化学诱导二聚化系统的方法，该方法通过逐步筛选噬菌体展示的组合型单域抗体文库来实现。...

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。...

利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

一种用于鉴定优先级细菌病原体的简单方法是使用基因工程改造的报告噬菌体。这些报告噬菌体对其特定宿主菌种具有专一性，能够迅速将生物发光信号转导至宿主细胞。本文描述了利用报告噬菌体检测Yersinia...

用于检测A类细菌病原体的“生物发光”报告噬菌体

本方案提供了一种利用自动荧光延时显微镜随时间监测不同细菌单细胞行为的逐步操作流程。此外，我们还提供了显微镜图像分析的指导方法。...

活细胞成像 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 使用自动延时显微镜技术

我们描述了一种从环境病毒群落中有效分离单链DNA、双链DNA和RNA分子的方法。该方法利用含磷酸盐缓冲液浓度递增的羟基磷灰石色谱对核酸进行分级分离。此方法可实现从环境样品中分离出所有类型的病毒核酸。...

利用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA

学习构建具有量身定做多样性的合成噬菌体展示抗体库，用于开发治疗性单克隆抗体。该方法通过噬菌体展示技术筛选高亲和力抗体，无需动物免疫，为诊断和治疗应用提供新途径。

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