Name: 原发性肾组织段的显微解剖与新型无支架结构技术的结合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学习显微解剖技术分离小鼠肾脏皮质髓质段，获取具有完整肾组织结构的原代组织片段用于组织工程研究。该方法可维持组织活性并改善肾功能，为终末期肾病治疗提供新思路。

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美国国立卫生研究院机构博士后培训基金，NIH-HL-007260

以下所述的所有动物手术操作均在南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后方可实施，且仅在获得批准后才进行动物手术或使用任何动物组织。
1. 小鼠肾切除术
<ol>
	<li>佩戴外科口罩和无菌帽，以最大限度降低污染风险。在设置过程中保持无菌状态&#160;手术区域
	<ol>
		<li>在手术台上铺放非孔型手术单。</li>
		<li>将已灭菌的器械包打开，放置于无菌手术单上。肾切除术所需的器械包括3把小型止血钳、带齿精细镊子、无齿精细镊子和直型虹膜剪。</li>
		<li>在手术台中央放置另一块无孔手术单。</li>
		<li>在15 mL无菌锥形管中配制5 mL含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），并添加1%青霉素/链霉素。将该溶液置于冰上，放置于手术台旁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从动物饲养中心获取一只8至12周龄的C57BL/6小鼠（雄性或雌性）。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉诱导室，使用3.5%吸入式异氟烷进行诱导。随后为小鼠佩戴鼻罩，以2%异氟烷维持麻醉。
	<ol>
		<li>在整个手术过程中，通过评估足部反射（用力捏压脚趾）定期监测麻醉深度是否足够。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用脱毛膏去除腹部躯干区域的所有毛发。用蒸馏水冲洗该区域，确保腹部所有毛发均已清除。</li>
	<li>将小鼠置于无菌手术台上，仰卧于上方非开孔洞巾下。剪取一块 2 x 2 cm2 在覆盖小鼠腹部的手术巾上开一个小窗。</li>
	<li>使用无菌纱布或棉球将聚维酮碘涂抹于腹部，随后使用70%乙醇。</li>
	<li>使用带齿精细镊子和虹膜剪，在3 - 4处进行操作&#160;沿腹正中线左侧0.5 cm处作一与正中线平行的垂直腹部皮肤切口 
	注意： 若需摘除右肾，则切口位于中线右侧0.5 cm处。
	<ol>
		<li>用无齿精细镊子夹住腹膜，用虹膜剪刀剪开以进入腹腔。用止血钳夹住皮肤和腹膜的上下侧缘，向侧方施加张力以增强暴露。</li>
		<li>将肠内容物轻柔地移至腹腔右侧，以暴露左肾。轻柔牵拉肾脏，使其从腹腔中抬出。</li>
		<li>用止血钳夹住左肾肾门处，使用虹膜剪剪断输尿管及肾血管。</li>
		<li>将左肾置于含1%青霉素/链霉素的DPBS溶液中，冰上保存。</li>
		<li>将装有肾脏的离心管转移至无菌组织培养操作台。将肾脏从15 mL锥形离心管转移至60 mm培养皿中（图1）。用5 mL含钙和镁的DPBS冲洗两次。将肾脏悬浮于5 mL DPBS中，置于60 mm培养皿内。
		<ol>
			<li>另准备一个60 mm培养皿，加入5 mL DPBS，用于显微解剖步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据批准的IACUC动物实验方案，在获取肾脏后通过开胸术和放血法处死小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于肾段分离的小鼠肾脏显微解剖
<ol>
	<li>在此部分操作中继续采用无菌技术，包括佩戴无菌手套、外科口罩和无菌帽，以尽量降低污染风险。
	<ol>
		<li>在体视显微镜平台及其左右两侧区域铺设无菌敷料，以形成器械的无菌区域。在显微镜调焦旋钮上覆盖塑料粘性保护膜，并喷洒70%乙醇。打开双管蛇形灯，照亮载物台。</li>
		<li>打开无菌器械包（无齿精细镊子、手术刀柄、#15 手术刀片、两把直止血钳、两根 30½ 号空心针），置于无菌巾上。立即将 #15 刀片安装至手术刀柄，并将每根针的针座/针 hub 与一把止血钳连接，制备成针状解剖器械以供后续使用，如图所示 图1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分别装有肾脏组织的DPBS和仅含DPBS的60毫米培养皿从组织培养操作台转移至显微镜区域。
	<ol>
		<li>将60 mm培养皿置于物镜下，打开皿盖以暴露肾脏。将盛有DPBS的培养皿放置于无菌区域一侧，以备后续使用。</li>
		<li>移动培养皿，使仅观察到肾脏的前表面或后表面即将肾脏较大的扁平面朝下，另一面接触培养皿底部。此步骤中将放大倍数调至3.2–4倍。用非优势手持无齿精细镊子，从肾脏的下极和上极附近刺入并将其固定在培养皿上。</li>
		<li>用非优势手固定肾脏。用优势手持15号刀片，去除暴露表面透明的纤维囊层。从肾脏暴露表面最表层削去约0.5 mm，以彻底去除残留的囊膜。</li>
		<li>使用#15刀片从去囊区域切下一倒置的锥形组织，大小约为2 mm3 大小。取出仅含有DPBS的60-mm培养皿，将组织块放入干净的培养皿中。弃去肾脏的剩余部分。</li>
		<li>将放大倍数降低至1.5–2.0倍，用于后续解剖操作。使用两把止血钳-针头器械作为切割工具，将组织碎片逐步切割成更小的片段，直至组织片段的尺寸小于或等于针尖的直径。肾组织2 mm3 大小将产生超过50个节段，完全解剖后。</li>
		<li>将含有肾组织段的60 mm培养皿转移至组织培养操作台。用1000 µL移液器吸除DPBS。加入5 mL DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。</li>
		<li>在37 °C培养箱中培养3天，或立即植入细胞构建物中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肾段细胞结构的构建
<ol>
	<li>培养正常人真皮成纤维细胞（NHDF）和人脂肪微血管内皮细胞（HAMEC）数周，以获得每构建体所需的 7.2 × 105 个成纤维细胞和 1.8 × 105 个内皮细胞。在组织培养罩内，将成纤维细胞与内皮细胞按适当比例（4:1）接种至琼脂糖模具中的棒状孔中，以形成无支架的前血管内皮-成纤维细胞构建体（SPEC），具体方法如 Czajka et al19 之前所述。</li>
	<li>准备无菌止血钳、30½ G 针头以及一端为平头的无菌刮铲。
	<ol>
		<li>从含有肾段的 60 mm 培养皿中移除大部分培养基，注意避免吸除肾段。</li>
		<li>佩戴手术放大镜以辅助观察肾段的植入过程。</li>
		<li>用刮铲末端轻轻刮取 60 mm 培养皿底部，获取 10–15 个肾段，并均匀分布于刮铲尖端。将刮铲尖端尽可能靠近已接种 SPEC 的孔边缘放置。</li>
		<li>用另一只手持止血钳-30½ G 针头装置，将每个肾段从刮铲尖端转移至孔边缘。用针头轻柔地将每个肾段推入孔中，直至其略微浸入先前接种的细胞悬液中。</li>
		<li>在 FGM-2/EGM-2/DMEM 培养基（2:1:1 比例，总体积 2.5 mL）中培养肾段-SPEC 构建体。每 24 小时更换一次培养基，持续 3 天。在 72 小时后将构建体从模具中取出，并进行固定或速冻处理以备后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

用于构建活体肾组织结构的方法在所使用的细胞类型和生物材料方面存在广泛差异，且许多方法在文献中已过时或表征不充分7。尽管目前有许多研究采用干细胞策略或将肾脏结构的各个组分单独重建，但从细胞悬液出发人工重建一个包含超过26种不同分化细胞类型的完整器官，这一设想仍极具挑战性21。这可能是为何其他研究转向采用肾组织片段进行组织工程应用的原因。如上所述，先前已有将肾组织片段分离后接种于PGA支架上的研究报道16。然而，该研究中描述的组织片段分离方法细节极少，且未对分离后的片段进行任何时长的培养以评估其活性。本文所述方法结合细胞活性检测显示，至少在72小时时间点，肾组织片段的部分区域仍维持着活性，此结果此前尚未见报道。此外，该方法具有可产生尺寸相对可预测的组织片段的优势。同时，这些方法为改善衰竭肾功能提供了具有临床转化潜力的途径，主要体现为一种可行的技术方案——从原本将被丢弃的器官中分离出原代肾组织片段。
在方法开发过程中，最大的挑战首先是找到合适尺寸...

慢性肾脏病（CKD）是当前全球主要的公共卫生挑战之一1。在美国，CKD 的患病率超过总人口的14%，其中超过60万名美国人患有最严重的形式——终末期肾病（ESRD）2。目前针对 ESRD 患者的治疗选择包括透析和肾移植。尽管每年约有2.5万名患者接受肾移植手术，但每年新增等待移植的患者数量巨大，导致等待救命器官的患者与实际接受移植的患者之间存在显著差距3。透析不仅对寿命和生活质量产生严重的负面影响，还伴随着惊人的经济负担。2014年，美国医疗保险为 ESRD 患者支付的索赔总额超过300亿美元2。由于器官供应有限，且需要透析的患者数量未见明显下降趋势，因此寻找透析和移植替代方案的研究显得尤为重要。即使能够相对短暂地延缓透析的开始时间，也能显著增加患者的生命质量调整年数和生产力，同时推迟与透析相关的费用支出4,5,6。
目前，组织工程与再生医学实验室正在研究针对功能性组织缺损（如终末期肾病中的情况）的各种解决方案，研究方法多种多样，包括基于支架的类器官构建，以及利用脱细胞器官结构进行细胞植入的全器官工程等7,8,9,10,11。然而，利用边缘性或废弃肾脏重建复杂肾结构的研究尚处于初步阶段。事实上，约有20%的移植用获取肾脏因各种原因被废弃12,13。这些潜在移植物中的功能性肾组织可被加以利用，并整合到一个或多个组织工程构建体中。先前的研究已证明使用这些废弃器官的可行性，例如将肾脏用于获取细胞外基质以服务于组织工程目的14,15。然而，极少有研究将健康肾脏中的原代肾单位组织用于组织工程目的16,17,18。
Kim 等此前描述的一种方法涉及从健康大鼠肾脏中分离&#34;肾段&#34;，随后将其接种于聚乙醇酸（PGA）支架上以构建组织工程结构16。然而，该方法未详细说明具体的解剖操作步骤，且肾段是通过精细剪碎结合过滤的方式获得。本文介绍对该方案的一项改进，同样可获得具有完整肾元结构的离散肾段，但改用显微解剖技术。该操作在活体成年小鼠上进行肾切除术，随后将肾脏转移至解剖显微镜下，去除肾包膜并进一步解剖组织。使用小口径30½ G针头作为切割工具，同时也作为解剖过程中的辅助引导，因为针头直径与目标肾段直径一致。所分离的（本例为小鼠）肾段在体外培养中保持活性，并可与无支架的内皮-成纤维细胞复合结构整合19。此类复合结构此前已被用于其他器官的组织工程构建，包括生物人工胰腺20。

<table><tbody><tr><td>无孔无菌巾</td><td>Busse Hospital Disposables</td><td>696</td><td></td></tr><tr><td>带孔无菌巾</td><td>Busse Hospital Disposables</td><td>697</td><td></td></tr><tr><td>Halsted 蚊式止血钳，5个弯曲</td><td>Miltex</td><td>Mil-7-4</td><td>&quot;在文稿中称为“Hemostat”&quot;</td></tr><tr><td>超精细带齿Graefe镊，弯曲型</td><td>Fine Science Tools</td><td>11155-10</td><td>带齿精细镊</td></tr><tr><td>超精细Graefe镊，锯齿状（无齿）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>无齿精细镊</td></tr><tr><td>精细剪刀——碳化钨材质</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>虹膜剪刀</td></tr><tr><td>含泵碘伏外科洗手液，聚维酮碘 7.5%</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉纱布垫（4&quot; × 4&quot;）</td><td>Fisher Healthcare</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液，100倍浓缩</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP标准</td><td>制造商：Piramal，经销商：McKesson</td><td>2254845</td><td></td></tr><tr><td>Nair脱毛剂</td><td>Nair</td><td>22600-23307</td><td>文中称为脱毛乳膏</td></tr><tr><td>200 proof乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705</td><td>稀释为70%乙醇溶液</td></tr><tr><td>BioLite 60 mm细胞培养皿</td><td>Themo-Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>Press'n Seal保鲜膜</td><td>Glad</td><td>12587-70441</td><td>用于体视显微镜</td></tr><tr><td>SZX16体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>光纤照明器</td><td>Cole Parmer</td><td>41720-20</td><td></td></tr><tr><td>自支撑双光源导光管，23&quot;长鹅颈管</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-41720-60</td><td></td></tr><tr><td>3号手术刀柄</td><td>Miltex</td><td>Mil-4-7</td><td></td></tr><tr><td>无菌肋背碳素钢刀片，刀片尺寸15</td><td>Bard-Parker</td><td>371115</td><td></td></tr><tr><td>31½号针头</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826F</td><td>Becton Dickinson 305106</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（100%）</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FS-0500-AD</td><td></td></tr><tr><td>正常人真皮成纤维细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>人脂肪微血管内皮细胞</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>7200</td><td></td></tr><tr><td>外科手术放大镜（2.5倍）</td><td>Orascoptic</td><td>(N/A) 定制订单</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2（成纤维细胞基础培养基，添加FGM-2 SingleQuots）</td><td>Lonza</td><td>CC-3131, CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2（内皮细胞基础培养基，添加EGM-2 SingleQuots）</td><td>Lonza</td><td>CC-3156, CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>哺乳动物细胞活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白-18抗体</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 633标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 546标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>抗血管性血友病因子抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素偶联物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>BD Pharmingen</td><td>561908</td><td></td></tr><tr><td>背景抑制剂（Background Buster）</td><td>Innovex Biosciences</td><td>NB306</td><td></td></tr></tbody></table>

原发性肾组织节段的显微解剖及其与新型无支架构建技术的整合

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

目前，肾移植已成为终末期肾病的主流治疗方法。然而，等待移植的患者约有96,000人，其中仅有四分之一能够成功接受移植，因此迫切需要为器官功能衰竭患者提供替代治疗方案。为了减少透析带来的有害后果及其引发的整体医疗成本，目前正积极开展研究，以寻找器官移植以外的替代方案。可植入的组织工程化肾细胞结构便是替代丧失肾功能的一种可行方法。本文首次描述了从小鼠肾脏中进行显微解剖以分离存活的皮髓质肾段的方法。这些肾段能够快速整合到无支架的内皮细胞-成纤维细胞结构中，从而在植入后迅速与宿主血管系统建立连接。成年小鼠的肾脏取自活体供体，随后在体视显微镜下进行显微解剖，获取直径为200–300 µm的肾段。仅需一个肾脏所获取的原代肾段即可构建多个肾组织结构。该方法展示了一种可能从原本会被废弃的器官中挽救功能性肾组织的技术路径。

本方案可从每块锥形的2 mm3肾组织样本中获得约50段肾组织片段。经处理和成像的肾组织片段中，肾小管和肾小球成分的比例各不相同（见图2）。完整组织片段被用于活力检测，以在三天内每隔24小时评估各片段的活性。绿色荧光的钙黄绿素-AM（calcein-AM）在具有细胞内酯酶活性时存在，提示细胞存活；红色荧光的溴化乙锭同型二聚体-1（ethidium homodimer-1）则在细胞质膜完整性丧失时出现。尽管这些组织片段为完整的三维结构，但通过共聚焦显微镜可明显观察到检测试剂的有效渗透（见图3）。
通过相同的细胞活力检测进一步表征了各片段的尺寸均一性。将片段置于带有凹槽的载玻片上，并在无任何机械外力作用于片段任一维度的情况下加盖盖玻片。片段自由悬浮，在加入细胞活力/毒性检测试剂30分钟后进行成像。采用10 µm步长对整...

组织工程化肾脏结构为解决器官短缺及透析带来的有害影响提供了一种方案。本文描述了一种从小鼠肾脏中显微解剖分离皮质-髓质节段的实验方案。这些节段被植入无支架的细胞结构中，形成肾脏类器官。

肾移植现已成为终末期肾病的主流治疗手段。然而，目前约有96,000人正在等待移植名单上，而每年仅能实施……

本显微解剖操作的总体目标是从活体肾脏组织中分离出具有完整肾组织结构的特定节段，用于组织工程应用。该方法有助于回答组织工程领域的一些关键问题，例如：能否以无菌方式获取完整的原代器官组织节段，并在体外培养中维持其存活？该技术的主要优势在于所获得的组织节段保留了完整的肾组织结构，而不同于使用细胞系来重建包含超过26种不同类型细胞的复杂器官。该技术的应用前景涉及终末期肾病的治疗，因为这些结构可改善滤过功能，并可能帮助患者摆脱透析。手术过程中，应穿戴合适的手术装备，包括口罩和手术帽，以最大限度降低污染风险。同样，应尽一切努力全程保持无菌状态。开始准备时，先铺好手术台无菌单。接着，将已高压灭菌的器械包打开，放置于无菌单上。器械必须包括三把小止血钳、带齿精细镊子、无齿精细镊子以及直型虹膜剪。用第二块无孔手术单覆盖手术台中央区域。在手术室准备开始前，配制50毫升添加抗生素的DBPS，并将五毫升分装至15毫升离心管中。随后对一只8至12周龄的C57 black six小鼠实施麻醉，并通过用力捏压脚趾以评估其足底反射，定期监测麻醉深度。接下来，使用脱毛膏去除小鼠腹侧躯干区域的所有毛发，并用蒸馏水冲洗掉脱毛膏和残留毛发。然后将小鼠转移至手术台，仰卧置于无开孔的手术巾下。现在，在小鼠腹部对应的手术巾上剪出一个2厘米见方的开口。然后用聚维酮碘擦洗暴露的皮肤，再用70%乙醇重复处理三次，以对皮肤进行消毒并完成手术前准备。使用带齿精细镊子和虹膜剪开始手术，在腹中线左侧0.5厘米处，沿与腹中线平行的方向做一道3至4厘米长的皮肤切口。接下来，使用无齿精细镊子夹住腹膜，并用虹膜剪剪开以进入腹腔。然后在皮肤和腹膜的上下侧缘施加止血钳，向侧方牵拉以增加张力，从而改善暴露。现在轻柔地将肠内容物移至腹部右侧，以暴露左肾。然后轻轻牵拉肾脏，将其从腹腔中抬起。接着用止血钳夹住肾脏的肾门部位，并用虹膜剪剪断输尿管和肾血管。随后将肾脏转移至含有1%青链霉素的冰上预冷的DBPS管中。将此离心管转移至无菌培养罩中进行处理。在此将肾脏转移至一个60毫米的培养皿中，并用含有钙和镁的新鲜5毫升DPBS冲洗两次。第二次洗涤后，将肾脏悬浮于新的60毫米培养皿中含5毫升新鲜DBPS的溶液中。然后准备一个额外的培养皿，其中仅含五毫升 DBPS，以备后续使用。继续采用无菌技术，包括佩戴无菌手套、外科口罩和无菌帽，以尽量降低污染风险。随后将解剖台区域及体视显微镜周围区域用无菌布覆盖。接下来，将塑料粘性垫片贴在显微镜的调焦旋钮上，并用70%乙醇喷洒。然后打开双臂可调光源，照亮操作台面。接着在无菌铺巾上打开一包已灭菌的器械，内含无齿精细镊子、手术刀柄、15号手术刀片、两把直型止血钳以及两根30.5号空心针头。将15号刀片安装到手术刀柄上，并将止血钳分别连接到每个针头适配器接头上，以制备针头解剖器械。随后将两个培养皿转移至显微镜区域，其

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

原发性肾组织段的显微解剖与新型无支架结构技术的结合

本方案描述了通过血管顺行灌注去污剂对 Sprague Dawley...

上皮细胞重植及啮齿类动物肾脏组织发育用细胞外基质支架的制备

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激光显微切割技术在揭示人类肾组织区域转录组学中的应用

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单层及三维条件下人肾小管上皮细胞原代培养体系的建立

我们提出了一种优化的方案，用于处理完整的人类肾脏，以分离和培养原代肾近端小管上皮细胞，并将这些细胞应用于一种三维微流控微生理系统平台，以模拟肾近端小管的功能。...

分离原代人近端小管上皮细胞及其在构建肾脏近端小管微生理模型中的应用

学习显微解剖技术分离小鼠肾脏皮质髓质段，获取具有完整肾组织结构的原代组织片段用于组织工程研究。该方法可维持组织活性并改善肾功能，为终末期肾病治疗提供新思路。

原发性肾组织节段的显微解剖及其与新型无支架构建技术的整合

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