原发性肾组织节段的显微解剖及其与新型无支架构建技术的整合

本显微解剖操作的总体目标是从活体肾脏组织中分离出具有完整肾组织结构的特定节段，用于组织工程应用。该方法有助于回答组织工程领域的一些关键问题，例如：能否以无菌方式获取完整的原代器官组织节段，并在体外培养中维持其存活？该技术的主要优势在于所获得的组织节段保留了完整的肾组织结构，而不同于使用细胞系来重建包含超过26种不同类型细胞的复杂器官。

该技术的应用前景涉及终末期肾病的治疗，因为这些结构可改善滤过功能，并可能帮助患者摆脱透析。手术过程中，应穿戴合适的手术装备，包括口罩和手术帽，以最大限度降低污染风险。同样，应尽一切努力全程保持无菌状态。

开始准备时，先铺好手术台无菌单。接着，将已高压灭菌的器械包打开，放置于无菌单上。器械必须包括三把小止血钳、带齿精细镊子、无齿精细镊子以及直型虹膜剪。

用第二块无孔手术单覆盖手术台中央区域。在手术室准备开始前，配制50毫升添加抗生素的DBPS，并将五毫升分装至15毫升离心管中。随后对一只8至12周龄的C57 black six小鼠实施麻醉，并通过用力捏压脚趾以评估其足底反射，定期监测麻醉深度。

接下来，使用脱毛膏去除小鼠腹侧躯干区域的所有毛发，并用蒸馏水冲洗掉脱毛膏和残留毛发。然后将小鼠转移至手术台，仰卧置于无开孔的手术巾下。现在，在小鼠腹部对应的手术巾上剪出一个2厘米见方的开口。

然后用聚维酮碘擦洗暴露的皮肤，再用70%乙醇重复处理三次，以对皮肤进行消毒并完成手术前准备。使用带齿精细镊子和虹膜剪开始手术，在腹中线左侧0.5厘米处，沿与腹中线平行的方向做一道3至4厘米长的皮肤切口。

接下来，使用无齿精细镊子夹住腹膜，并用虹膜剪剪开以进入腹腔。然后在皮肤和腹膜的上下侧缘施加止血钳，向侧方牵拉以增加张力，从而改善暴露。现在轻柔地将肠内容物移至腹部右侧，以暴露左肾。

然后轻轻牵拉肾脏，将其从腹腔中抬起。接着用止血钳夹住肾脏的肾门部位，并用虹膜剪剪断输尿管和肾血管。随后将肾脏转移至含有1%青链霉素的冰上预冷的DBPS管中。

将此离心管转移至无菌培养罩中进行处理。在此将肾脏转移至一个60毫米的培养皿中，并用含有钙和镁的新鲜5毫升DPBS冲洗两次。第二次洗涤后，将肾脏悬浮于新的60毫米培养皿中含5毫升新鲜DBPS的溶液中。

然后准备一个额外的培养皿，其中仅含五毫升 DBPS，以备后续使用。继续采用无菌技术，包括佩戴无菌手套、外科口罩和无菌帽，以尽量降低污染风险。随后将解剖台区域及体视显微镜周围区域用无菌布覆盖。

接下来，将塑料粘性垫片贴在显微镜的调焦旋钮上，并用70%乙醇喷洒。然后打开双臂可调光源，照亮操作台面。接着在无菌铺巾上打开一包已灭菌的器械，内含无齿精细镊子、手术刀柄、15号手术刀片、两把直型止血钳以及两根30.5号空心针头。

将15号刀片安装到手术刀柄上，并将止血钳分别连接到每个针头适配器接头上，以制备针头解剖器械。随后将两个培养皿转移至显微镜区域，其中一个培养皿含有置于DPBS中的肾脏，另一个仅含有DPBS。取下肾脏培养皿的盖子，在3.2至4倍放大倍数下，将显微镜焦点对准肾脏的前表面或后表面。

接下来，用非优势手使用无齿精细镊子刺穿肾脏并将其固定在培养皿上，固定位置为肾脏的上下极。然后，用优势手持15号刀片，从暴露的表面去除透明的纤维囊层。从肾脏暴露表面最表层削去约0.5毫米，以彻底清除残留的包膜。

继续使用15号刀片从去囊区域解剖出一块约两平方毫米的倒金字塔形组织。然后将组织转移至盛有DBPS的洁净培养皿中，并弃去肾脏的剩余部分。现在将注意力集中于解剖得到的组织，并将放大倍数降低至1.5至2.0倍。

使用两把止血钳针状器械作为切割工具，将组织碎片逐步切割成更小的片段，直至组织片段的大小与针尖相当或更小。应制备约50个组织片段。此步骤是该操作的关键环节。

每个组织片段的直径需尽量接近30-1/2号针头尖端，以避免过大的片段阻碍扩散。将组织放回组织培养操作台，使用P1000移液器移除DPBS。然后加入5 mm的DMEM，培养基中需添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。

然后立即在体外培养该组织，或将其植入细胞构建物中。通过活力检测方法，对上述步骤所获得的完整肾组织片段在培养三天内的活力进行了检测。绿色荧光钙染料AM的存在表明细胞内酯酶活性，提示细胞具有活性。

红色荧光的碘化丙啶同源二聚体-1（ethidium homodimer-1）出现表明细胞质膜完整性丧失。当肾节段被包埋于无支架的内皮成纤维细胞构建物中时，至第3天已与细胞构建物整合，形成完整的结构。通过血管性血友病因子（von Willebrand factor）标记可见，这些构建物维持了原有的前血管内皮网络。

肾上皮细胞呈绿色，由细胞角蛋白-18标记可见。为检测体外肾脏功能，将构建物与FITC标记的白蛋白共同孵育。尽管在嵌入的肾组织片段以外区域检测到残留的白蛋白，但在肾小管上皮细胞中也观察到明显的信号热点。

这些热点是经管腔穿行的白蛋白，被认为代表了肾小管节段细胞结构对白蛋白的重吸收。观看本视频后，您应能够充分理解如何从小鼠肾脏中分离肾小管节段，用于组织工程应用。一旦掌握，该操作可在1至1.5小时内完成。

完成此操作后，还可进行其他方法，例如接种含细胞的构建物，以回答有关肾组织构建与表征的其他问题。请注意，使用手术器械和加压氧气瓶可能具有极高危险性。操作尖锐物品时务必小心，并记得将氧气罐固定在实验台面上。