Name: 重组胶原蛋白 i. 肽载体在生物反应器中的应用及其作为细胞传递系统的潜力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 了解利用大孔微载体在灌流生物反应器中扩增细胞的方法，无需收获步骤即可将细胞递送至缺损部位。该技术为组织工程和再生医学中的细胞递送提供了生物相容性解决方案。

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本研究工作获得欧盟第七框架计划 FP7/2007-2013 资助，资助协议编号为 n° 607051（BIO-INSPIRE）。我们感谢 Fujifilm Manufacturing Europe B.V. 的 Carolien van Spreuwel-Goossens 在 RCP 制备过程中提供的技术支持，以及弗劳恩霍夫硅酸盐研究所 ISC 的 Werner Stracke 在 SEM 分析方面提供的帮助。

骨关节炎患者在接受股骨头置换手术时，从其股骨头中分离出人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）。该操作经维尔茨堡大学当地伦理委员会批准，并获得患者的知情同意。原代微血管内皮细胞从青少年供体的包皮活检组织中分离获得，其法定监护人已书面签署完全知情同意书。本研究已获得维尔茨堡大学当地伦理委员会批准（投票编号182/10）。
1. hBMSCs 和 HDMECs 的分离
<ol>
	<li>人骨髓来源的间充质基质细胞（hBMSCs）
	<ol>
		<li>使用无菌勺子从股骨头中去除松质骨。 
		注意：松质骨位于坚硬致密的皮质骨内部，呈疏松颗粒状物质。必要时可使用手术刀从皮质骨上刮取部分松质骨。</li>
		<li>将取出的松质骨放入两个50 mL离心管中。松质骨体积根据髋关节置换手术中取出的股骨头大小而定，通常为5至10 mL。</li>
		<li>用DMEM-F12（DMEM与Ham F12培养基1:1混合）洗涤，每管加入约30 mL培养基。</li>
		<li>手动沿纵向轻轻振荡离心管5秒，使脂肪细胞从松质骨中释放。在300 × g、22 °C条件下离心5分钟。</li>
		<li>使用带刻度的塑料移液管吸除上层脂肪细胞层及约20 mL剩余上清液，保留足够液体以覆盖松质骨。</li>
		<li>向离心管中加入10 mL DMEM-F12培养基，用手剧烈沿纵向振荡10–15秒，使细胞释放。</li>
		<li>使用带刻度的塑料移液管将10–15 mL细胞悬液从离心管转移至新的50 mL离心管中。</li>
		<li>重复步骤1.1.6共2–3次，合并所得细胞悬液，直至50 mL离心管中的松质骨变为白色。</li>
		<li>使用带刻度的塑料移液管将细胞悬液转移至两个新离心管中，避免吸取沉积在50 mL离心管底部的胶原沉淀物。</li>
		<li>将细胞悬液在300 × g、22 °C条件下离心5分钟。使用带刻度的塑料移液管吸弃上清液。</li>
		<li>在第三个离心管中加入40 mL DMEM-F12培养基，含10% FCS、1%青霉素-链霉素和50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸。向每个含有细胞沉淀的离心管中转移5 mL该培养基。通过剧烈轻弹离心管底部重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液转移至仅含培养基的离心管中。</li>
		<li>可选：取100 µL细胞悬液进行细胞计数，先用PBS按1:100稀释，再用台盼蓝按1:10稀释，即取15 µL第一次稀释液加入15 µL DPBS和30 µL台盼蓝，使DPBS与台盼蓝比例为1:1。使用标准血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。</li>
		<li>按109个细胞/175 cm2 T型培养瓶接种于25 mL培养基中，如步骤1.1.11所述。或者，在不进行细胞计数的情况下，将全部细胞悬液分装至最多十个175 cm2细胞培养瓶中。在此阶段，hBMSCs无法与红细胞区分，后者数量远多于前者。hBMSCs将在接种后前7天内表现为稀疏的克隆集落（每瓶1–2个）。</li>
		<li>接种后第4天更换培养基，以促进血细胞与hBMSCs的相互作用。首次换液后，每2–3天更换一次培养基。换液时，使用带刻度的塑料移液管完全移除旧培养基，用DPBS洗涤两次（每次向贴壁细胞中加入10 mL DPBS，再用带刻度的塑料移液管完全吸除），然后加入20 mL新鲜培养基，操作如步骤1.1.11所述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）
	<ol>
		<li>按照先前发表的方案21处理皮肤活检组织并分离HDMECs。简言之，将真皮与表皮分离后，将真皮组织在胰蛋白酶中37 °C、5% CO2条件下孵育40分钟。孵育结束后，将真皮转移至含有培养基的培养皿中，并用手术刀刮取组织。将获得的细胞悬液转移至50 mL塑料离心管中，在300 × g、22 °C条件下离心5分钟。使用Neubauer计数室对细胞悬液进行计数，并以1.2 × 104个细胞/cm2的密度接种。每隔一天完全更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 旋转瓶、RCP 微载体和生物反应器的设置与灭菌
<ol>
	<li>旋转烧瓶和 RCP 微载体
	<ol>
		<li>实验前一天，安装旋转烧瓶并准备高压灭菌。 
		注意：旋转烧瓶的瓶盖应保持松动，尽可能以直立位置进行高压灭菌。
		<ol>
			<li>用铝箔分别包裹旋转烧瓶的侧盖，以避免在拆包过程中污染。为减少灭菌后的污染风险，将烧瓶用 1 - 2 层铝箔包裹后进行高压灭菌。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 20 mL DPBS 中称取所需量的 RCP 大孔微载体。 
		注意：每个旋转烧瓶需要 30 mg。在高压灭菌（121 °C，15 分钟）前，让其水化至少 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注生物反应器
	<ol>
		<li>使用所述的生物反应器系统来制备血管化组织类似物20。该生物反应器由一个放置生物基质的容器、一个培养基储液罐和一个压力瓶组成。
		<ol>
			<li>通过硅胶管将容器与培养基储液罐和压力瓶连接（见 图 3C）。瓶盖保持松动，将其放入高压灭菌塑料袋中，密封好，再放入第二个高压灭菌塑料袋中。进行高压灭菌。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在RCP大孔微载体上培养hBMSCs和HDMECs
注意：用于接种 RCP 微载体的人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）通过慢病毒转导标记了红色荧光蛋白（RFP）。本方案在先前发表的方案5基础上进行了修改。
<ol>
	<li>让RCP大孔微载体沉降至底部，用10 mL培养基洗涤，重复3次。</li>
	<li>用10 mL培养基洗涤旋瓶。</li>
	<li>每个旋瓶中加入30 mg RCP大孔微载体（溶于8 mL培养基中）。在接种细胞前，将含RCP微载体的旋瓶置于37 °C、5% CO2条件下平衡30分钟。 
	注意：此用量基于灭菌前RCP微载体的近似干重。</li>
	<li>每个旋瓶中接种5 × 105个hBMSCs或HDMECs（第3代），接种体积为2 mL培养基。</li>
	<li>将旋瓶置于搅拌板上，以90 rpm搅拌5分钟，随后静置55分钟，于37 °C、5% CO2条件下进行1小时的静态/动态交替孵育。重复4次。</li>
	<li>每个旋瓶中加入10 mL细胞培养基，然后开始以95 rpm持续搅拌，于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>使用微量移液器在第1、4、7天取样：取333 µL用于DNA含量检测（约0.5 mg），1000 µL用于扫描电镜分析（约1.5 mg），333 µL用于活/死细胞染色（约0.5 mg）。 
	注意：此用量基于灭菌前RCP微载体的近似干重。</li>
	<li>每隔一天更换10 mL培养基。操作时，待RCP微载体沉降至底部后，小心使用10 mL移液器吸取10 mL培养基，再加入10 mL新鲜培养基。</li>
	<li>将培养物置于搅拌板上，保持95 rpm搅拌，于37 °C、5% CO2条件下继续培养7天。</li>
</ol>
4. DNA 含量、扫描电镜分析、活死染色及出芽实验
<ol>
	<li>DNA含量
	<ol>
		<li>使用微量移液器从每个旋转烧瓶中收集约0.5 mg微载体（悬浮于333 µL悬浮液中），转移至2 ml塑料管中。 
		注：这是基于RCP微载体在灭菌前的近似干重。</li>
		<li>用1 mL DPBS洗涤一次，然后吸去上清液。</li>
		<li>在冻干机中除去残留的DPBS，并称量冻干后的微载体，用于后续归一化处理。</li>
		<li>在 -80 °C 下冷冻样品至少 6 小时。</li>
		<li>在60 °C下用300 µL浓度为5 U/mL的木瓜蛋白酶孵育样品过夜。</li>
		<li>根据定量检测试剂盒的制造商说明书建立相应的滴定曲线（例如，PicoGreen dsDNA 检测试剂盒），使用发光检测仪在 520 nm 处测量荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）分析
	<ol>
		<li>从每个旋转烧瓶中收集约 1 mg 微载体，并转移至 2 mL 塑料管中。</li>
		<li>用1 mL DPBS洗涤微载体一次。</li>
		<li>移除DPBS，加入1 mL 70%乙醇，孵育1小时。</li>
		<li>移去上清液，加入1 mL 80%乙醇，孵育1小时。</li>
		<li>移去上清液，加入1 mL 90%乙醇，孵育1小时。</li>
		<li>移除上清液，加入1 mL 100%乙醇，孵育1小时。</li>
		<li>移除上清液，加入1 mL六甲基二硅氮烷，孵育10分钟。</li>
		<li>打开盖子，在化学通风橱中让样品过夜干燥。</li>
		<li>将样品固定于合适的支持物上，并按照既定方案进行扫描电镜分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DAPI 与活/死细胞染色
	<ol>
		<li>在接种细胞后的第2、4和7天，从每个旋转烧瓶中收集0.5 mg微载体，转移至2 mL塑料管中，用1 mL DPBS洗涤一次。</li>
		<li>DAPI
		<ol>
			<li>用足量的4%多聚甲醛覆盖样本，固定10分钟。</li>
			<li>用 1 mL DPBS 洗涤一次。</li>
			<li>在室温下于摇床上用染色液孵育45分钟。</li>
			<li>使用带有420 nm发射滤光片的荧光显微镜检测DAPI荧光信号，并采集图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>活细胞/死细胞染色
		<ol>
			<li>将样品在500 µL的活/死染料溶液中孵育。避光，于37 °C孵育20分钟。</li>
			<li>用1 mL DPBS洗涤一次。</li>
			<li>使用荧光显微镜，通过490 nm发射滤光片检测活细胞的荧光信号，通过545 nm发射滤光片检测死细胞的荧光信号。采集图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>HDMEC出芽实验
		<ol>
			<li>在15 mL塑料管中，加入330 µL 0.4%胶原R溶液、170 µL 0.1%乙酸和50 µL M199培养基，混匀后置于冰上保存。</li>
			<li>使用微量移液器取约 0.375 mg 微载体（250 µL），转移至 1.5 mL 塑料离心管中，静置使 RCP 微载体沉降至管底，然后完全去除上清液。 
			注意：这是基于RCP微载体在灭菌前的近似干重。</li>
			<li>加入中和胶原混合物所需的0.2 N NaOH体积，并立即与RCP微载体混合。 
			注意：通过预先将 0.2 N NaOH 逐量加入混合物中，直至 pH 发生变化（颜色由黄色变为粉红色），然后将混合物置于孵育箱中 1 分钟，此时必须形成凝胶，以此确定所需 NaOH 0.2 N 的用量。</li>
			<li>将胶原凝胶-RCP微载体混合物接种于24孔板的孔中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 30 分钟</li>
			<li>加入200 µL血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,例如，VascuLife VEGF-Mv 培养基）。在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 24 小时。</li>
			<li>在倒置相差显微镜下观察，使用10倍物镜放大，采集图像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. HDMECs 的 Biomatrix 接种及生物反应器系统的启动
<ol>
	<li>启动生物反应器培养前一天，沿抗肠系膜侧纵向切开BioVaSc（生物基质），并将其固定在预先消毒的聚碳酸酯支架中（见图3A、B）。 
	注意：BioVaSc是一种来源于脱细胞猪空肠节段的生物基质，制备方法如先前文献所述21。 
	注意：由于聚碳酸酯支架不能通过高温灭菌，需将其在超声波清洗仪（40 kHz）中孵育20分钟进行消毒，随后用70%乙醇孵育3次，每次25分钟。然后用无菌DPBS洗涤支架3次。
	<ol>
		<li>将生物基质-支架系统置于一个100 mm的培养皿中，并加入含血管内皮生长因子和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的培养基。</li>
		<li>将生物基质在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，以达到平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞消化并计数后，使用2 mL注射器将10 × 107个HDMECs悬浮于1000 µL培养基中，通过生物基质中保留的血管系统注入。 
	注意：约700 µL通过动脉入口注入，约300 µL通过静脉出口注入。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时，以促进细胞贴壁。</li>
	<li>向生物反应器系统中加入350 mL含血管内皮生长因子和1% Pen/Strep的培养基，并在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>将支架放入生物反应器的容器内，连接动脉和静脉蒂至反应器管道。</li>
	<li>通过将生物反应器系统连接至蠕动泵启动灌注，设定压力为10 mmHg，振幅为±1。</li>
	<li>每小时逐步增加压力，直至达到100 mmHg，振幅为±20。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，维持生物反应器系统培养7天。</li>
</ol>
6. 将RFP-HDMECs加入生物基质
<ol>
	<li>在15 mL Falcon管中混合330 µL 0.4%胶原R溶液、170 µL 0.1%乙酸和50 µL M199培养基。置于冰上保存。</li>
	<li>从旋转烧瓶中取出RCP微载体，彻底去除培养基。</li>
	<li>加入适量0.2 N NaOH以中和胶原混合物，并立即与RCP微载体混合。</li>
	<li>将胶原凝胶-RCP微载体混合物加入生物基质管腔内，静置30分钟以促进凝胶形成。</li>
	<li>同时，更换生物反应器中的培养基：彻底移除原有培养基，然后加入350 mL新鲜的、预热的含血管内皮生长因子和1%青霉素-链霉素的培养基。</li>
	<li>将生物反应器连接至蠕动泵，并设定压力为100 mmHg，振幅为±20。</li>
	<li>每7天更换一次培养基。</li>
	<li>将生物反应器持续培养21天。</li>
</ol>
7. 生物反应器培养物的分析与检测
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>将生物基质从生物反应器上分离，并从聚碳酸酯支架上取下。</li>
		<li>将获得的组织块切割为6个部分：2份用于MTT检测，2份用于石蜡包埋/染色，2份用于扫描电镜（SEM）分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡包埋
	<ol>
		<li>将组织片段放入培养皿中，加入足量DPBS浸没样品进行洗涤，随后弃去DPBS。</li>
		<li>用4%多聚甲醛固定组织片段，过夜。</li>
		<li>准备石蜡包埋盒，并按照标准操作流程进行包埋。</li>
		<li>将组织包埋于石蜡块中，使用切片机切取3 µm厚的切片，用于H&amp;#38;E染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>H&amp;#38;E染色
	<ol>
		<li>根据标准操作流程对复水后的切片进行染色32。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）分析
	<ol>
		<li>将组织片段放入培养皿中，加入足量DPBS浸没样品进行洗涤，随后弃去DPBS。</li>
		<li>用4.75%戊二醛&#160;固定组织片段，过夜。</li>
		<li>依次使用浓度递增的乙醇（50%至100%）进行脱水处理。</li>
		<li>加入六甲基二硅氮烷（HMDS）覆盖组织片段，作用10分钟；弃去使用过的HMDS，更换新鲜HMDS。</li>
		<li>将组织片段置于通风橱中过夜自然干燥，随后制备样品用于成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）
	<ol>
		<li>将MTT试剂与血管内皮生长因子混合，终浓度为1 mg/mL。</li>
		<li>将组织片段置于MTT溶液中，在37 °C、5% CO2条件下孵育90分钟。</li>
		<li>通过肉眼或明场显微镜观察血管结构及接种细胞的微载体，以检测代谢活跃的细胞，并采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

微载体的一个主要目标是在维持细胞分化能力的同时实现细胞扩增，以便将细胞输送至所需部位。本文介绍了一种RCP微载体，细胞能够在该载体上贴附、增殖，并以高密度定植于微载体表面。通过活/死细胞染色观察发现，在动态培养7天后，存活细胞比例超过90%，仅有少量死细胞。同样，扫描电镜（SEM）图像证实，培养7天后细胞已覆盖微载体的整个表面。
为确保三维模型中细胞的存活，必须维持对细胞的氧气和营养供应，并允许代谢废物的排出。血管是负责这一交换过程的结构，其中内皮细胞发挥关键作用，因为它们是血管内壁的衬里细胞。23它们具有增殖、迁移、黏附、出芽并形成类似血管结构的能力。24这些特性在RFP-HDMECs细胞于RCP微载体上培养后仍得以保持，因为观察到细胞能够呈现出出芽表型（见 图2）。我们在此证实，定植于RCP微载体上的原代内皮细胞可有效递送至BioVaSc生物基质原有血管管腔内并实现再内皮化。这表明本系统适用于改善组织工程植入物的血管化，具有...

组织工程应用中的一个普遍问题是，在需要的部位获得具有正确分化表型的高细胞量。自1967年以来，微载体的应用逐渐发展，并在骨科组织工程领域日益重要，用于大规模生成皮肤、骨骼、软骨和肌腱1。通过在微尺度三维（3D）基质上扩增细胞，微载体使得贴壁细胞的培养操作方式类似于悬浮培养2。由此，细胞可获得均匀的营养供应以及细胞-基质相互作用，从而更好地维持in vivo3,4的分化状态，而这种状态在二维（2D）培养中常随时间推移而丧失5。更高的比表面积——最终可实现更高的细胞产量6,7，相较于静态系统更高效的气体和营养物质交换速率8，可调控并施加物理刺激于培养环境的可能性9，以及扩增过程易于放大的潜力7，是其进一步的优势。多种特性，如直径、密度、孔隙率、表面电荷及黏附性能10,11，决定了市面上不同微载体和大载体之间的差异。然而，其主要优势之一在于可作为微组织递送至缺损部位或需求区域。
在骨组织工程中应用微载体技术时，我们曾在先前的报告中12描述了一种新型微载体的制备方法，该微载体由重组胶原蛋白I肽（RCP，商品名为Cellnest）构成。这种新型微载体可实现符合GMP标准的支架和细胞生产的放大，满足临床应用中细胞递送的需求。在此背景下，通过选择合适的交联策略，调节支架的稳定性、降解速率和表面特性，可使该技术适应特定的应用需求、目标细胞类型或靶组织13。特别是，该微载体作为可注射细胞递送系统用于治疗用途的潜在应用14，使其在临床环境中具有重要意义。
本文中，我们因此阐述了在基于胶原蛋白-I的重组肽微载体上分离和扩增人骨髓来源的间充质基质细胞（hBMSCs）和人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）的培养方法，以及这些细胞在临床应用中的递送制备流程。此外，我们还描述了若干有助于维持细胞在植入后存活率的附加实验方案。
移植后细胞的存活率实际上在很大程度上依赖于血管化15,16,17，可确保氧气和营养物质的交换，并促进代谢废物的清除。生物反应器是解决组织工程中血管化难题并维持细胞活性的一种方法，通过灌注培养基为细胞提供氧气和营养物质18在这里，我们展示了一种 体外 评估微血管内皮细胞从RCP微载体迁移至生物基质的能力及其参与形成新血管的能力的方法 从头合成 血管化与血管生成。该生物基质是一种脱细胞的猪空肠节段，称为BioVaSc（生物血管化支架），富含胶原蛋白和弹性蛋白，并保留了包括供血动脉和引流静脉在内的血管结构19 已应用于植入相关问题20.

<table><tbody><tr><td>3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑（MTT）</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>20395.01</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>乙酸 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533,001</td><td></td></tr><tr><td>分析天平 Kern EG 2200-2NM</td><td>Kern &amp; Sohn GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸-2-磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>生物反应器</td><td>德国维尔茨堡组织工程与再生医学教研室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明场显微镜 Axiovert 40C</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellnest</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（15 mL，50 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白 R 溶液 0.4%</td><td>Serva Electrophoresis GmbH</td><td>47254.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>改良型，不含氯化钙和氯化镁</td></tr><tr><td>伊红 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177.01000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 96%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T171.4</td><td>变性</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Bio&amp;SELL</td><td>FCS.ADD.0500</td><td>未经热灭活</td></tr><tr><td>荧光显微镜 BZ-9000</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Morphisto</td><td>10231.01000</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td>试剂级，&amp;ge;99%</td></tr><tr><td>生物反应器培养箱</td><td>德国维尔茨堡组织工程与再生医学教研室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活/死细胞双染试剂盒</td><td>Fluka</td><td>04511KT-F</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>2Mag</td><td>80002</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>10X</td></tr><tr><td>酶标仪&lt;br/&gt; Tecan Infinite M200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>21G 16 mm 针头</td><td>VWR</td><td>613-5389</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶（来自木瓜乳胶）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4762</td><td>冻干粉，&amp;ge; 10 单位/mg 蛋白质</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quanti-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4%</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P087</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜 Supra 25</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液 1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>旋转烧瓶（25 mL）</td><td>Wheaton</td><td>356879</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>VWR</td><td>720-2561</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶（25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）</td><td>TPP Techno Plastik Products AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF-Mv</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0005</td><td></td></tr></tbody></table>

用于细胞扩增的重组胶原蛋白i肽微载体及其在生物反应器模型中作为细胞递送系统的潜在应用

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

组织工程是一个前景广阔的领域，致力于应对因移植需求日益增长而带来的组织和器官短缺问题。生成此类组织的过程十分复杂，需要将特定类型的细胞、支架材料以及物理或生化刺激进行恰当组合，以引导细胞的生长与分化。微载体作为一种颇具吸引力的工具，可在三维（3D）微环境中扩增细胞，因其具有更高的比表面积，并且相较于传统的二维培养方法，更接近体内（in vivo）的生理环境。血管系统为细胞提供氧气和营养物质，并确保代谢废物的清除，在构建工程化组织时是一个关键组成部分。事实上，大多数组织构建物在植入后因缺乏有效的血管支持而失败。本研究中，我们介绍了一种在动态条件下（使用旋转烧瓶和生物反应器）于重组胶原蛋白基微载体上扩增内皮细胞的实验方案，并阐述了在此体系中如何评估细胞的存活率与功能特性。此外，我们提出了一种无需额外解离步骤即可实现细胞递送以促进血管化的方法。同时，我们还提供了一种在去细胞化&#160;生物基质上，利用灌注式生物反应器评估细胞血管化潜能的策略。我们认为，采用本研究所展示的方法，有望推动一系列基于细胞的新型疗法在临床组织工程应用中的发展。

如图1A所示，通过活/死细胞染色检测，在培养7天后，我们获得了大量在RCP微载体上存活的细胞。扫描电镜（SEM）分析结果进一步证实了该结论，观察到微载体孔隙周围已被细胞完全定植，并部分覆盖了孔隙（图1B）。另一方面，若细胞接种不均匀，则会导致多个微载体未被占据。实验失败的特征是死细胞数量异常增多，死细胞比例不应超过总细胞数的10%（图1C）。此外，对HDMECs的DNA含量进行定量分析显示，双链DNA（dsDNA）含量随时间逐渐增加（图1D）。
此外，RFP-HDMEC 在 RCP 微载体上培养后仍能保持其功能，如图 2所示，这些细胞在胶原凝胶中培养时呈现出...

我们提出了一种在大孔微载体上进行细胞扩增的方案，并将其作为递送系统用于灌注式生物反应器中，以接种脱细胞组织基质。我们还介绍了多种用于测定在微载体上培养的细胞增殖和活力的技术。此外，我们验证了细胞在生物反应器培养后的功能活性。

用于细胞扩增的重组胶原蛋白I肽微载体及其在生物反应器模型中作为细胞递送系统的潜在应用

组织工程是一个前景广阔的领域，致力于应对因移植需求不断增长而带来的组织和器官短缺问题……

本实验的总体目标是在高可用表面积上扩增细胞，并进一步将这些细胞递送至临床应用中的缺损部位或需求部位。该方法有助于解答组织工程领域中的关键问题，例如细胞扩增、细胞递送以及血管化。该技术的主要优势在于，我们能够以生物相容的方式，在无需任何收获步骤的情况下，直接将扩增的细胞递送至缺损部位。该方法的可视化演示至关重要，因为初次操作时，由于涉及多个步骤，微载体和生物反应器的操作可能较为复杂。本实验操作将由本实验室的博士研究生 Jihyoung Choi 协助完成。实验前一天，安装好旋转烧瓶，并做好高压灭菌的准备。分别用铝箔包裹搅拌瓶的侧帽，以避免在拆开时造成污染。将搅拌瓶用一到两层铝箔包裹后进行高压灭菌，以尽量减少灭菌后的污染风险。保持搅拌瓶瓶盖松动，并尽可能以直立位置进行灭菌。接下来，称取所需量的 RCP 大孔微载体，加入 20 毫升杜氏磷酸盐缓冲液中。在通过高压灭菌器进行热力灭菌前，使其水合至少一小时。使用文本方案中提及的生物反应器系统来生成血管化组织类似物。该生物反应器由一个放置生物基质的容器、一个培养基储液罐和一个压力瓶组成。使用硅胶管将容器与培养基储液罐及压力瓶连接。保持瓶盖松动，并将整个系统放入高压灭菌塑料袋中。将袋子封好，再放入第二个高压灭菌用塑料袋中，然后进行高压灭菌。待灭菌后的RCP大孔微载体沉降至底部后，用10毫升培养基洗涤。重复此过程三次。同时用10毫升培养基清洗转瓶。接下来，在每个转瓶中加入30毫克RCP大孔微载体，溶于8毫升培养基中。在接种细胞前，将装有RCP大孔微载体的转瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中平衡30分钟。然后，将五十万个来源于人骨髓的间充质基质细胞或人真皮微血管内皮细胞接种至每个旋转培养瓶中，每瓶加入两毫升培养基。将旋转培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的摇床培养箱中，以每分钟90转的速度搅拌5分钟，随后静置55分钟，共计进行一小时的静态-动态交替培养。重复此孵育循环四次。现在，每个旋转培养瓶中加入10毫升细胞培养基。然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下开始以95转/分钟持续搅拌。启动生物反应器培养前一天，沿生物基质的对系膜侧纵向切开，并将其固定在预先消毒的聚碳酸酯支架中。消化分离并计数细胞后，使用2毫升注射器将一千万个HDMECs悬浮于一千微升培养基中，通过生物基质中保留的血管系统注入。其中约700微升通过动脉入口注入，约300微升通过静脉出口注入。将接种了细胞的生物基质在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3小时，以促进细胞贴壁。孵育结束后，需由两人协作将生物基质连接至生物反应器，并确保动脉和静脉蒂正确连接至培养基流动系统。用350毫升血管内皮生长因子、1%青霉素-链霉素填充生物反应器系统，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育。将支架放入生物反应器的容器内。然后，仔细将动脉和静脉蒂连接至血管。通过将生物反应器系统连接至蠕动泵，开始灌注。将压力设定为10毫米汞柱振幅±1。每小时逐步增加压力，直至达到100毫米汞柱振幅±20。在15毫升Falcon管中加入330微升0.4% Collagen R溶液、170微升0.1%乙酸和50微升M199培养基，混匀。将混合物保持在冰上。然后，从旋转烧瓶中取出 RCP 微载体，彻底去除培养基。接下来，加入中和胶原混合物所需的氢氧化钠体积。中和后，立即将混合物与RCP微载体混合。在开始培养基流动之前，必须确保胶原凝胶完成凝胶化。否则，凝胶将脱离，微载体也会从生物基质的管腔中被冲走。将胶原凝胶与RCP微载体混合物加入生物基质的管腔内。静置凝固30分钟。然后，将生物反应器连接至蠕动泵，并将压力设置为100毫米汞柱振幅±20。最后，按照文本方案中所述方法对生物反应器中的培养物进行分析和检测。通过活/死细胞染色显示了细胞在微载体上增殖的代表性结果，其中在动态培养七天后，可在微载体上观察到大量活细胞。扫描电子显微镜分析结果证实，在动态培养七天后，微载体表面已完全被细胞定植。人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）在RCP微载体上进行七天动态培养后仍保持其功能。此处明场显微镜显示，定植后的微载体在胶原凝胶上培养时可长出新生的出芽结构。经过21天的生物反应器培养后，可在生物基质的血管样结构中观察到带有RFP标记的HDMECs，表明这些细胞已从RCP微载体迁移至生物基质中。此外，经过21天的生物反应器培养后，扫描电子显微镜图像显示微载体与生物基质紧密相邻。有趣的是，这些微载体表面已不再有细胞定植。观看本视频后，您应能够充分理解如何在微载体上扩增细胞，以制备可用于治疗目的的可注射细胞递送系统。一旦掌握该技术，整个过程可在四小时内完成。该方法在再生医学领域代表了一种颇具前景的策略，可用于获取并最大化细胞扩增，并将细胞递送至植入部位，从而促进组织工程移植物的血管化。该技术的应用前景涉及血管化领域，因为它可在临床情境中针对特定组织应用，作用于任何类型的细胞。该方法还可帮助理解微载体作为可注射细胞递送系统在治疗用途中的潜在应用。请注意，操作原代细胞可能具有极高危险性，因此在进行该操作时，必须采取防护措施，例如佩戴手套和实验服，并在生物安全柜内操作。该技术问世后，为组织工程领域的研究人员探索体外细胞迁移提供了可能，有助于理解或预测体内情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

重组胶原蛋白 i. 肽载体在生物反应器中的应用及其作为细胞传递系统的潜力

目前干细胞治疗面临的主要障碍之一是确定将这些细胞递送至宿主组织的最有效方法。在此，我们描述了一种基于壳聚糖的递送方法，该方法操作简便且效率高，同时能够维持脂肪来源干细胞的多向分化潜能。...

构建用于递送负载干细胞的壳聚糖微球的胶原水凝胶

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

组织工程通常包括 体外 扩增以创建用于组织再生的自体移植物。本研究介绍了一种组织扩增、再生与重建的方法 体内...

压缩胶原中的组织匀浆：一种含细胞的生物移植物用于单阶段重建修复

我们提出了一种利用大分子拥挤剂（MMC）获取富含细胞外基质蛋白的细胞衍生基质的实验方案。此外，我们还介绍了一种将MMC应用于三维类器官皮肤共培养体系构建的方案，该方法可在维持构建物成熟度的同时缩短培养时间。...

改善二维与三维皮肤模型 体外 使用大分子拥挤效应的模型

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

组织特异性的细胞外基质（ECM）是调控细胞功能的关键介质。本文介绍了一种合成纯ECM来源的泡沫材料和微载体的方法，这些材料在培养中稳定，无需化学交联，可用于先进的三维体外细胞培养模型或作为促再生生物支架。...

用于组织特异性细胞培养与递送的细胞外基质来源泡沫及微载体的制备

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外...

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

本方案演示了使用沿流体流动方向具有变化几何结构的微流控通道，以产生拉伸应变（拉伸），从而在三维胶原水凝胶（&lt;250 µm...

微加工具有长程纤维取向的三维胶原水凝胶

本文介绍了一种基于符合GMP标准的可溶性微载体的全封闭系统，用于实现贴壁细胞的大规模生产。该方法已验证可用于人源间充质干细胞、HEK293T细胞和Vero细胞的培养，其产量和质量均满足细胞与基因治疗产业的要求。...

基于GMP级可溶性多孔微载体的大规模细胞生产

本实验方案旨在通过免疫染色评估生物功能化自组装肽在细胞黏附、类器官形态及基因表达方面的作用。我们将使用结直肠癌细胞系，以提供一种经济高效的方法来获取用于高强度检测的类器官。...

利用超短自组装肽基质从SW1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官

关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

了解利用大孔微载体在灌流生物反应器中扩增细胞的方法，无需收获步骤即可将细胞递送至缺损部位。该技术为组织工程和再生医学中的细胞递送提供了生物相容性解决方案。

用于细胞扩增的重组胶原蛋白I肽微载体及其在生物反应器模型中作为细胞递送系统的潜在应用

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