通过口服递送双链RNA在韧皮部及刺吸式口器昆虫中诱导RNA干扰的方法

这些实验步骤的总体目标是展示一种天然的口服递送方法，用于在活体昆虫害虫中递送基因特异性的双链RNA（dsRNA），以诱导RNA干扰。该方法有助于回答如何将生物分子递送至昆虫体内的关键问题，阐明基于RNA干扰的分子生物农药的作用效果，并实现对环境中昆虫的控制。

该技术的主要优势在于，通过核酸介导的基因沉默进行递送，可应用于刺吸式口器害虫以及咀嚼式口器害虫。尽管本方法展示的是向半翅目害虫（如褐臭虫、花色蝽和亚洲柑橘木虱）递送双链RNA，但这些方法也可推广至其他昆虫。

开始实验前，选取由卵块孵化出的早期四龄棕色臭虫（BMSB若虫），并在进行dsRNA饲喂前使其饥饿24小时。随后，选取细长的经认证的有机青豆，用0.2%次氯酸钠溶液清洗5分钟，接着用三倍双蒸水清洗三次，然后让青豆自然风干。

干燥后，使用洁净的剃须刀片从豆荚的萼端修剪青豆，使其总长度为7.5厘米。将清洗并修剪后的青豆浸入装有300微升对照溶液的无盖2毫升微量离心管中。通过将5微克或20微克的体外合成lac Z、JHAMT或VGDSRNA与DNase-free水混合至终体积为300微升，配制成终浓度分别为0.017微克/微升或0.067微克/微升的RNA稀释液。

将清洗并修剪好的青豆浸入一个无盖的2毫升微量离心管中，管内含有300微升的dsRNA溶液。包裹并密封微量离心管的边缘，将浸入的青豆封闭在内，以防止dsRNA溶液蒸发，并阻止昆虫进入离心管。将离心管直立放置于室温下3小时，使dsRNA溶液通过毛细作用充分渗透至整个青豆内部。

将试管放入洁净的聚丙烯培养容器中，并在每个培养容器中放入3只饥饿处理的4龄若虫。每个培养容器处理3只昆虫。每个容器包含三根带有绿色食用色素的青豆，或dsRNA溶液。

将昆虫置于培养箱中，在25摄氏度、72%相对湿度、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下饲养。让昆虫取食浸润并吸收了dsRNA的绿豆，持续五天，并在三天后更换为经dsRNA处理的新鲜绿豆饲料。选取植株或幼苗，并在使用前2至3天停止浇水，使土壤干燥至微湿状态，但不可完全干透。

使用手动喷雾瓶，将 200 毫升 dsRNA 溶液喷洒至植株下部冠层。在去顶处理后的 25 至 40 天内，采集四根枝条顶端约 10 片新生叶片进行取样。提取总 RNA，并通过 RT-PCR 和 qPCR 检测所施加的 dsRNA 诱导子的存在情况。

同样，将10毫升dsRNA溶液喷洒到幼苗或小型盆栽树木叶片的下部区域。选择植株或幼苗，并在使用前2至3天停止浇水，使土壤干燥至微湿但不完全干透的状态。随后，向大型盆栽植株的土壤中加入1升dsRNA溶液。

一小时后加入一升水。将100毫升dsRNA溶液施用于部分干燥土壤中高一米的盆栽树木的土壤中。让植物通过土壤浇灌方式吸收dsRNA溶液，并浸泡30分钟。

然后施用仅含清水的处理，以促进根部吸收。选择柑橘幼苗或新生的约3.5年生植株，通过茎部钻孔法（也称为树干注射法）注入dsRNA。用宽0.6厘米的天花板薄膜条将每个注射器的铜制尖端缠绕4至6圈，以防止尖端附近发生泄漏。

接下来，用无 DNA、无 RNA 的水将双链 RNA（dsRNA）溶液稀释后，取六毫升注入树干注射器中。使用 10 毫米的钻头在柑橘植株上钻孔，注意钻孔深度不要超过两厘米，或约为茎干直径的一半。随后，将溶液注入树干，并将注射器保留在树干内 6 至 10 小时，以确保 dsRNA 溶液被充分吸收。

在处理后的第3、10和30天，让昆虫取食经处理树木的枝条。将30克黏土吸附剂倒入50毫升锥形管中，至35毫升刻度处。加入20毫升用无DNA、RNA水稀释的dsRNA溶液至管中，以润湿全部吸附剂。

盖上锥形管盖，轻晃管子以帮助排出空气，将管子垂直放置，静置一到两分钟，使黏土颗粒充分吸收溶液。将足量浸泡过dsRNA的黏土加入土壤混合物中，直至填满一个一加仑的花盆。用手充分搅拌并翻动土壤，使浸泡过dsRNA的黏土均匀分散在土壤中。

使用土壤对选定进行dsRNA处理的幼苗进行重新移栽。在30分钟至1小时后，用200毫升不含dsRNA的清水浇灌土壤，随后再加入100毫升清水。

24小时后，将植物恢复至正常的浇水计划。在dsRNA处理后的每月，通过采集植株新生长部分最顶端的叶片，使用黏土吸附剂和dsRNA对4至6片经处理的盆栽植物叶片进行检测。将芸豆片段浸入体外合成的、针对褐蝽（BMSB）mRNA的dsRNA中，进行qPCR检测，结果显示靶基因JHAMT和Vg的表达量在体内显著降低，表明RNA干扰成功诱导。

这种递送方法对另一种半翅目害虫——花蝽——同样有效，可通过其绿色的排泄物加以判断。在观看这些可视化演示后，您应能够充分掌握如何通过口服摄入的方式将双链RNA递送至昆虫体内，以在活体昆虫中诱导RNA干扰。

RNAi 核苷酸技术的不断进步，持续拓展了研究人员在多种生物体中调控 RNA、基因表达和蛋白质水平的能力，范围涵盖植物、昆虫以及最难处理的微生物。随着双链 RNA 的生产成本持续降低，以及递送方法和稳定性方面的不断改进，RNAi 技术未来将继续被用于解决日益复杂的难题。