人干扰素α超灵敏单分子阵列数字酶联免疫吸附试验的研制与验证
June 14th, 2018
在这里, 我们提出一个协议来描述一个单一的分子阵列数字 ELISA 检测的发展和验证, 这使得对所有干扰素α亚型的超敏检测在人体标本。
这种方法可以帮助回答有关干扰素在不同疾病环境中诱导的反应的性质、调节和生物学影响的关键问题，包括自身免疫和感染。这种技术的主要优点是其自身的总裁灵敏度。这项技术在生物标志物发现方面具有巨大潜力，可以改善许多疾病的患者管理，因为它可以以前所未有的灵敏度量化细胞因子。
这种方法的一个主要步骤是中和与自身免疫性多啡肽系统 1 型患者相关的活性。首先，将 2.8 亿个顺磁性珠子加载到微量离心管中，注意体积。然后脉冲旋转珠子，并将试管放在磁力分离器上一分钟。
取出并丢弃稀释剂溶液，从而分离珠子。接下来，用 BWB 洗涤珠子两次，用 BCB 洗涤两次。每次洗涤，加入 200 μL 并涡旋试管 5 秒钟。
然后使用磁力分离器将珠子从溶液中分离出来。分离 1 分钟后，丢弃稀释剂。接下来，每微珠体积添加 190 μL BCB。
然后短暂涡旋试管，脉冲旋转试管，并将洗过的珠子放在冰上。为了激活珠子，将 1 毫升冷 BCB 与 10 毫克 EDC 混合，涡旋直至溶液均匀。使用 EDC 时，由于其固有的不稳定性和 equinus 解决方案，可以快速安全地工作。
然后向微珠悬浮液中加入 10 微升冷的稀释 EDC，并短暂涡旋微珠。接下来，将珠子放在室温下的摇床上 30 分钟。为了使抗体与磁珠偶联，首先涡旋并脉冲旋转活化的磁珠。
然后将磁珠放入磁力分离器中一分钟，弃去 BCB 上清液。接下来，从磁铁上取下试管，用 200 微升 BCB 洗涤珠子两次。然后涡旋、脉冲旋转和磁性分离珠子以去除缓冲液。
然后，向活化的磁珠中快速添加 200 μL 经缓冲液交换的冷抗体。将磁珠涡旋成溶液后，将悬浮液在室温摇床上以 1， 000 RPM 的速度放置 2 小时。首先对抗体包被的微珠悬浮液进行脉冲旋转，然后使用磁柱去除缓冲液。
接下来，检查缓冲液中蛋白质的浓度。使用低体积分光光度计。此时，抗体与磁珠偶联，任何高于零的值都意味着磁珠被抗体饱和。
现在，用 200 微升 BWB 洗涤珠子，就像之前的所有洗涤一样。然后，将上清液转移到新试管中并检查蛋白质浓度。对从磁珠中释放的蛋白质进行定量，可以测量抗体偶联。
然后，再次用 200 微升 BWB 洗涤珠子。接下来，加入 200 μL 微珠封闭缓冲液，涡旋试管 5 秒，然后将其转移到室温摇床中 30 分钟。30 分钟后，珠子将被堵塞。
然后，使用 200 微升 BWB 洗涤一次，然后每次洗涤用 200 微升珠子稀释剂缓冲液洗涤两次。然后，将包被和封闭的珠子储存在 4 摄氏度的 200 微升珠子稀释缓冲液中。视频的这一部分提出了如何在自制配置中使用单分子阵列分析仪软件调整检测条件的策略。
首先测试捕获抗体偶联微珠和两种抗体组合中的生物素化检测抗体的不同组合。接下来，测试三种不同捕获抗体浓度和两种不同生物素化比率的组合，用于检测和捕获抗体，反之亦然。然后选择检测级别最低的组合，并将其用于后续步骤。
在这种情况下，生物素与抗体的 30：1 比例可提供最佳检测限。接下来，将两步配置与三步配置进行比较。三步配置具有三个不同的孵化步骤。
一个带有捕获抗体，一个带有检测抗体，最后一个，第三个用于 SBG 酶标记。两步配置结合了捕获和检测孵育。按照制造商的说明，使用选定的捕获和检测器抗体浓度和口粮，在分析仪中预配置两步和三步配置，运行单分子阵列分析仪。
然后选择允许最高灵敏度的配置，并保留它以备将来的步骤使用。在这种情况下，两步配置在每个测试点的灵敏度略高。接下来，优化检测抗体和 SBG 的浓度。
用三种不同浓度的 SBG 测试三种不同浓度的检测抗体。选择灵敏度最高的浓度，并保留它们以备将来的步骤使用。在这种情况下，每毫升 0.3 μg 抗体和 150 pica 摩尔 SBG 具有最佳检测水平，背景水平低，振幅偶然。
有关其他优化步骤，请查阅文本协议。其中有优化检测特异性和可重复性的程序以及蛋白质竞争的检测。使用优化检测干扰素-α 的 13 个亚类的测定方法，分析 SLE 患者、JDM 患者和健康对照者的血浆和血清。
在两个疾病队列中均检测到高水平的干扰素-α 蛋白。虚线表示传统的市售 Eliza 的检测水平，尽管该细胞因子在这些疾病中的作用已知，但该 Eliza 不会在这些患者组中检测到干扰素-α 蛋白。观看此视频后，您应该对如何为您选择的分析开发和验证单分子阵列分析有很好的了解。
在尝试此过程时，重要的是要记住，在细胞选择抗体期间是。自开发以来，该测定法可以更好地表征干扰素-α 在各种自身免疫性疾病和感染中的作用。该检测还用于监测对新疗法的反应并确定导致某些自身免疫性疾病的细胞参与者。
概述
本文介绍了开发和验证单分子阵列数字ELISA检测法的协议，该方法能够超灵敏地检测人类样本中所有IFN-伪亚型。该方法对于理解各种疾病背景下的干扰素诱导反应特别有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 生物标志物发现
背景
- 干扰素-α在免疫反应中扮演着关键角色。
- 现有方法缺乏检测低水平细胞因子所需的灵敏度。
- 本研究旨在改进检测能力以更好地管理患者。
- 自身免疫和感染是重点关注领域。
研究目的
- 开发用于检测IFN-伪亚型的高灵敏度检测法。
- 探索疾病中干扰素反应的生物学影响。
- 促进生物标志物发现以改善临床结果。
使用的方法
- 制备用于抗体结合的顺磁性珠。
- 使用单分子阵列分析软件优化检测条件。
- 测试各种抗体组合的灵敏度。
- 分析患者和对照组的血浆和血清样本。
主要结果
- 在SLE和JDM患者中检测到高水平的干扰素-α。
- 该检测法比传统ELISA表现出更高的灵敏度。
- 确立了抗体结合和检测的最佳条件。
结论
- 开发的检测法为研究干扰素反应提供了强大工具。
- 它在诊断和管理自身免疫性疾病方面具有潜在应用。
- 进一步优化可以提高特异性和重复性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Ultra-sensitive quantification of human interferon-α (IFN-α) at attomolar concentrations addresses a critical gap in cytokine biomarker detection for autoimmune and infectious disease research. This digital ELISA platform enables detection of all 13 IFN-α subtypes, supporting translational biomarker discovery and mechanistic de-risking in early-stage biopharma pipelines. The validated assay enhances predictive confidence for target engagement and disease monitoring, directly impacting portfolio triage and advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of IFN-α to interrogate cytokine-driven disease mechanisms.
- Supports functional target validation by distinguishing IFN-α subtypes in human samples.
- Facilitates mechanistic de-risking for immune-modulating therapeutic hypotheses.
- Improves predictive confidence in pathway modulation and target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, reproducible digital ELISA platform for high-sensitivity cytokine detection.
- Standardizes assay configuration and antibody selection for robust downstream workflows.
- Enables quantitative, cross-cohort comparison of IFN-α levels in diverse biological matrices.
- Prepares biological systems for reliable compound screening and biomarker evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling detection in patient-derived samples.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in autoimmune and infectious disease models.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate therapies targeting IFN-α pathways.
- Enhances disease-relevant system modeling by capturing low-abundance cytokine dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This digital ELISA method integrates from early discovery through translational research, enabling hypothesis testing, target validation, and biomarker-driven decision-making across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification for IFN-α–mediated responses.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for quantitative cytokine measurement.
- Analytics: Delivers attomolar sensitivity and multiplexed subtype detection for robust data outputs.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling biomarker alignment in patient samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-sensitivity platform for diverse cytokine and biomarker programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Standardizes ultra-sensitive cytokine quantification with reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, conjugation, and digital ELISA instrumentation.
- Demands access to single molecule array analyzers and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay parameters and data interpretation.
- Adaptable to various biological matrices but dependent on antibody specificity and sample quality.
- Practical limitations include optimization of assay configuration and validation for each new target.
