气孔胶带剥离法：一种改进的保卫细胞样品制备方法

本实验的总体目标是制备高质量的富集型气孔保卫细胞，用于生理学、生物化学以及分子生物学分析，例如转录组学、蛋白质组学和代谢组学。大家好，我叫Sheldon Lawrence，是佛罗里达大学生物学系Chen博士实验室的一名研究生。

今天，我将向您展示如何从植物叶片组织中分离保卫细胞，这些细胞是研究气孔生理学和生物学的有用材料。该方法被认为是一种分离保卫细胞的新方法，可特异性富集完整的保卫游戏副本，并为研究气孔细胞信号传导过程提供可靠的样品。

该方法的应用可扩展至十字花科植物及其他植物物种，仅需对实验方案进行少量修改即可。本演示至关重要，因为富集保卫细胞的主要步骤可能具有挑战性。首先，选择成熟的、五周龄的拟南芥植株。

用手术刀在叶片基部小心地切下一片叶子。取两段透明胶带，将切下的叶片夹在中间。轻轻按压胶带两侧，同时确保胶带两端不相互粘连。

可通过将手指插入两者之间来完成此操作。轻轻将两片胶带彼此分开，并立即将从叶片远轴面取下的表皮漂浮于气孔开放缓冲液中。待所有表皮样品收集完毕后，将其置于光照条件下。

将它们放置两小时。取数片表皮并置于显微镜载玻片上。使用光学显微镜调节镜头，观察保卫细胞，并确保其处于开放状态。

将表皮组织放入50 ml细胞壁消化酶溶液中，漂浮并置于26°C条件下孵育。20分钟后，从酶溶液中取出表皮组织，用去离子水短暂冲洗两次，然后转移至新鲜的气孔开放缓冲液中。

用研钵和研杵在液氮中研磨果皮。然后按照文中所述进行酚抽提。果皮在研钵中用研杵研磨后，将提取物连同果皮一起转移至Oak Ridge离心管中，在4°C下于摇床中振荡一小时。

通过加入五倍体积的冰冻甲醇（含0.1 mol乙酸铵）沉淀经苯酚提取的蛋白质。在-20摄氏度条件下沉淀蛋白质过夜后，通过离心收集蛋白质，并按照文中所述进行沉淀物洗涤。将沉淀物重悬于1毫升冷丙酮中，转移至2毫升微量离心管中。

离心后，弃去丙酮上清液，将沉淀物干燥十分钟。用溶解缓冲液溶解蛋白质样品。涡旋振荡并离心后，收集上清液并测定蛋白质浓度。

运行 SDS-PAGE 凝胶电泳，观察分离的蛋白质条带并评估蛋白质的相对质量。此图为拟南芥保卫细胞在消化叶肉细胞和表皮细胞前后的代表性图像。

可以使用荧光素二乙酸酯检测气孔保卫细胞在去除叶肉细胞和表皮细胞前后的细胞活性，该方法可检测酶活性及细胞膜完整性。如图所示，经过剥离和酶解处理后，保卫细胞仍保持活性。此示例展示了拟南芥气孔在脱落酸（ABA）处理下的开闭运动响应。

保卫细胞对处理有响应，经ABA处理30分钟后，气孔开度减少超过50%。此处展示了气孔运动的时间进程。此外，还展示了每个时间点气孔开度的代表性图像。

通过SDS-PAGE观察蛋白质的检测、分离及相对丰度。条带清晰且分明。包含四个生物学重复，以强调本方法进行蛋白质提取的可重复性。

我们最初产生这种方法的想法，是在尝试将保卫细胞的分子变化与气孔运动进行实时关联时。一旦掌握，可在数小时内制备出气孔保卫细胞的蛋白质样品，并可用于多个实验。在剥离和操作过程中，需注意避免对保卫细胞造成大量损伤。

采用该方法后，还可应用其他技术来研究保卫细胞信号转导，例如使用等重标记技术来分析植物在正常和胁迫条件下蛋白质的氧化还原响应。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离和富集完整且具有活性的保卫细胞，并提取适用于下游研究的高质量蛋白质。