气孔带皮: 一种改进的防护细胞样品制备方法
2018年7月15日
本协议描述了一种制备富含气孔保护细胞的方法, 用于生理学和其他生物研究。
本实验的总体目标是制备高质量的富集气孔保卫细胞，用于生理、生化和分子分析，例如转录组学、蛋白质组学和代谢组学。您好，我叫 Sheldon Lawrence。我是佛罗里达大学生物系陈博士实验室的研究生。
今天，我将向您展示如何从植物叶组织中分离保卫细胞，这些细胞是研究气孔生理学和生物学的有用材料。这种方法被认为是一种分离保卫细胞的新方法。它特别允许富集完整的保卫细胞，并为气孔细胞信号转导过程的研究提供可靠的样品。
该方法的应用可以扩展到十字花科植物和其他植物物种，只需对方案进行少量修改。演示很重要，因为富集保卫室的主要步骤可能具有挑战性。首先，选择成熟的 5 周龄拟南芥植物。
用手术刀小心地去除一片叶子，从基部切开叶子。取两片透明胶带，将切出的叶子放在它们之间。轻轻地向两侧施加压力，同时确保胶带的末端不粘附。
这可以通过在它们之间插入一根手指来完成。轻轻地将两片胶带彼此分开，并立即将从叶子的背面取出的果皮漂浮到气孔开口缓冲液中。收集完所有果皮后，将它们放在光照下。
让它们在那儿呆两个小时。取几个果皮并将它们放在显微镜载玻片上。使用光学显微镜，调整镜头以查看保卫细胞并确保它们打开。
将果皮放入 50 ml 细胞壁消化酶溶液中。漂浮并在 26 摄氏度下孵育它们。20 分钟后，从酶溶液中取出果皮，用去离子水短暂冲洗两次，然后放入新鲜的气孔开放缓冲液中。
用研杵在装有液氮的研钵中研磨果皮。然后按照文中的说明进行苯酚提取。用研杵在研钵中研磨果皮后，将提取物与果皮一起转移到橡树岭离心管中，并在摇床上以 4 摄氏度搅拌一小时。
通过在 100% 甲醇中加入 5 体积的冰冷的 0.1 mol 乙酸铵来沉淀苯酚提取的蛋白质。在 20 摄氏度下沉淀蛋白质过夜后，通过离心收获蛋白质，并按照文中的说明进行沉淀洗涤。将沉淀重悬于 1 毫升冷丙酮中，并转移到 2 毫升微量离心管中。
离心后，弃去丙酮上清液，将沉淀物干燥 10 分钟。将蛋白质样品溶解在溶出缓冲液中。涡旋和离心后，收集上清液并测量蛋白质浓度。
运行 SDS-PAGE 凝胶。可视化单独的蛋白质条带并观察相对蛋白质质量。这是拟南芥保卫细胞在叶肉和表皮细胞酶消化前后的代表性图像。
使用荧光素二乙酸酯可以观察去除叶肉和表皮细胞前后的保卫细胞活力，荧光素二乙酸酯可测量酶活性和细胞膜完整性。如您所见，保卫细胞在脱皮和酶消化后仍然有活力。这个例子说明了拟南芥响应 ABA 处理的气孔运动。
保卫细胞对治疗有反应，用 ABA 处理 30 分钟后气孔孔径减少 50% 以上。这是气孔运动的时间过程。此外，还显示了每个时间点气孔孔径的代表性图像。
通过 SDS-PAGE 观察蛋白质检测、分离和相对丰度。条带清晰而鲜明。包括四个生物学重复，以强调从该方法中提取蛋白质的可重复性。
当我们试图将保卫细胞分子变化与气孔运动实时关联起来时，我们第一次有了这种方法的想法。一旦掌握，就可以在几个小时内制备来自气孔保卫细胞的蛋白质样品，并可用于多个实验。重要的是要记住，在剥离和处理时不要对保卫室造成大量损坏。
遵循这种方法，可以应用其他技术来研究保卫细胞信号传导，例如同量异位标记，以研究植物在正常和胁迫条件下蛋白质的 redux 反应。观看本视频后，您应该对如何分离和富集完整和活的保卫细胞，以及提取适合下游研究的高质量蛋白质有很好的了解。
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概述
本协议描述了一种从植物叶片组织中分离和富集完整气孔保卫细胞的新方法。这些富集的保卫细胞对于生理、生化和分子分析非常有价值，包括对气孔细胞信号传导过程的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生理学
- 细胞生物学
- 生化分析
背景
- 保卫细胞在调节植物气体交换中起着关键作用。
- 了解保卫细胞功能对于研究植物对环境变化的反应至关重要。
- 当前分离保卫细胞的方法可能无法获得高质量样本。
- 本协议旨在改进分离过程以获得更好的研究成果。
研究目的
- 准备高质量的富集气孔保卫细胞。
- 促进气孔的生理和生化研究。
- 为各种生物学分析提供可靠的样本。
使用的方法
- 从植物叶片组织中分离保卫细胞。
- 富集完整保卫细胞以进行分析。
- 应用新技术以改善样本质量。
- 为转录组、蛋白组和代谢组学研究做准备。
主要结果
- 成功分离出高质量的保卫细胞。
- 提高了生理研究样本的可靠性。
- 改善了对气孔信号传导过程的理解。
- 在植物生物学研究中具有更广泛的应用潜力。
结论
- 该方法在保卫细胞分离方面提供了显著进步。
- 富集的保卫细胞可以为植物生理学带来新的见解。
- 未来的研究可以利用这一协议进行各种生物学分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method addresses the challenge of isolating intact plant guard cells for molecular analysis, enabling reliable protein extraction and viability assessment. It supports mechanistic de-risking in target validation by providing enriched samples for studying signaling pathways linked to stomatal movement. The approach improves predictive confidence in preclinical models by yielding reproducible biochemical data from physiologically relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of guard cell signaling mechanisms through enriched protein samples.
- Operational Value: Provides reliable isolation of intact guard cells using accessible materials like Scotch tape.
- Scientific Value: Supports functional validation of targets involved in stomatal response to abscisic acid (ABA).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative protein outputs via SDS-PAGE for comparative analysis across conditions.
- Operational Value: Ensures sample reproducibility with four biological replicates demonstrated in the protocol.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization through consistent guard cell enrichment and viability measurement using fluorescein diacetate (FDA).
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular changes in guard cells to phenotypic stomatal movement outcomes under ABA treatment.
- Operational Value: Enables time-course analysis of stomatal aperture reduction (>50% after 30 minutes ABA) for kinetic profiling.
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking cellular signaling to physiological responses in Arabidopsis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation through biochemical analysis of enriched guard cells prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of guard cell signaling pathways via protein extraction and viability assays.
- Screening: Delivers reproducible protein samples suitable for downstream proteomic applications like isobaric labeling.
- Analytics: Enables quantitative measurement of protein abundance and separation clarity via SDS-PAGE gel visualization.
- Translational Research: Connects molecular data to stomatal movement phenotypes, advancing preclinical continuity in plant stress response models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, low-cost technique for repeated guard cell enrichment across experiments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in guard cell signaling studies.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through simple tape-peel and enzyme digestion steps.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions in target validation by providing reliable biochemical readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional guard cell responses to stimuli like ABA.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and microscopic visualization of guard cells.
- Needs standard laboratory equipment including centrifuge, mortar and pestle, and SDS-PAGE apparatus.
- Demands cross-team consistency in peel collection timing and enzyme incubation conditions.
- Involves adaptation considerations for different plant species beyond Arabidopsis, as noted for Brassicaceae.
- Includes practical limitations such as avoiding excessive damage during peeling to maintain cell integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:02
Title
1:19
Preparation of Enriched Stomata
3:14
Protein Extraction and SDS-PAGE Separation
6:14
Results: Stomata Tape-Peel Allows for the Preparation of High Quality Enriched Stomata Suitable for Conducting Physiological, Biochemical and Molecular Assays
7:38
Conclusion
