Name: 小鼠卵母细胞在减数分裂过程中对人类基因功能的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 了解利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂I期功能的方法。该技术通过显微注射和图像分析，帮助研究母体非整倍体的遗传倾向，为生殖健康遗传风险研究提供有效模型。

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本研究工作获得了美国生殖医学会的研究资助以及新泽西州立大学罗格斯大学查尔斯和约翰娜·布施纪念基金对 K.S. 的资助。A.L.N. 获得了美国国立卫生研究院（N.I.H.，资助号 F31 HD0989597）的资助。

1. 分子克隆
<ol>
	<li>获取目的基因的全长编码序列及质粒 体外 体外转录（pIVT）载体11. 
	注意：全长 cDNA 克隆可从多个供应商处商业购买，或通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）生成。美国国家生物技术信息中心（NCBI）在线资源提供了来自核苷酸和表达序列标签（EST）数据库的基因转录本序列。为了便于蛋白质的可视化及表达水平分析，可将其与绿色荧光蛋白（Gfp）融合Gfp）或其他合适的荧光标签可能需要在克隆策略中使用。</li>
	<li>使用经过验证的克隆策略，将目的基因的编码序列插入 pIVT 载体的多克隆位点。分子克隆的详细步骤及相关操作此前已有描述。 12. 
	注意：若需生成基因融合产物，务必确保克隆处于正确的读码框中。</li>
	<li>使用Globin引物对构建体进行测序，以确认基因插入正确、读码框融合恰当，并确保未产生由聚合酶引入的点突变。 
	注意：如果无法使用桑格DNA测序设备，许多公司提供低成本的DNA测序服务。</li>
	<li>如果要生成单核苷酸多态性（SNPs）或插入/缺失突变（INDELS），需对DNA进行诱变。DNA诱变操作详见下文步骤1.5–1.7。对于野生型构建体，可直接进行步骤1.7的线性化操作。</li>
	<li>设计定点突变引物，并根据制造商方案完成突变PCR反应以构建突变体。PCR介导的定点突变方法已有先前报道 13此外，许多公司提供包含实验方案的定点突变试剂盒。</li>
	<li>将突变后的DNA转化至细菌宿主中。分离并纯化质粒。 
	注意：许多公司生产可用于轻松分离和纯化质粒DNA的试剂盒。请根据制造商的说明书进行操作。如果使用的是革兰氏阴性细菌菌株，例如 E. coli建议使用去除内毒素的试剂盒。</li>
	<li>使用标准的桑格DNA测序法对细菌转化子中分离的DNA进行测序，以确认目标SNP或INDEL的引入。</li>
	<li>使用单一限制性内切酶消化纯化的DNA，使最终产物线性化。 
	注意：pIVT 载体包含 Addgene 质粒图谱中列出的多个单一酶切位点 14.</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳确保产物为线性。琼脂糖凝胶电泳的方法此前已有定义。 14. 
	注意：所有后续步骤均需使用带滤芯的吸头和无RNase的材料，以确保生成稳定且高质量的RNA。</li>
	<li>使用经过验证的DNA纯化方案或试剂盒纯化消化产物，并用30 μL洗脱液洗脱 &#181;L 无RNase/DNase水 
	注意：推荐使用基于二氧化硅基质离心柱的试剂盒以获得高质量的纯化DNA。请遵循制造商的相应操作步骤。</li>
	<li>体外 按照制造商说明书，使用T7聚合酶转录DNA。</li>
	<li>纯化 RNA 并在 30 中洗脱 &#181;使用硅胶膜离心柱型核酸纯化试剂盒，按照制造商说明书，用 RNase/DNase 自由水 L 进行纯化。</li>
	<li>使用甲醛进行变性琼脂糖凝胶电泳，以确认最终RNA产物的大小。详见下文步骤1.13-1.22 14. (图1).</li>
	<li>将1 g琼脂糖加入72 mL水中，加热至溶解，然后冷却至60 &#176;C.</li>
	<li>通过加入 0.4 M MOPS（pH 7.0）、0.1 M 醋酸钠和 0.01 M EDTA 配制 10X MOPS 电泳缓冲液。</li>
	<li>向冷却的琼脂糖溶液中加入10 mL 10× MOPS电泳缓冲液和18 mL 37%甲醛（12.3 M）。</li>
	<li>将琼脂糖溶液倒入制胶容器中以制备凝胶。使用足够大的梳子，以容纳10个样品孔 &#181;L. 待凝胶完全凝固且触感坚实后，轻轻取出梳子。</li>
	<li>将凝胶安装至电泳槽中，加入足量的1× MOPS电泳缓冲液，确保完全浸没凝胶。</li>
	<li>通过添加1制备RNA样本 &#181;g RNA 与含甲醛的上样染料按 0.5X 体积混合。</li>
	<li>将溴化乙锭加入RNA溶液中，终浓度为10 &#181;g/mL</li>
	<li>将RNA样品溶液在70℃变性 &#176;C，5 分钟。</li>
	<li>使用无菌的、10 &#181;L 型滤芯吸头，装载 5 &#181;分子量标记的 L 和 5 &#181;将 RNA 样品各 L 加入凝胶的独立加样孔中，在 5 V/cm 条件下电泳，直至染料迁移至凝胶长度的三分之二以上。</li>
	<li>在紫外透射仪上观察凝胶中的RNA条带。通过与分子量标记物比较，确认RNA大小正确。</li>
	<li>为测定 RNA 的浓度和纯度，转移 1.2 &#181;使用无菌 10 微升纯化 RNA &#181;使用L型滤芯吸头将样品加入紫外分光光度计。 
	请注意，高质量的RNA其A260/280吸光度比值应在1.8–2.2之间，A260/230比值也应符合相应标准&#62;1.7）分别。</li>
	<li>使用10 &#181;L型滤芯吸头，将剩余的纯化RNA分装至无菌0.5 mL离心管中 &#181;L 离心管（3-5） &#181;L/管）。将管置于 -80 ℃ 保存 &#176;C，直至准备进行显微注射。 
	注意：最终注射浓度为 500 ng/&#181;L 是一个理想的起始点。建议将 RNA 用无 RNase 的 H 按 1:2 比例稀释20，以降低RNA在显微注射移液管中的黏附性。</li>
</ol>
2. 动粒-微管连接实验
<ol>
	<li>将卵母细胞均分为若干组用于显微注射。 
	注意：卵母细胞的采集、转移、显微注射及减数分裂成熟过程此前已在 JoVE 中有详细描述15。</li>
	<li>对其中一组注射实验性 mRNA，其余组则分别注射野生型（WT）对照 mRNA 以及 PBS 或 Gfp mRNA。 
	注意：推荐起始注射浓度为 500 ng/µL10。可使用皮升注射仪控制注射量，建议注射体积为 5–10 pL15。</li>
	<li>使用手动或口控移液装置，其玻璃移液管开口略大于卵母细胞直径（100–150 µm），将卵母细胞转移至培养皿中覆盖有胚胎级矿物油的 100 µL 无米力农培养液液滴中，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 7 小时，以确保充分发育至减数第一次分裂中期（Met I）15。</li>
	<li>孵育后，使用上述相同移液装置将卵母细胞转移至中心井器官培养皿中，中心井内含 700 µL 预冷的最低必需培养基（MEM）收集液，外圈加入 500 µL H2O，并将培养皿置于冰上 7 分钟。 
	注意：建议在处理卵母细胞前，将 MEM 培养基和中心井器官培养皿于 -20 °C 预冷至少 20 分钟。</li>
	<li>使用移液装置将卵母细胞转移至透明玻璃点样板的一个孔中，该孔内含 400 µL 1× PBS 中的 2% 多聚甲醛溶液，在室温下固定 20 分钟。</li>
	<li>使用相同移液装置将卵母细胞转移至点样板另一孔中，该孔内含 400 µL 封闭液（PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3），并于 4 °C 保存，直至进行免疫染色处理。 
	注意：在 4 °C 保存卵母细胞时，需用封口膜覆盖玻璃点样板以防止蒸发。</li>
	<li>使用相同移液装置将卵母细胞转移至点样板新孔中，该孔内含 400 µL 透化液（PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3），室温孵育 20 分钟。随后迅速将卵母细胞依次通过三滴各 400 µL 的封闭液，以去除残留去垢剂。 
	注意：9 孔透明玻璃点样板适用于在同一培养皿中对多组样本进行连续处理（步骤 2.4–2.5）。</li>
	<li>在避光、室温的湿盒中进行后续免疫细胞化学操作。可使用内衬湿润纸巾的中型塑料容器，并用铝箔覆盖。</li>
	<li>使用移液装置将卵母细胞转移至 96 孔板盖上的 30 µL 封闭液液滴中，并置于湿盒内孵育 10 分钟。 
	注意：液滴应置于板盖的圆形凹槽内。</li>
	<li>为标记着丝粒和纺锤体，使用移液装置将卵母细胞转移至含抗着丝粒抗原抗体（ACA, Crest）（1:30）和抗乙酰化微管蛋白抗体（1:1000）的 30 µL 封闭液中，孵育至少 1 小时。</li>
	<li>将卵母细胞依次通过三滴各 30 µL 的封闭液，每滴冲洗 10 分钟。</li>
	<li>使用移液装置将卵母细胞转移至含与上述一抗匹配的二抗（抗人 IgG 1:200，抗小鼠 IgG 1:200）的 30 µL 封闭液液滴中，孵育 1 小时。</li>
	<li>重复步骤 2.11 中所述的三次、每次 10 分钟的冲洗步骤，使用 30 µL 封闭液。</li>
	<li>使用移液装置将卵母细胞转移至载玻片上含 DAPI（5.9 µg/µL）的 3–5 µL 封片液中。</li>
	<li>在盖玻片四角各放置一小滴（针尖大小）凡士林，以防止压碎卵母细胞。</li>
	<li>将盖玻片涂有凡士林的一面朝下，轻轻放置于载玻片上。</li>
	<li>用透明指甲油密封盖玻片边缘，并静置 5 分钟使其干燥。</li>
	<li>将载玻片置于 4 °C 避光保存，直至进行共聚焦显微镜观察。 
	注意：确保封片液和盖玻片的折射率与所用显微镜物镜相匹配。推荐使用的封片材料此前已有描述15。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜配备的 40–63 倍物镜对卵母细胞成像，在 z 轴方向以小步长（≤ 1 µm）采集图像，步长设置应与工作物镜匹配，并对整个中期纺锤体区域进行成像。 
	注意：应根据步骤 2.11 中使用的特定二抗，对所有三个通道进行成像。图像平均次数 ≥ 4、放大倍数为 3 时可获得理想的分辨率。1 µm 的步长可清晰显示小鼠卵母细胞中的微管和动粒结构。不同显微镜的图像采集程序可能有所差异，请参考仪器制造商提供的共聚焦用户指南，了解具体设置配置步骤。</li>
	<li>使用成像软件，按照下方步骤 2.21–2.23 判断动粒-微管连接状态。 
	注意：以下步骤以 Image J（NIH）免费下载软件为例进行说明，但也可使用其他成像软件。动粒连接状态的分类此前已有定义16。</li>
	<li>通过将文件拖拽至 Image J 工具栏中打开图像。</li>
	<li>在打开的 z 序列图像中，点击“颜色”子标签下的“图像”下拉菜单中的“合并通道”选项，使所有通道（DNA、动粒、纺锤体）同时可见。</li>
	<li>利用图像底部的切换按钮逐层浏览每个 z 切片，判断动粒与微管的连接状态。详细的连接类型描述此前已有报道16。</li>
</ol>
3. 染色体排列挑战实验
<ol>
	<li>使用第2.3步所述的移液装置，将卵母细胞转移至100 &#181;在无米力农的培养液油下取一滴，将卵母细胞放入其中，并孵育7小时，以使其充分成熟至第一次减数分裂中期（Met I），具体操作如步骤2.3中所述。 17. 
	注：卵母细胞的收集、显微注射及成熟过程此前已有描述 15参考第2.1-2.2步中的附着实验方案，以获取对照组信息和RNA显微注射浓度。</li>
	<li>使用同一移液装置，将卵母细胞转移至含有700 μL的中心井器官培养皿中 &#181;L 培养基中含 monastrol [100 &#181;M] 在中心孔中，400 &#181;L H20，在周围形成环状，37℃孵育 &#176;C，2 小时。</li>
	<li>使用上述移液装置，将卵母细胞依次转移至三滴100 μL液滴中，以洗去monastrol &#181;L CZB 培养基，然后将卵母细胞转移至新的中心井器官培养皿中，其中含有 700 &#181;L 培养基 + MG132 [5 &#181;M] 在中心环中孵育 3 小时。加入 400 &#181;L H20 到外环</li>
	<li>使用移液装置将卵母细胞转移至含有400 μL固定液的透明玻璃多孔板的一个孔中，以固定卵母细胞。 &#181;L 2% 多聚甲醛溶于 PBS，室温孵育 20 分钟。</li>
	<li>固定后，使用移液装置将卵母细胞转移至含有400 μL的透明玻璃多孔板的新孔中 &#181;L 封闭溶液，4 ℃保存 &#176;C，直至进行免疫染色处理。 
	注意：如需在 4 ℃ 下储存卵母细胞 &#176;C，用石蜡膜覆盖玻璃培养皿以防止蒸发。</li>
	<li>通过免疫细胞化学方法对卵母细胞进行透化和标记，具体步骤如2.6-2.16所述。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜配备40-63倍物镜对卵母细胞进行成像，采集 &#60;1 &#181;在z轴平面上进行多步成像，确保完整捕获中期纺锤体的整个区域。</li>
	<li>使用成像软件打开图像文件以确定染色体排列状态。 
	注意：以下步骤使用 Image J（NIH）免费下载软件描述该操作流程，但也可使用其他成像软件。</li>
	<li>将图像拖动到图像 J 控制面板中。</li>
	<li>在打开的z系列图像中，使用点工具（点击Image J控制栏上的点工具图标即可启用），将光标置于图像中每个纺锤体极的末端所在位置，并在相应z切片上点击图像以标记点。通过按键盘上的Command+t，将这些点添加到感兴趣区域（ROI）管理器中。</li>
	<li>通过在 ROI 管理器中高亮显示步骤 3.10 中设定的每个位置的具体点并点击测量按钮，确定各位置的具体坐标。这将生成一个包含每个点 x 和 y 坐标的結果表。这些分别为 X1、Y1 和 X1、Y2 点。</li>
	<li>接下来，确定真实的Z坐标。方法是将识别出纺锤体极的Z层堆栈中特定Z层的层号乘以即 切片 #2（共6个）中每个单独点所处的位置由堆栈厚度决定（即 1 &#181;m) （示例：切片 2 × 1 &#181;m = 2）。这两个点分别为 Z1 和 Z2 点。</li>
	<li>使用勾股定理公式（a2 + b2 = c2) 使用步骤 3.11–3.13 中预先定义的 x、y 和 z 坐标。每个纺锤体的最终长度等于： 
	&#8730;((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>确定纺锤体中区。该位置为纺锤体长度的一半。在 Image J 中使用线条工具，点击 Image J 工具栏中的线条图标，绘制一条从一端纺锤体极至纺锤体中区的直线，长度将显示在 Image J 工具栏中。</li>
	<li>使用线测量工具，通过评估染色体与纺锤体中区之间的距离来确定染色体排列状态。在 Image J 工具栏中点击线形图标启用线工具，从纺锤体中区向染色体绘制一条线，长度将显示在 Image J 工具栏中。距离大于 4 的染色体 &#181;来自纺锤体中区的染色体被视为未排列 18.</li>
</ol>

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<li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
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<li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes%2C+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于与疾病相关的人类基因变异体被迅速且不断发现，建立评估其生物学意义的系统变得至关重要。了解蛋白质在人类减数分裂中的功能面临特殊挑战，因为人类卵母细胞极为珍贵且稀少，而人类精子不适合进行遗传操作。小鼠卵母细胞是一种有价值的哺乳动物模型系统，可用于评估人类减数分裂相关基因的功能10,23。该模型避免了使用人类卵子的不切实际性，同时提供了成本低、易于获取且可操作的卵母细胞来源，这些卵母细胞经历的减数分裂过程与人类生殖细胞相似，有助于理解基因变异如何影响女性生育力。
由于这些方法通过显微注射在小鼠卵母细胞中异源表达人源蛋白，因此首先确定对照用野生型RNA的浓度至关重要，该浓度不应改变减数分裂成熟过程。建议在对照组卵母细胞中监测减数分裂成熟的动力学参数（如核膜破裂、极体排出），以建立基线指标，并评估纺锤体和染色体形态。此外，确保显微注射体积的一致性对于组间比较至关重要。在目的基因上添加荧光标签可简化这一技术难题。掌握卵母细胞显微注射的技术方法已有先前报道<sup class...

不孕症是一种影响约10%-15%育龄人群的疾病1，其中近一半患者会寻求医学治疗2。尽管不孕症的病因多样，且在许多情况下为多因素所致，但人类最常见的遗传异常是胚胎非整倍体3。非整倍体是指细胞中染色体数目出现增加或减少的偏离现象。人类胚胎中的非整倍体现象较为常见，且其发生率随母亲年龄增长而升高4,5。已有四项随机对照试验表明，选择仅染色体正常（整倍体）的胚胎进行子宫移植具有显著优势，该策略可提高胚胎着床率、降低流产率，并缩短实现妊娠所需时间6,7,8,9。因此，深入了解人类非整倍体的病因对于辅助生殖技术具有重要意义。
尽管胚胎植入前非整倍体遗传学检测在不孕症治疗中具有益处，但目前对非整倍体产生机制的全面理解仍然不足。普遍认为，减数分裂非整倍体（在配子形成过程中产生）与母亲年龄之间存在正相关关系，然而，一些女性的胚胎非整倍体发生率与其相应年龄的平均水平存在偏离4。这些情况表明，仅凭年龄并不总能预测产生非整倍体胚胎的风险。其他因素也可能在增加胚胎非整倍体风险中发挥作用，例如基因变异。
研究基因变异在卵母细胞减数分裂过程中对非整倍体形成潜在贡献的一个关键方面，是设计一个能够快速评估减数分裂相关基因功能的系统。由于伦理限制和人类卵子获取困难，使用人卵进行此类实验是不现实的。这一难题可通过使用小鼠卵母细胞来规避，本文描述了一系列用于评估人类基因在减数分裂Ⅰ期功能的实验方法。通过显微注射编码目标基因变异体的信使RNA（mRNA），可在小鼠卵母细胞中观察人类蛋白的定位，并据此判断野生型或突变型人类蛋白的异位表达是否引起可能导致非整倍体的表型改变。这些表型包括连接至姐妹动粒的微管数量增加，以及无法支持减数分裂Ⅰ期中期染色体的正常排列。重要的是，通过建立特定的实验条件以干扰卵母细胞减数分裂中的关键事件（如纺锤体形成和染色体排列），本方案可用于研究功能获得性和功能缺失性基因变异10。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 密封式 PCR 管</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA 标准分子量标记</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 标准分子量标记</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA 上样染料</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9 孔玻璃点滴板</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 标记的抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 标记的抗人 IgG 抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>防震台</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>抗乙酰化微管蛋白抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 稀释</td></tr><tr><td>抗着丝粒（CREST）抗体</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234</td><td>1:30 稀释&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>屏障式（滤芯）移液器吸头</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>确保与所用移液器品牌兼容。这些吸头适用于 Eppendorf 品牌移液器。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Difco 脱水培养基：LB 琼脂，Miller 型（Luria Bertani）</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco 脱水培养基：LB 肉汤，Miller 型（Luria Bertani）</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>中心井式器官培养皿</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO₂ 气瓶</td><td></td><td></td><td>用于培养箱</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>离心机（带制冷功能）</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>任意标准型号&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盖玻片 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>厚度因显微镜型号而异</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>数字干式恒温仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A 高保真克隆酶</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>用于 DNA 克隆&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>线性化 pIVT 质粒所用酶</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>可使用 NdeI 或 KasI</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>可使用任意荧光显微镜</td></tr><tr><td>甲醛（37%）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 RNA 上样染料</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>磨砂载玻片（不带电荷）25×75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>全长 cDNA 克隆</td><td></td><td></td><td>可从任何提供开放阅读框克隆的供应商处获得</td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>pIVT 构建体用珠蛋白正向引物</td><td></td><td></td><td>5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'。&amp;nbsp; 可从任何提供定制寡核苷酸合成服务的公司购买</td></tr><tr><td>pIVT 构建体用珠蛋白反向引物</td><td></td><td></td><td>5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' 可从任何提供定制寡核苷酸合成服务的公司购买</td></tr><tr><td>持卵管</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>湿盒</td><td></td><td></td><td>可用密封盒代替</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR 微珠</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>任意带 CO₂ 和水套控温功能的标准型号</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>Image J（NIH）软件</td><td>NIH</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>96 孔板盖</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>低吸附 0.5 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&amp;nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>序列分析软件</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA 标记物-甲醛&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>米力农</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>用 DMSO 溶解至 2.5 mM</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>仅使用经胚胎测试且无菌过滤的矿物油</td></tr><tr><td>莫那司他醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>用 DMSO 溶解至 100 mM</td></tr><tr><td>吹嘴</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N₂ 气瓶</td><td></td><td></td><td>用于防震台</td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td></td><td></td><td>任意透明指甲油均可使用</td></tr><tr><td>NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X 变性凝胶缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X 电泳缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>器官培养皿 60×15 mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>577773</td><td></td></tr><tr><td>PCR 热循环仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>皮升注射仪</td><td>XenoWorks 数字显微注射仪</td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Flaming-Brown 微电极拉针仪</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT 质粒</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>适用于卵母细胞表达的空载体。</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>用于纯化最多 20 µL 质粒 DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II 定点突变试剂盒</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>200523</td><td>适用于插入和缺失突变的试剂盒</td></tr><tr><td>QuikChange Lightning 多位点定点突变试剂盒</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>210512</td><td>适用于单一位点突变的试剂盒</td></tr><tr><td>剪刀（尖头）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（中号尖头）</td><td>Fine Science Tools</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 mL 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>载玻片加热器</td><td></td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>分光光度计（Nanodrop）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>任意标准型号</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>1 ml，27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine 高产量加帽 RNA 转录试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>镊子（尖头，5 号）</td><td>Fine Science Tools</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 溴化乙锭 10 mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP 紫外/白光透射仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

胚胎非整倍体是人类不孕不育的主要遗传原因。这些事件大多数起源于女性减数分裂过程，尽管与母亲年龄呈正相关，但仅凭年龄并不总能预测产生非整倍体胚胎的风险。因此，基因变异可能导致卵子发生过程中染色体分离错误。由于用于研究的人类卵母细胞获取受限，研究人员建立了一系列实验方法，利用小鼠卵母细胞来研究人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能。首先，将目标基因及其变异体的信使RNA（mRNA）显微注射到停滞在减数分裂Ⅰ期前期的小鼠卵母细胞中。在给予足够表达时间后，同步释放卵母细胞进入减数分裂成熟过程，以完成减数分裂Ⅰ期。通过在mRNA上标记荧光报告基因序列（例如绿色荧光蛋白（Gfp）），除了观察表型变化外，还可评估人类蛋白的定位情况。例如，可通过建立挑战基因产物修复减数分裂错误能力的实验条件，来研究其功能获得或功能缺失效应。尽管该系统在研究人类蛋白于卵子发生期间的功能方面具有优势，但在解释结果时应谨慎，因为蛋白表达水平并非内源性水平，且除非进行对照处理（即敲除或敲低），系统中仍存在小鼠同源蛋白。

之后 体外 转录高质量RNA的A260/A280比值应在1.8–2.2之间，A260/A230比值应≥1.7（使用分光光度计测定）。图中 图1 显示迁移过程 体外在电泳后，通过变性琼脂糖凝胶分析所生成的RNA。若条带呈弥散状，或样品出现多个不同大小的条带，可能提示样本存在污染或降解。此外，多条带现象也可能表明mRNA未完全变性，或起始质粒未完全线性化。由于pIVT载体中含有poly-腺苷酸尾，导致mRNA的迁移速率比预期更大，从而实现mRNA的稳定表达。 体外显微注射后，建议通过荧光显微镜观察以确保注射体积和表达水平的均一性。图中 图2 显示处于减数第一次分裂前期停滞的卵母细胞已均匀注射 Gfp一致的显微注射技术对于本方案至关重要。可使用图像分析软件（如 Image J）验证表达水平，以确保实验的一致性和技术掌握程度。请注意，在进行两种检测的成像时，均可获得亚细胞定位信息。在所有评估...

随着与人类疾病相关的遗传变异逐渐被揭示，开发能够快速评估这些已鉴定变异生物学意义的系统变得日益重要。本方案描述了利用小鼠卵母细胞评估人类基因在女性减数分裂Ⅰ期中功能的方法。

胚胎非整倍性是人类不孕症的主要遗传原因。这些事件大多起源于女性减数分裂，尽管具有正向……

本系列实验的总体目标是利用小鼠卵母细胞研究减数分裂Ⅰ期中人类基因的功能。这些方法有助于回答人类生殖领域中的一些关键问题，例如是否存在导致母源性非整倍体的遗传易感性。该技术的主要优势在于采用小鼠卵母细胞作为哺乳动物减数分裂的模型，鉴于人类卵子难以获取，无法直接用于基因功能研究，因此这一模型具有重要价值。我们最初在对接受过体外受精治疗的女性进行外显子组测序时提出了该方法的想法，这些女性的胚胎非整倍体发生率无法用其母体年龄来解释。对该方法进行可视化演示至关重要，因为图像分析步骤较难掌握，而明确定义严格的分析参数是确保实验严谨性和可重复性的关键。采用经过验证的克隆策略，将目标基因的全长编码序列插入体外转录载体的多克隆位点区域。若需产生单核苷酸多态性或插入缺失突变，请按照文本方案对DNA进行诱变。随后将诱变后的DNA转化至细菌宿主中。根据制造商说明书，使用试剂盒分离并纯化质粒。然后，使用单一限制性内切酶对纯化的DNA进行消化，将最终产物线性化。采用经过验证的DNA纯化流程或试剂盒纯化消化后的产物，并用30微升无RNase/DNase的水洗脱。体外转录：按照制造商的说明书，使用T7聚合酶对DNA进行转录。最后，使用基于硅胶膜离心柱的核酸纯化试剂盒，按照制造商的说明书，将RNA纯化并洗脱于30 µL无RNase/DNase的水中。将卵母细胞均分为若干组，用于显微注射。将一组显微注射实验性mRNA，另一组显微注射野生型对照NPBs或GFP mRNA。使用手动或口控移液装置，其玻璃移液管开口略大于卵母细胞直径，将卵母细胞转移至已覆盖胚胎级矿物油的培养皿中、含100微升无米力农培养基的液滴内。随后，在37摄氏度、5%CO2条件下孵育卵母细胞7小时，以使其充分成熟至减数第一次分裂的中期。孵育后，使用相同的移液装置将卵母细胞转移至中心井式器官培养皿中，其中中心井内含700微升预冷的MEM收集培养基，外圈加入500微升水。将培养皿置于冰上七分钟。将卵母细胞转移至含有400微升含2%多聚甲醛的1x PBS溶液的透明玻璃多孔板孔中，以固定卵母细胞。室温孵育20分钟。按照文本方案中所述进行免疫染色后，使用共聚焦显微镜配备40至63倍物镜对卵母细胞进行成像。在Z轴方向以与所用物镜相匹配的小步距进行采集，完整成像中期纺锤体的整个区域。为确定动粒微管的连接状态，首先通过将文件拖入ImageJ工具栏来打开图像。在打开的Z系列图像中，导航至图像下拉菜单，在Color子选项卡下，单击Merge Channels以使所有通道可见。分析人员必须熟悉小鼠卵母细胞中着丝粒可能存在的附着类型。图像质量将极大影响您对这些数据进行准确分析的能力。使用图像底部的切换按钮，逐层浏览每个Z切片，确定动粒微管的连接情况。使用相同的移液装置，将卵母细胞转移至油下含有100微升不含米力农的培养基的液滴中。将卵母细胞孵育七小时，使其充分成熟至第一次减数分裂的中期，操作方式与之前相同。然后，将卵母细胞转移至中心小室培养皿中，中心小室内含700 µL含有monastrol的培养液，周围环形区域加入400 µL水。在37°C条件下孵育2小时。通过将卵母细胞依次转移至三滴各含100 µL CZB培养液的液滴中，以洗去monastrol。然后将卵母细胞转移至一个新的中心孔器官培养皿中，该培养皿的中心环内含有700 µL添加了蛋白酶体抑制剂的培养液。在外环中加入400 µL水，并在37°C下孵育3小时。接着，将卵母细胞转移至透明玻璃多孔板的一个孔中，孔内含有400 µL含2%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下固定20分钟。使用共聚焦显微镜上的 40 至 63 倍物镜对卵母细胞进行成像，Z 轴步长小于 1 微米，并确保完整成像中期纺锤体的整个区域。为确定染色体排列状态，使用成像软件打开图像文件，然后将图像拖入 ImageJ 控制面板中。在开放的Z系列图像中，使用点工具在各自Z切片的每个纺锤体极末端标记点：将工具置于图像中的纺锤体极位置，然后单击图像。通过同时按下键盘上的Command键和T键，将这些点添加到ROI管理器中。在ROI管理器中高亮选中特定的点，然后点击“测量”按钮，以确定每个设定位置的具体坐标。这将生成一个结果表格，其中包含每个点的 X 和 Y 坐标，分别对应 X1、Y1 和 X1、Y2 点。接下来，确定真实的 Z 坐标。该坐标通过将纺锤极所在 Z 层堆栈中特定 Z 层的层号乘以层厚来计算。这两个点分别为 Z1 和 Z2 点。利用先前定义的 X、Y 和 Z 坐标，通过勾股定理公式计算纺锤体长度。接着，确定纺锤体中区位置。该值计算为纺锤体长度的一半。点击 ImageJ 工具栏中的线条图标，绘制一条从一个纺锤体极到纺锤体中区的直线，长度将显示在 ImageJ 工具栏上。定义严格的染色体排列参数可实现可靠的定量分析，这对于数据的可重复性至关重要。使用线性测量工具，通过评估染色体与纺锤体中区之间的距离来确定染色体的排列状态。点击 ImageJ 工具栏中的线条图标，从纺锤体中区向染色体绘制一条直线。长度将显示在 ImageJ 工具栏上。距离纺锤体中区超过四微米的染色体被视为未对齐。卵母细胞完成免疫染色和成像后，可评估微管动粒连接的正确性。在正常的附着中，二价体的每对姐妹动粒会分别与来自两极的纺锤体微管相连。最多可观察到三种不同类型的异常附着。其中一种异常情况是动粒未与任何微管接触。此外，微管可能发生错误结合，形成同极性或动端连接。同极性连接是指一对姐妹动粒均与来自同一极的微管相连。动端连接则发生在一对姐妹动粒分别与相对两极的微管相连时。卵母细胞从诱导的错位状态恢复后，通过成像评估染色体重新排列的能力。在此示例中，若一个染色体二价体位于距纺锤体中区超过四微米的位置，则被视为错位。在选择适合评估基因变异功能的检测方法时，需注意所研究的人类基因变异体为过表达状态，同时可能需要同时耗尽内源性小鼠同源基因。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如CRISPR-Cas9技术）构建人源化小鼠品系，以回答更多科学问题，例如探究基因变异如何影响卵子和胚胎质量，以及其是否对个体的生殖健康产生影响。该技术建立后，为生殖遗传学领域的研究人员探索人类母源性非整倍体的其他致病因素提供了新的途径。基因的鉴定可能为非整倍体的诊断提供有力工具，并为纠正非整倍体的相关研究奠定基础。感谢观看。祝您的实验顺利。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

小鼠卵母细胞在减数分裂过程中对人类基因功能的评估

本方案阐述了从小鼠输卵管中提取卵母细胞或早期受精胚胎的技术。正确识别漏斗部并将钝端针头插入其中，是成功执行该操作的关键。...

小鼠卵母细胞的获取

卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。...

小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

本文介绍了一种通过特异性siRNA介导的mRNA耗竭，随后进行免疫荧光分析，以评估小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体组装与结构的实验方案。该方案适用于 体外...

通过siRNA介导的沉默技术评估小鼠卵母细胞中的减数分裂纺锤体

固定样品中减数分裂I期前中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞

已知哺乳动物的卵子发生过程容易出错，尤其是由于染色体错误分离所致。本文描述了小鼠减数分裂前期、中期I和中期II阶段卵母细胞的染色质铺展制备方法。这些基础技术可用于研究哺乳动物卵子发生过程中染色质结合蛋白及染色体形态的变化。...

从前期到第二次减数分裂中期的小鼠卵母细胞发育分析用染色质铺展制备方法

本文介绍了一种优化的实验方案，利用近红外飞秒激光在小鼠卵母细胞第一次减数分裂中期实现细胞质微管组织中心的去除。...

小鼠卵母细胞胞质微管组织中心的多光子激光消融

染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。...

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

维持卵母细胞基因组的完整性对于确保胚胎遗传信息的准确性至关重要。本文介绍了一种用于检测哺乳动物雌性生殖细胞中DNA双链断裂的精确方案。...

小鼠卵母细胞中DNA双链断裂的检测

本方案提供了一个实验框架，用于记录细胞骨架对小鼠卵母细胞系统中细胞核形态以及内部无膜细胞器的物理影响。该框架可适用于其他细胞类型和研究背景。...

跨空间尺度捕捉小鼠卵母细胞核由细胞骨架介导的扰动

小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

了解利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂I期功能的方法。该技术通过显微注射和图像分析，帮助研究母体非整倍体的遗传倾向，为生殖健康遗传风险研究提供有效模型。

利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

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