铜绿假单胞菌感染肺内皮细胞后细胞毒性 Amyloids 的检测方法

介绍了用铜绿假单胞菌感染肺内皮后细胞毒性 amyloids 的制备方法。

这种方法可以帮助回答肺病护理领域的关键问题，例如为什么医院获得性肺炎幸存下来的患者长期预后如此差？这种方法的优点是简单可靠，这意味着任何进入实验室的人都可以学习它，第二天他们就会生成有用且可重复的数据。虽然这些分析方法可以应用于深入了解体外培养细胞的感染情况，但它们也可以应用于动物模型和人类患者。

为了产生细胞毒性上清液，用 HBSS 洗涤 150 厘米的内皮细胞培养皿，并在 540 纳米处将铜绿假单胞菌落稀释至 0.25 的吸光度。进一步稀释细菌细胞，以允许 20 毫升 HBSS 中 20 比 1 的感染复数，并将细菌接种到内皮细胞板上。然后将受感染的细胞置于 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中 4 到 5 小时。

细菌和内皮细胞的孵育必须持续适当的时间。如果孵育时间太短，淀粉样蛋白将不会释放到上清液中。如果孵育时间过长，细胞实际上会裂解并将其所有内容物释放到上清液中。

我们用于适当孵育持续时间的指标是在内皮单层中形成间隙。当通过光学显微镜可以在细胞单层中观察到间隙时，收集上清液进行离心以去除任何细胞碎片。将上清液倒入装有 0.2 微米过滤器的注射器中，然后让上清液通过过滤器以去除任何污染细菌。

然后留出 1.5 毫升无菌上清液进行细胞毒性测试，并将样品的其余部分在零下 80 摄氏度下冷冻。为了评估收获的上清液的细胞毒性，将 1.5 毫升等分试样的过滤灭菌上清液加入到含有汇合肺微血管内皮细胞培养物的六孔板的单个孔中。将板置于 CO2 培养箱中 21 至 24 小时。

然后获得处理和对照培养物区域的图像。将图像导入自定义 imagej 宏，并将对比度调整为 15% 饱和像素。复制对比度调整后的图像并使用减去背景来获得视野内完整细胞和间隙区域的高对比度图像。

从原始图像中减去此高对比度图像，然后使用图像计算器和函数将生成的图像与原始图像合并。使用阈值函数将组合图像转换为蒙版，其中间隙为黑色，完整单元格为白色。并使用二进制 erode 函数去除图像中的任何杂色。

然后使用面积分数来测量结果图像中黑色与白色像素的比率。并绘制并表示每个治疗时间点的小数面积，作为最大间隙面积的百分比。为了定量上清液中的淀粉样蛋白，将 20 微升新鲜制备和过滤的 50X 硫黄素 T 储备液添加到 1 毫升分光光度计比色皿中的 1 毫升 PBS 中，然后将稀释的样品加载到荧光分光光度计上。

使用 425 纳米激发测量基线荧光发射。以 2 纳米为增量扫描 450 至 575 纳米的荧光发射。然后将仪器设置为使用 425 纳米激发和 482 纳米发射执行延时扫描，每 0.2 秒采集一次数据，持续 60 秒。

20 秒后暂停扫描，并将 10 μL 过滤灭菌的上清液加入比色皿。倒置混合后，将比色皿重新加载到荧光分光光度计上，并在最后 40 秒内恢复基于时间的扫描。延时拍摄完成后，使用原始扫描设置执行最终荧光发射光谱扫描。

将铜绿假单胞菌添加到肺微血管内皮细胞的汇合层可诱导细胞之间形成间隙。使用 imagej 评估上清细胞毒性，如治疗前 12 小时内所示，仍然健康的融合细胞单层可以可视化为微观视野内的所有白色区域。然而，在加入从 PA 103 感染培养物中收集的上清液后 18 小时，可以检测到单层中的间隙，没有细胞的培养皿面积以线性方式增加，直到处理 36 小时，此时几乎没有观察到完整的细胞。

使用乳酸脱氢酶释放作为细胞毒性的标志物可以获得类似的结果。在加入细胞毒性上清液后 18 小时首次检测到乳酸脱氢酶，并以线性方式增加，直到在 36 小时时测量到最大细胞杀伤率。上清液也可以通过免疫印迹分析或通过测量由于淀粉样蛋白结合诱导的确认变化而导致的硫黄素 T 荧光强度的变化来评估，以确定上清液中细胞毒性淀粉样蛋白的存在。

看完这个视频，你应该有一个很好的理解，在铜绿假胞胎感染内皮细胞后如何产生细胞毒性上清液。此外，您应该精通表征和分析这些上清液中存在的细胞毒素所需的检测类型。