Name: 胶质瘤移植中体内成像的荧光分子层析成像研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学习使用荧光分子层析成像技术建立胶质母细胞瘤临床前成像模型，实现无创实时监测肿瘤动态变化。该方法可定量评估肿瘤生长及治疗反应，为脑肿瘤生物学和癌症研究提供重要工具。

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我们感谢MD安德森癌症中心的Frederick Lang博士提供GBM-PDX神经球。本研究由国家脑肿瘤协会下属的“战胜胶质母细胞瘤研究协作组”（Frank Furnari）、R01-NS080939（Frank Furnari）以及詹姆斯·S·麦克唐纳基金会（Frank Furnari）提供资助；Jorge Benitez 获得了美国脑肿瘤协会（ABTA）奖项的支持；Ciro Zanca 获得了美意癌症基金会博士后研究奖学金的部分资助。Frank Furnari 还获得了路德维希癌症研究所的薪金及额外支持。

使用实验动物和感染性试剂（如用于转导癌细胞的慢病毒）需事先获得机构动物照护项目和机构生物安全委员会的批准。本方案遵循加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的动物照护指南。
1. 使用 FP635 或 FP720 载体标记胶质母细胞瘤细胞
<ol>
	<li>根据 Tiscornia et al.12 描述的方案制备并纯化慢病毒</li>
	<li>在 15 cm 培养皿中，用含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养约 2.0 × 106 个来自人胶质瘤细胞系的细胞；或在 T75 培养瓶中，用 DMEM/F12 1:1 培养基（添加 B27 补充剂以及人重组表皮生长因子（EGF；20 ng/mL）和 FGF（10 ng/mL））培养 2.0 × 106 个人源胶质母细胞瘤（GBM-PDX）类球体。</li>
	<li>将所有细胞维持在 37 °C、5% CO2 和 100% 相对湿度条件下。</li>
	<li>消化细胞。
	<ol>
		<li>对于胶质瘤细胞：吸除培养皿中的上清液，并向细胞中加入 3–5 mL 1× 胰蛋白酶。</li>
		<li>对于 GBM 类球体：用移液器将细胞转移至 15 mL 离心管中。
		<ol>
			<li>在室温下使用台式离心机以 200 × g 离心 5 分钟，使 GBM 类球体沉淀。</li>
			<li>吸除上清液，加入 3–5 mL 细胞解离液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将所有细胞在 37 °C 下孵育 10–15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过反复吹打数次小心地将细胞充分解离（确保类球体和胶质瘤细胞完全解离），然后以 200 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，用 5 mL 培养基反复吹打重悬细胞。通过台盼蓝染色排除法测定细胞活力。</li>
	<li>用移液器将 1.0 × 106 个靶细胞接种至含 5 mL 培养基的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>按照 Tiscornia et al.12 所述方法，以感染复数（MOI）为 5 的慢病毒感染细胞，并在 37 °C 下孵育。</li>
	<li>24 小时后，吸除感染后细胞的培养基，加入 5 mL 新鲜培养基，并在 37 °C 下继续孵育 48 小时。</li>
	<li>按照步骤 1.4–1.6 所述方法将感染后的细胞消化为单细胞悬液。以 200 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 500 µL 分选缓冲液（含 1% FBS 的磷酸盐缓冲液（PBS））重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至流式细胞管中。加入终浓度为 1 µL/mL 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）二盐酸盐共染色以排除死细胞。需设置阴性对照以调节流式细胞仪的设门参数（未感染细胞及未感染细胞/DAPI 染色）。</li>
	<li>按照 Basu et al.13 所述方法，分选荧光阳性/DAPI 阴性的细胞至分选缓冲液中，并将分选后的细胞收集至 15 mL 圆底离心管中。</li>
	<li>以 200 × g 离心 5 分钟使分选后的细胞沉淀，吸除上清液，用 5 mL 培养基重悬细胞。通过移液将细胞接种至 10 cm 培养皿中，在 37 °C 下孵育至少 48–72 小时。</li>
	<li>按照步骤 1.4–1.6 消化分选后的细胞，并接种至多个培养皿中以扩大培养，用于 in vivo 实验。 
	注：有关细胞分选准备与纯化的更多细节，请参见 Basu et al.13</li>
</ol>
2. 将带有 iRFP 标签的胶质母细胞瘤细胞颅内注射至免疫缺陷小鼠
注意：在开始手术前，确保手术室和器械清洁，以满足手术要求。使用4至5周龄、体重17至19克的免疫缺陷型裸鼠（Foxn1nu），无论雄性或雌性，进行颅内注射。动物在到达后应至少饲养3天，方可进行手术。
<ol>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>收获并解离荧光阳性胶质瘤细胞，制成单细胞悬液（步骤 1.4–1.6），每只动物每次注射用 2–5 µL PBS 重悬 0.5 或 1.0 × 106 个细胞。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微离心管中，并置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉准备与给药
	<ol>
		<li>按每 20 克小鼠体重配制含氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的生理盐水溶液 200 µL。称量动物体重，并计算合适的麻醉剂量。</li>
		<li>通过腹腔注射给予麻醉剂，并在眼睛上涂抹眼用软膏以防止脱水。有关此步骤的更多细节，请参见 Kathleen et al.14。将动物置于预热至 37 °C 的水循环加热垫上。</li>
		<li>通过检测脚趾夹捏反应（足底反射）判断动物是否已进入麻醉状态，通常在 5–10 分钟内完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颅内注射
	<ol>
		<li>用细胞悬液填充一支 5 µL Hamilton 注射器（钝头针头），并安装至探针固定架上。</li>
		<li>将小鼠置于小型动物立体定位仪中，使用耳杆和门齿适配器固定头部，具体操作参照 Cetin et al.15 的描述。</li>
		<li>用 70% 乙醇和聚维酮碘溶液对头部进行消毒，确保手术区域完全无菌。使用小型手术刀做正中切口，分离皮肤及结缔组织。</li>
		<li>使用显微操作器将 Hamilton 注射器置于前囟点。</li>
		<li>将探针固定架从前囟点向前后方向移动 1.0 mm，向左右方向移动 2.0 mm。用铅笔标记此位置。</li>
		<li>在此位置，使用手持微型电机钻头，轻轻向下施加压力，在颅骨上小心钻孔，直至可见血管为止。注意不要损伤蛛网膜和脑实质。</li>
		<li>将针头插入钻孔，并向下推进至软脑膜表面以下 3.0 mm 处。</li>
		<li>使用电动立体定位注射仪设定注射体积（2–5 µL）和流速（1 µL/min），或手动完成注射。</li>
		<li>注射完成后，每隔 1 分钟缓慢上提针头 1.0 mm，逐步拔出，并用 70% 乙醇清洁注射部位。</li>
		<li>使用外科钉合器或缝合线（常称为缝线）闭合皮肤切口，更多细节请参见 Kathleen et al.14。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物恢复
	<ol>
		<li>将动物转移至 37 °C 水循环加热垫上，监测其体温、呼吸频率和心率，直至完全恢复。根据标准方案给予镇痛处理。 
		注：有关立体定位操作、手术及坐标位置的更多信息，请参见其他文献5,14,15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. FMT 成像
注意：根据实验目的，可对表达iRFP标记的胶质母细胞瘤细胞进行监测 体内 治疗前、治疗中或治疗后。为进行成像，使用异氟烷诱导室对动物实施麻醉，在扫描过程中将其置于成像盒内，并在FMT成像仪的对接站中进行成像。
<ol>
	<li>将动物从笼中取出，放入异氟烷诱导室。关闭诱导室，开启氧气流和蒸发器，浓度调至3-5%。</li>
	<li>观察动物直至其完全麻醉，通常在1-2分钟内完成。无意识的动物对外界刺激应无反应。</li>
	<li>将已麻醉的动物从诱导室中取出，将其放入成像盒中，先放置头部适配器，然后使动物呈俯卧位。确保头部位于成像盒中心位置。</li>
	<li>盖上成像盒的顶板，并拧紧调节旋钮至17 mm。</li>
	<li>确认动物在成像盒中固定稳妥后，将成像盒插入FMT成像仪的内部对接站，继续通入异氟烷以维持麻醉状态。</li>
	<li>通过双击软件图标启动成像仪和分析软件。</li>
	<li>在&#34;实验标签页&#34;窗口中，选择&#34;数据库&#34;和&#34;研究组&#34;。</li>
	<li>进入&#34;扫描标签页&#34;窗口，点击&#34;选择受试对象&#34;以选定待成像的动物。同时，在&#34;激光通道&#34;面板中选择相应的激光通道。对于FP635标记的细胞，选择&#34;激光通道635 nm&#34;；对于FP720标记的细胞，选择&#34;激光通道680 nm&#34;。</li>
	<li>在&#34;扫描标签页&#34;窗口中点击&#34;采集&#34;选项获取图像。然后，在所采集的图像中点击并拖动扫描区域，设定为特定数量的光源位置，通常同侧设置20-25个光源。</li>
	<li>勾选&#34;添加到重建队列&#34;选项，然后点击&#34;扫描&#34;按钮，位于&#34;扫描标签页&#34;窗口中。</li>
	<li>等待扫描完成后，将成像盒从对接站中取出。</li>
	<li>取下成像盒的顶板，将动物放回笼中。</li>
	<li>对剩余动物重复步骤3.1-3.12。</li>
</ol>
4. 图像分析
<ol>
	<li>从成像仪和分析软件中选择 &#34;分析标签页&#34; 窗口。</li>
	<li>加载数据集和要分析的受试者，方法是单击 &#34;+&#34; 按钮在 &#34;数据集选择&#34; 面板的 &#34;分析标签页&#34; 窗口</li>
	<li>图像加载完成后 &#34;分析标签页&#34; 窗口，在左上角选择椭圆图标，执行感兴趣区域（ROI）分析 &#34;分析标签页&#34; 窗。</li>
	<li>将阈值调整为零 &#34;统计数据&#34; 右键点击面板 &#34;阈值&#34; 柱中的 &#34;分析标签页&#34; 窗口。</li>
	<li>总价值在 &#34;统计数据&#34; 图示为移植到小鼠脑内的荧光标记胶质母细胞瘤细胞所产生的信号。</li>
	<li>对剩余动物重复步骤 4.2–4.4。通过点击加载或更换受试对象 &#34;+&#34; 或“−”按钮 &#34;数据集选择&#34; 面板的 &#34;分析标签页&#34; 窗口。 
	注意：有关FMT成像及软件操作的更多信息，请参见20.</li>
</ol>

<ol><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+Statistical+Report%3A+Primary+Brain+and+Other+Central+Nervous+System+Tumors+Diagnosed+in+the+United+States+in+2009-2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013.</a> Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Stewart, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Utility+of+Patient-Derived+Xenografts+to+Determine+Biomarkers+of+Prognosis+and+Map+Resistance+Pathways+in+EGFR-Mutant+Lung+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+brainstem+tumor+model+using+in+vivo+bioluminescence+imaging+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Child%27s+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat.</a> Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).</li>
<li>Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNyati%2C+S+%22ATM+Kinase%3A+Methods+and+Protocols%22">ATM Kinase: Methods and Protocols</a>. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+assessment+of+regional+directed+delivery+in+a+rodent+malignant+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model.</a> J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).</li>
<li>Badr, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBadr%2C+CE+%22Bioluminescent+Imaging%3A+Methods+and+Protocols%22">Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols</a>. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+proteins+for+multicolor+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging.</a> Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).</li>
<li>Filonov, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li>
<li>Benitez, J. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/ncomms15223">PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3.</a> Nature Communications. 8, 15223(2017).</li>
<li>Kirschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Orthotopic+Glioblastoma+Xenografts+in+Mice+Using+a+Clinical+CT+Scanner%3A+Comparison+with+Micro-CT+and+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology.</a> PLOS ONE. 11 (11), e0165994(2016).</li>
<li>Mannheim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+Small+Animal+Imaging-Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects.</a> Molecular Imaging and Biology. , (2017).</li>
<li>Engblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+remotely+supply+lung+tumors+with+cancer-promoting+SiglecFhigh+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils.</a> Science. 358 (6367), (2017).</li>
<li>Lauber, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+vivo+imaging+techniques+for+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals.</a> Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).</li>
<li>Zanca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+cross-talk+converges+on+NF-%CE%BAB+to+attenuate+EGFR+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity.</a> Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).</li>
<li>Villa, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LXR-Cholesterol+Axis+Creates+a+Metabolic+Co-Dependency+for+Brain+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers.</a> Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+Mutation+Promotes+Glioblastoma+through+Epigenome+and+Transcription+Factor+Network+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling.</a> Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

肿瘤异种移植模型在癌症研究中已被广泛使用，且已发展出多种成熟的成像技术：生物发光成像（BLI）；磁共振成像（MRI）；正电子发射断层扫描（PET）；计算机断层扫描（CT）；荧光分子断层成像（FMT）。这些方法各有优缺点，但在所提供的信息类型上最终可相互补充。其中最常用的方法之一是 在体 成像技术为生物发光成像（BLI）5,6,7,8生物发光成像（BLI）和荧光分子断层成像（FMT）均需要对细胞进行基因工程改造（表达荧光素酶或近红外荧光蛋白），这可能影响基因表达。BLI对微小肿瘤组织更为敏感，但需要腹腔注射底物（腔肠素），该底物在体内达到最大分布需10–12分钟；然而，在图像采集过程中常出现光淬灭和光散射现象，且底物会被快速清除9FMT则不需要向动物额外施加底物，其信号稳定，且不受时间或酶稳定性的影响。此外，在相同实验条...

癌症是工业化国家中人类因疾病致死的主要原因之一。由于死亡率极高，迫切需要开发新的治疗方法。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种极为致命的脑癌，由异质性的脑肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞组成。根据美国脑肿瘤登记中心的数据，原发性恶性与非恶性脑肿瘤的发病率约为每10万人中22例。预计2017年美国将有约11,000例新发病例1。
临床前研究旨在评估药物、操作或治疗方法在人体试验前的有效性可能性。临床前研究中最早的实验室步骤之一是利用植入宿主生物体的癌细胞（定义为人源异种移植模型）来鉴定药物治疗的潜在分子靶点。在此背景下，采用患者来源异种移植（PDX）的颅内脑肿瘤异种移植模型已被广泛用于研究脑肿瘤的生物学特性、进展、演化及治疗反应，近年来还被用于生物标志物开发、药物筛选和个体化医疗2,3,4。
监测颅内异种移植瘤最经济且非侵入性的体内成像方法之一是生物发光成像（BLI）5,6,7,8。然而，BLI的一些局限性包括底物的施用与可获得性、酶的稳定性，以及成像过程中光的淬灭和散射9。本文报道了红外荧光分子断层成像（FMT）作为一种替代成像方法，用于监测临床前胶质母细胞瘤模型。该方法利用FMT成像系统，对颅内植入并表达近红外荧光蛋白iRFP72010,11（下文简称FP720）或turboFP635（下文简称FP635）的患者来源异种移植瘤（PDX）进行信号采集与定量分析。通过FMT技术，可在治疗前、治疗中或治疗后以非侵入性、无需底物且可定量的方式对原位肿瘤进行体内监测，适用于临床前观察。

<table><tbody><tr><td>DMEM/高糖培养基&amp;nbsp;</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30022.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>创新型细胞技术公司</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（Trypsin）</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>人重组 EGF&amp;nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>人重组 FGF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-031-00</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素（Blasticidin）</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>p24 ELISA&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylazine）</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketamine）</td><td>Zoetis</td><td>NADA 043-403</td><td>管制药品</td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Dechron</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>可吸收缝合线</td><td>CpMedical</td><td>VQ392</td><td></td></tr><tr><td>5 µL 注射器</td><td>Hamilton</td><td>26200-U</td><td>由 Sigma-Aldrich 销售的目录号</td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>Sony</td><td>SH8007</td><td></td></tr><tr><td>小鼠立体定位仪&amp;nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>电动立体定位注射器</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>手持式微型电机钻</td><td>Foredom</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>小鼠保温垫&amp;nbsp;</td><td>Ken Scientific Corporation</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>荧光断层成像系统&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT 2500 XL</td><td></td></tr><tr><td>TrueQuant 成像软件&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>7005319</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392049</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 100 mm</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 150 mm</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶 T75</td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-20 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>J320XP-IM-5</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯薄壁离心管，5.0 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯薄壁离心管，38.5 mL，25 × 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>裸鼠（无胸腺裸鼠）</td><td>Charles River Laboratories</td><td>品系编号&amp;nbsp; 490（纯合子）</td><td>需经机构动物护理项目及机构生物安全委员会事先批准。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

致瘤性是指癌细胞形成肿瘤团块的能力。确定细胞是否具有致瘤性的一种常用方法是将癌细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠体内，待肿瘤生长至肉眼可见且可触及后测量其体积。原位注射癌细胞旨在将异种移植瘤植入与所研究肿瘤起源组织最相似的微环境中。脑癌研究需要将癌细胞颅内注射，以允许肿瘤在脑部独特的微环境中形成并进行分析。体内成像技术可实时监测颅内异种移植瘤的肿瘤体积。本文报道了荧光分子断层成像（FMT）在脑肿瘤异种移植模型中的应用。首先用近红外荧光蛋白转导癌细胞，然后将其注射到免疫缺陷小鼠的脑内。随后对动物进行扫描，以在较长时间内获得关于肿瘤体积的定量信息。细胞预标记使得每只小鼠体内肿瘤负荷的量化具有成本效益、可重复性和可靠性。我们无需注射成像底物，从而减少了对动物的应激。该方法的局限性在于无法检测非常微小的肿瘤团块；但对于较大的肿瘤，其分辨率优于其他技术。该方法可用于评估药物治疗效果，或胶质瘤细胞系及患者来源样本的遗传修饰效应。

胶质母细胞瘤细胞U87EGFRvIII（过表达表皮生长因子受体变异体III的U87细胞）按照步骤1.2进行培养。慢病毒根据步骤1.1进行制备和纯化。病毒浓度通过p24 ELISA分析确定。根据步骤1.8，使用携带红外荧光蛋白的慢病毒感染细胞。编码FP72010,11的质粒由V.V. Verkhusha博士惠赠，FP635载体购自商业供应商。靶细胞通过FACS分选，富集荧光最强的前10%细胞群体（图1A）。增强荧光信号可提高荧光断层成像系统的灵敏度。为了在原位移植前验证荧光标记细胞的信号强度，我们使用了FMT成像仪的模拟样品盒。具体而言，将U87EGFRvIII-TurboFP635和U87EGFRvIII-iRFP720细胞用胰蛋白酶消化后，分别将1×105、1×106和1×107个细胞重悬于100 µL冰上预冷的PBS中，并进行分...

肿瘤细胞的原位颅内注射已广泛应用于癌症研究，以探讨脑肿瘤的生物学特性、进展过程、演化规律及治疗反应。本文介绍了肿瘤异种移植模型的荧光分子断层成像技术，该技术可实现临床前胶质母细胞瘤模型中肿瘤组织的实时活体成像与定量分析。

致瘤性是指癌细胞形成肿瘤团块的能力。确定细胞是否具有致瘤性的一种常用方法是通过注射……

本实验方案的总体目标是利用荧光分子断层成像技术（FMT）建立一种临床前脑肿瘤成像模型。该方法有助于回答脑肿瘤生物学、癌症研究以及药物研发领域中的关键问题，例如肿瘤侵袭性、异质性及治疗反应性。该技术的主要优势在于，能够在治疗前、治疗中或治疗后以无创、无需缝合且定量的方式对肿瘤进行活体监测。该技术的另一个优势是可应用于动物不同器官中移植的其他类型异种移植模型。首先，在细胞培养箱中，将一乘以十的六次方个胶质母细胞瘤细胞接种于含有五毫升培养基的十厘米培养皿中，孵育24小时。次日早晨，用慢病毒以感染复数为5的条件转导细胞，该慢病毒表达一种合适的感兴趣荧光蛋白，然后将细胞放回培养箱继续培养。24小时后，将上清液更换为5毫升新鲜培养基，继续培养48小时。培养结束后，在37摄氏度条件下加入3至5毫升胰蛋白酶溶液消化10至15分钟，随后轻轻吹打以充分解离脱落的细胞。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于500微升分选溶液中。将细胞分装至相应数量的离心管中，并使用 DAPI 共同染色以排除死细胞。随后将离心管上机进行流式细胞仪分选，根据荧光表达情况将活细胞分选至含有新鲜分选溶液的 15 毫升锥形管中。离心后，将荧光构建体阳性、DAPI 阴性的细胞重悬于 5 毫升培养基中，并接种至新的 10 厘米培养皿中，在 37 摄氏度条件下培养 48 至 72 小时。孵育结束后，将细胞分种到多个培养皿中，用于后续的体内实验。在注射当天，将表达荧光的胶质瘤细胞消化为单细胞悬液，并在冰上置于1.5毫升微量离心管中，用每2至5微升磷酸盐缓冲液（PBS）含0.5或1×10⁶个细胞的浓度重悬，供每只动物注射使用。确认小鼠对足趾夹捏无反应后，将眼药膏涂抹于免疫缺陷的裸鼠（Athymic Nude recipient mouse）眼部，并用装有钝头针头的5微升Hamilton注射器吸取细胞悬液进行注射。将注射器安装到探针架上，并将小鼠置于小型动物立体定位仪中。使用耳杆和门齿适配器固定头部，并用70%乙醇和碘伏溶液对头部进行消毒。使用小型手术刀做正中切口，并分离皮肤和结缔组织。使用显微操作器，将汉密尔顿注射器置于前囟点，并将探针架从前囟点向前后方向移动一毫米，向左右方向移动两毫米。用铅笔标记位置后，使用手持微型电机钻头小心地在颅骨上钻孔，施加轻微的向下压力，直至血管可见。将针头插入骨孔，深入软脑膜表面下三毫米处，并以每分钟一微升的流速注射细胞。当注射完全部实验细胞体积后，以每分钟一毫米的上升速度逐渐拔出针头，并用70%乙醇清洁注射部位。然后按照标准操作规程闭合皮肤切口，并将动物置于加热垫上监测，直至其完全恢复。为了成像注射的细胞，将麻醉后的受体动物以俯卧位、头部朝前放入荧光分子断层成像仪的成像盒中，使头部位于成像盒的中心。关闭盒盖后，将调节旋钮拧紧至17毫米。固定好动物后，将盒体插入内部对接站，并打开成像仪和分析

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

胶质瘤移植中体内成像的荧光分子层析成像研究

可通过颅内接种在裸鼠体内建立表达荧光素酶的人脑肿瘤异种移植模型，并利用生物发光成像技术对肿瘤生长及治疗反应进行后续监测。结合生存分析，生物发光监测是针对脑肿瘤治疗方案开展临床前研究的重要工具。...

建立颅内脑肿瘤异种移植模型并利用生物发光成像分析肿瘤生长及治疗反应

将GL261细胞颅内植入C57BL/6小鼠可诱导生成恶性胶质瘤，其特征与人类多形性胶质母细胞瘤的多种典型特征相似。我们采用稳定表达荧光素酶的GL261细胞，以便通过体内成像技术监测肿瘤进展过程。本文展示了手术操作及三维体内成像方法。...

颅内植入及后续三维成像 体内 小鼠胶质瘤的生物发光成像

扩散荧光断层成像为临床前研究提供了一种相对低成本且潜在高通量的方法 体内...

小动物中用于癌症生物标志物定位的计算机断层扫描引导时域漫射荧光断层成像

我们介绍一种集成方法，用于将人多形性胶质母细胞瘤细胞精确、立体定向地植入裸鼠脑内，并进行后续系列 体内...

立体定向颅内植入与 体内 多形性胶质母细胞瘤小鼠模型系统中肿瘤异种移植的生物发光成像

在本视频中，我们介绍一种对胶质瘤细胞进行基因工程改造以表达红外荧光蛋白（iRFP）的实验方案。这些带有荧光标记的胶质瘤细胞可用于深层组织成像，以研究脑肿瘤的发生与发展过程。...

胶质瘤细胞的荧光标记：一种基于慢病毒载体转染的方法以获得表达荧光蛋白的胶质瘤细胞用于深层组织成像

在本视频中，我们介绍了用于在小鼠模型中对表达荧光蛋白标记的胶质母细胞瘤异种移植瘤进行活体成像的荧光分子断层成像技术（FMT）。该技术有助于在分子水平上阐明抗肿瘤治疗药物的作用效果。...

荧光分子断层成像：一种用于小鼠模型中荧光蛋白标记的胶质母细胞瘤异种移植体的活体成像技术

来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp.

免疫活性小鼠胶质母细胞瘤模型的生物发光成像

我们建立了小鼠皮层原位胶质母细胞瘤模型，用于活体双光子显微镜观察，该模型可重现肿瘤生长过程中通常存在的生物物理约束条件。通过以慢性玻璃窗替代肿瘤上方的颅骨，可利用双光子显微镜对肿瘤进展进行长期动态追踪。...

一种保留脑实质物理约束并适用于活体双光子显微成像的原位胶质母细胞瘤小鼠模型

GL261 胶质瘤细胞为胶质母细胞瘤提供了一种有用的免疫活性动物模型。本方案旨在演示利用颅内肿瘤生长监测的正确技术 体内...

胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像

在此，我们采用生物发光、X射线以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像技术，研究抑制mTOR活性对异种移植模型中骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的影响。该方法可对靶向骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的治疗手段的抗骨髓瘤效应进行符合生理条件的、无创的和多模态的分析 体内.

NOG小鼠中多发性骨髓瘤骨髓异种移植的多模态生物发光与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。...

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

学习使用荧光分子层析成像技术建立胶质母细胞瘤临床前成像模型，实现无创实时监测肿瘤动态变化。该方法可定量评估肿瘤生长及治疗反应，为脑肿瘤生物学和癌症研究提供重要工具。

荧光分子断层成像技术在体内胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

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荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

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荧光分子断层成像技术在体内胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像