胶质瘤移植中体内成像的荧光分子层析成像研究

该实验程序的总体目标是使用荧光分子断层扫描或 FMT 建立临床前脑肿瘤成像模型。这种方法可以帮助回答脑肿瘤生物学、癌症研究和药物发现领域中关于肿瘤侵袭性、异质性和治疗反应性的关键问题。该技术的主要优点是可以在治疗前、治疗中或治疗后以无创、免缝合和定量的方式在体内监测肿瘤。

该技术的另一个优点是可以应用于植入动物不同器官的其他类型的异种移植模型。首先将 10 乘以 10 至第 6 个胶质母细胞瘤细胞接种到 5 毫升培养基中，放入 10 厘米的培养皿中，在细胞培养箱中孵育 24 小时。第二天早上，用慢病毒转导细胞，在感染倍数为 5 时表达适当的目标荧光蛋白，然后将细胞放回培养箱中。

24 小时后，用 5 mL 新鲜培养基替换上清液，并将培养物再孵育 48 小时。孵育结束时，在 37 摄氏度下用 3 至 5 mL tripson 替换培养基 10 至 15 分钟，然后小心移液以完全解离分离的细胞。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 500 μL 分选溶液中。

将细胞分成适当数量的传真管，并用 DAPI 对细胞进行共染色以排除死细胞。然后将试管装入流式细胞仪上，并根据其荧光构建体表达将活细胞分选到含有新鲜分选溶液的 15 mL 锥形管中。离心后，将构建体阳性、DAPI阴性细胞重悬于 5 mL 培养基中，并将它们接种到一个新的 10 cm 培养皿中，在 37 摄氏度下培养 48 至 72 小时。

在孵育结束时，将用于接种的细胞分成多个培养皿，用于随后的体内实验。在注射当天，将荧光阳性神经胶质瘤细胞解离成单细胞悬液，并以 0.5 或 1 倍的 10 倍重新悬浮于冰上的 1.5 毫升微量离心管中，每次注射 2 至 5 微升 PBS。在确认对脚趾捏没有反应后，将软膏涂抹在免疫缺陷的胸腺裸体受体小鼠的眼睛上，并装入配备钝头针头的 5 微升汉密尔顿注射器中注射细胞。

将注射器安装到探针支架中，并将鼠标放在一个小的动物立体框架中。使用耳杆和门牙适配器固定头部，并用 70% 乙醇和巴他定溶液对头部进行消毒。使用小手术刀，做一个中间切口，将皮肤和结缔组织分开。

使用显微作器，将 Hamilton 注射器放在前囟点上，并将探针支架从前囟点前后移动 1 毫米，横向移动 2 毫米。用铅笔标记位置后，使用微电机手持钻头小心地在颅骨上打一个洞，轻轻向下按压，直到血管可见。将针头引入软脑膜表面下方 3 毫米的钻孔中，并以每分钟 1 微升的流量向右注射细胞。

当注射了全部实验细胞体积后，以每分钟 1 毫米的上升速率逐渐取出针头，并用 70% 乙醇清洁注射部位。然后根据标准方案缝合皮肤伤口，并在加热垫上监测动物，直到它完全恢复。为了对注射的细胞进行成像，将麻醉的受体动物放入荧光分子断层扫描成像仪的成像盒中，头部适配器首先处于俯卧位，头部位于盒的中心。

在暗盒关闭的情况下，将调节旋钮拧紧至 17 毫米。当动物得到保护后，将暗盒插入内部扩展坞并打开成像仪和分析仪软件。在实验选项卡窗口中，选择适当的数据库和研究组，然后打开 scan 选项卡窗口。

单击"选择主体"以选择要图像的主体，然后在"激光通道"面板中选择激光通道。单击 capture 获取图像，然后单击并拖动捕获图像中的扫描字段以识别源位置。选中 add to reconstruction que 选项，然后单击 scan 选项卡窗口中的 scan。

扫描完成后，从扩展坞中取出成像盒，将动物放回笼子并进行监测，直到完全恢复。要分析图像，请在成像仪和分析仪软件中打开分析选项卡窗口，然后单击数据集选择面板中的加号按钮以加载数据集和主题进行分析。然后使用椭球图标选择感兴趣的区域，并右键单击阈值列，以将统计数据面板中的阈值调整为零。

正如刚刚证明的那样，用近红外荧光蛋白标记的胶质母细胞瘤细胞表现出不同的荧光谱，即使在注射后长达 5 天，也可以通过荧光分子断层扫描进行区分。此外，构建体之间缺乏背景信号，有助于对感兴趣的癌细胞群进行双重体内成像。在本实验中，将与编码 SHRNA 靶向死亡结构域相关蛋白的慢病毒共转导的荧光构建体标记的胶质母细胞瘤球体注射到受体免疫缺陷的无胸腺裸鼠中，正如刚刚证明的那样。

逆转录定量初步链反应证实了 SHRNA 靶向癌细胞系的疗效，荧光分子断层扫描显示，与植入 SH 对照转导细胞的动物相比，植入 SHRNA 胶质母细胞瘤球体的小鼠的荧光信号降低。观看此视频后，您应该对如何使用荧光分子断层扫描系统生成脑癌研究的临床前数据有很好的了解。