利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

该方法可通过提供一种直接从滑膜液中纯化间充质干细胞的方案，帮助解决干细胞领域分选流程中的关键问题。本技术的主要优势在于，我们建立了一种简单且经济的从兔滑膜液中分离和纯化磁珠激活细胞分选（MACS）的方案。通常在研究中，由于该方法的应用，我们付出了巨大努力，因为细胞群体的铺板依赖于单细胞悬液的制备。

我们最初产生这一方法的想法，是在注意到目前仅有磁性激活细胞分选法获得了美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床应用。按照文本方案中所述，首先对动物实施麻醉。为从兔膝关节采集关节滑液，需选择膝关节周围约五乘五厘米的区域。

使用安全型电动剃须刀剃除该区域周围的兔毛。或者，用聚维酮碘溶液和75%乙醇对该操作部位消毒三次。待该区域彻底干燥后，铺上无菌洞巾。

从膝关节外侧关节腔使用无菌皮下注射器注入一到两毫升等渗盐水溶液。将膝关节活动三到四次，然后在室温下抽吸全部滑膜液。在四小时内，通过40微米尼龙细胞滤网过滤滑膜液，以去除任何碎屑。

培养兔滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）时，将过滤后的液体收集至50毫升离心管中，在室温下以1,500 rpm离心10分钟。离心后弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀。用完全培养基重悬沉淀后，将细胞悬液接种于100毫升培养皿中。

将培养皿置于含5%二氧化碳的湿润环境中，37摄氏度孵育。48小时后，更换新鲜培养基以去除任何非贴壁细胞。作为第零代传代，每周更换培养基两次，持续两周。

初次接种后14天，培养皿中应已形成大量菌落。选择直径大于2毫米的菌落。通过在培养皿底部描画所选菌落的周长，标记其位置。

使用细胞刮除器弃去直径小于两毫米的克隆。用克隆环将选定的克隆加入约五微升 0.25% 胰蛋白酶进行消化，并将克隆转移至新的培养皿中传代。当细胞融合度达到约 80% 时，吸除培养基。

然后，向每块培养皿中加入一到两毫升的0.25%胰蛋白酶EDTA。将培养皿孵育两到三分钟，以使细胞脱落。待细胞脱落后，加入等量的培养基以中和胰蛋白酶的活性。

将细胞悬液通过40微米细胞滤网，并将滤液收集到15毫升离心管中。然后在室温下以600 × g离心10分钟，沉淀细胞。用MACS缓冲液重悬细胞沉淀。

进行磁性标记时，使用血细胞计数板确定细胞数量。将细胞悬液在4°C条件下以300 × g离心10分钟。彻底吸除上清液后，每一千万个总细胞加入80 µL重悬缓冲液。

对于总共一千万个细胞，加入20微升与单克隆抗兔CD90抗体偶联的微珠。将磁珠与细胞在离心管中充分混匀，然后在4摄氏度避光孵育15分钟。

每一千万个细胞加入一毫升缓冲液至离心管中，然后在4°C条件下以300 × g离心十分钟，以洗涤细胞。离心后弃去上清液。将沉淀物重新悬浮于每一千万个细胞500微升的缓冲液中。

将色谱柱（柱翼朝前）放入磁性分离器的磁场中。每一千万个细胞用500 µL缓冲液冲洗磁性分离柱。将单细胞悬液转移至色谱柱中。

让阴性细胞通过磁场，以弃去这些未标记的细胞。每一千万个细胞用500 µL缓冲液洗涤柱子一到两次，并弃去流出液。将柱子转移至一个15 mL离心管中。

每一千万个细胞向柱中加入一毫升缓冲液。然后立即推动柱塞进入柱中，以冲洗出磁性标记的细胞。使用第二个磁性分离柱重复上述操作，以提高CD90阳性细胞的纯度，从而富集洗脱组分。

将细胞悬液在300 × g离心10分钟，吸去上清液，用培养基重悬沉淀。经磁珠激活的细胞分选后，将细胞接种至100毫升培养皿中。在37 °C、含5% CO₂的湿润细胞培养箱中孵育培养皿。

当原代培养达到约 80% 至 90% 汇合度时（约七至十天），使用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 消化贴壁细胞，并以 1:2 的比例传代，获得第二代细胞。采用相同方法将细胞传至第三代，可用于体外检测。图中显示的是在倒置显微镜下观察的兔滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）在磁珠分选（MACS）前后单层培养的形态。

分选前，贴壁的兔滑膜液细胞群体具有异质性，包含多种细胞类型和大小，如椭圆形、长梭形、短梭形和星形形态。第2代和第6代细胞的主要形态为梭形。

经CD90磁珠分选后，细胞群体表现出均一的形态。传代培养后，细胞数量增加。流式细胞术分析表明，兔滑膜间充质干细胞对间充质干细胞标志物CD44和CD105呈阳性。

尽管对内皮细胞标志物CD34和造血细胞标志物CD45呈阴性，结果表明，在磁珠分选（MACS）前，兔滑膜间充质干细胞（SF-MSC）群体中约含有40%的MSC细胞；经过MACS分选后，富集的细胞群体中MSC细胞比例超过99%。

图中显示了MAC分选前后CD90阳性标志物的流式细胞术分析结果。经茜素红染色表明，在成骨诱导培养三周后形成了矿化结节。经过三周的成脂诱导后，通过细胞内油红O染色检测到富含脂质的空泡积累。

经过三周的软骨诱导后，对细胞团块进行甲苯胺蓝染色的组织学检测。酸性蛋白聚糖阳性表明形成了类软骨细胞。诱导三周后，检测成骨细胞标志物、脂肪生成标志物和软骨生成标志物的相对mRNA表达水平。

掌握该技术后，可在两到四小时内完成操作。观看本视频后，您应能充分理解如何直接分离并纯化新西兰白兔滑膜液中的间充质干细胞。在进行该操作时，需特别注意选择直径大于两毫米的菌落。

在进行免疫磁珠分选前，也需制备单细胞悬液，因为附着在标记细胞上的非目标细胞会随磁珠保留下来。完成此步骤后，可进一步采用其他方法，如荧光激活细胞分选，以探讨间充质干细胞纯化过程的安全性与有效性等更多科学问题。该技术建立后，为关节软骨再生领域的研究人员探索用于关节软骨修复的理想CD细胞提供了重要基础。

请注意，所有操作均在拱形冷却台进行，执行该实验步骤时应始终采取佩戴手套等防护措施。该技术的应用意义在于关节软骨损伤的治疗，因为来源于滑膜液的MASC是关节软骨再生的潜在理想候选细胞。