Name: 从兔模型中分离纯化滑液源性间充质干细胞的磁活化细胞分选策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解利用磁活化细胞分选技术从新西兰白兔滑液中分离纯化间充质干细胞的经济高效方案。该方法为干细胞研究领域提供了一种简便可靠的细胞纯化策略，适用于软骨再生等临床应用研究。

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本研究获得以下基金资助：国家自然科学基金（编号 81572198；编号 81772394）；深圳大学高水平医学学科建设基金（编号 2016031638）；中国广东省医学科研基金（编号 A2016314）；深圳市科技计划项目（编号 JCYJ20170306092215436；编号 JCYJ20170412150609690；编号 JCYJ20170413161800287；编号 SGLH20161209105517753；编号 JCYJ20160301111338144）。

所有动物实验均遵循地区伦理委员会指南进行，且所有动物操作均获得深圳大学深圳第二人民医院机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 分离并培养 rbSF-MSCs
<ol>
	<li>动物实验前准备
	<ol>
		<li>准备骨骼成熟的雌性新西兰白兔用于采集兔滑膜液间充质干细胞（rbSF-MSCs）。在麻醉和关节穿刺操作前一天对兔子进行临床检查。 
		注：体格检查应包括体重（2.0 - 2.5 kg）、性别（雌性）、体温、呼吸频率和心率。健康兔的临床参数范围为：呼吸频率30 - 50次/分钟，心率220 - 280次/分钟，体温38 - 39 °C。</li>
		<li>在麻醉前禁食6小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物麻醉的准备与操作
	<ol>
		<li>使用笼具固定兔子（见材料表），然后通过耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，剂量为1 mL/kg，以实现全身麻醉。</li>
		<li>将兔子置于舒适的仰卧位。</li>
		<li>在麻醉过程中监测兔子的呼吸频率、心率和体温。</li>
		<li>使用眼科软膏涂抹眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。</li>
		<li>根据Guedel分类法14评估麻醉深度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>间充质干细胞分离与培养的准备
	<ol>
		<li>为培养rbSF-MSCs，准备500 mL商业培养基（见材料表），添加10%商业补充剂（见材料表）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。</li>
		<li>将培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
		<li>准备500 mL磷酸盐缓冲液（PBS），用于细胞分离和洗涤。</li>
		<li>准备100 mL等渗盐水溶液，用于膝关节腔穿刺操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从兔膝关节采集关节滑膜液
	<ol>
		<li>选择膝关节周围约5 x 5 cm的区域，使用安全型电动剃毛器剃除该区域的兔毛。</li>
		<li>依次使用聚维酮碘溶液和75%乙醇对操作部位消毒3次。待区域完全干燥后，覆盖无菌洞巾。</li>
		<li>使用无菌皮下注射器（2 mL）向膝关节腔的外侧关节间隙注入1 - 2 mL等渗盐水溶液，活动膝关节3 - 4次，然后在室温下抽出全部滑膜液。</li>
		<li>在4小时内通过40 µm尼龙细胞滤网过滤滑膜液，以去除任何碎片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>rbSF-MSCs的培养
	<ol>
		<li>将过滤后的液体收集至50 mL离心管中，在室温下以1,500 rpm离心10分钟。</li>
		<li>离心后弃去上清液，用PBS洗涤沉淀，加入完全培养基重悬细胞，然后接种至100 mm培养皿中。</li>
		<li>将培养皿置于含5% CO2的湿润环境中，37 °C培养。</li>
		<li>48小时后更换新鲜培养基，以去除未贴壁细胞。此后每周换液两次，持续2周，此阶段为第0代（P0）。 
		注：应获得约1 × 104个贴壁细胞。滑膜液中每毫升活细胞数约为2 × 102/mL。</li>
		<li>初次接种后14天，培养皿中应形成多个细胞集落。选择直径大于2 mm的集落，并通过在培养皿底部描记其轮廓标记所选集落的位置。</li>
		<li>使用细胞刮除器弃去直径&#60; 2 mm的集落。用克隆环和约5 µL的0.25%胰蛋白酶消化所选集落，并将其转移至新的培养皿中，作为第1代（P1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后动物护理
	<ol>
		<li>遵循机构标准操作规程进行术后监测及麻醉恢复。</li>
		<li>每10分钟监测一次兔子的生命体征，直至其恢复意识。最后将清醒的动物转移回笼中。手术后的兔子在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。</li>
		<li>术后每天使用0.1%聚维酮碘消毒穿刺部位两次，持续3天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 兔滑膜间充质干细胞及原代培养物的CD90阳性磁珠激活细胞分选（MACS）
<ol>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>当细胞生长至约80%融合度时，吸除培养基，然后向每皿中加入1 - 2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
		<li>将培养皿置于37 °C孵育2 - 3分钟，以促进细胞脱落。</li>
		<li>待细胞完全脱落之后，加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
		<li>将细胞悬液通过40 µm细胞筛网过滤，滤液收集至15 mL离心管中，随后在室温下以600 × g离心10分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>用MACS缓冲液（PBS，pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白和2 mM EDTA）重悬细胞沉淀，并计数细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性标记 
	注意：使用磁性激活细胞分选试剂盒（包含分选柱、支架和分离器）对兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSCs）进行分选（参见材料表）。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板确定细胞数量。</li>
		<li>在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃去上清液。</li>
		<li>每107个总细胞加入80 µL重悬缓冲液。</li>
		<li>每107个总细胞加入20 µL偶联单克隆抗兔CD90抗体的磁珠。</li>
		<li>将磁珠与细胞充分混匀后，于4 °C避光孵育15分钟。</li>
		<li>每107个细胞向管中加入1 mL缓冲液，然后在4 °C以300 × g离心10分钟洗涤细胞。离心后弃去上清液。</li>
		<li>每107个细胞用500 µL缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性分离
	<ol>
		<li>将分选柱有翼一侧朝前插入磁性分离器的磁场中。</li>
		<li>用每107个细胞500 µL的缓冲液冲洗磁性分离（MS）分选柱。</li>
		<li>将单细胞悬液转移至分选柱中，让未标记的阴性细胞流过分选柱并弃去。</li>
		<li>用每107个细胞500 µL的缓冲液洗涤分选柱1 - 2次，弃去流出液。</li>
		<li>将分选柱转移至一个15 mL离心管中。</li>
		<li>每107个细胞向分选柱中加入1 mL缓冲液，立即推动推杆，将磁性标记的细胞洗脱下来。</li>
		<li>使用第二个MS分选柱重复上述步骤，以提高CD90+细胞的纯度，从而富集洗脱组分。</li>
		<li>将细胞悬液以300 × g离心10分钟，吸除上清液，用完全培养基重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CD90+ rbSF-MSCs的培养
	<ol>
		<li>磁性激活细胞分选后，将细胞接种于100 mm培养皿中。</li>
		<li>将培养皿置于37 °C、含5% CO2的湿润化细胞培养箱中孵育。</li>
		<li>当原代培养细胞达到80 - 90%融合度时（约7 - 10天），使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞，并按1:2比例传代，获得第2代细胞（P2）。</li>
		<li>采用相同方法将细胞传至第3代（P3），可用于后续体外实验。 
		注意：经过传代与纯化后，可获得约1 × 107个rbSF-MSCs。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. rbSF-MSCs 的鉴定
<ol>
	<li>通过流式细胞术对兔骨髓间充质干细胞（rbSF-MSCs）的表面标志物进行鉴定
	<ol>
		<li>当P3代MSCs融合度达到80%–90%时，用PBS洗涤细胞，并加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA处理。随后，于37 °C孵育2–3分钟，直至细胞脱落。</li>
		<li>使用10 mL PBS收集细胞，转移至15 mL锥形管中，在室温下以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液。将细胞沉淀重悬于500 µL PBS中，并转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>在4 °C避光孵育FITC偶联和PE偶联抗体（同型对照、FITC-CD34/PE-CD45、FITC-CD105/PE-CD44）1:100稀释液1小时。</li>
		<li>将该混合物在室温下以300 × g离心5分钟，并用PBS洗涤细胞两次，每次均以300 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于500 µL PBS中，转移至圆底试管（5 mL），并用流式细胞仪进行分析。 
		注意：使用配备两个荧光通道（533/30 和 585/40）的流式细胞仪获取数据。针对每种同型荧光，利用同型对照调整相应的激光电压，并设定最低强度，以获得能同时显示峰左侧和右侧边缘的荧光直方图。每样本至少采集 10,000 个事件用于统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>rbSF-MSCs的多向分化 
	注意：使用第3代rbSF-MSCs进行实验 体外 多向分化检测
	<ol>
		<li>成骨分化
		<ol>
			<li>制备成骨诱导培养基：含50 mM L-抗坏血酸-2-磷酸、10 mM α-甘油磷酸钠和100 nM 地塞米松的DMEM基础培养基（1x）。</li>
			<li>以每孔10个细胞的密度接种细胞3 细胞/厘米2 在6孔组织培养板中培养细胞，并加入成骨诱导培养基。</li>
			<li>每3天更换一次诱导培养基，持续3周。</li>
			<li>分化完成后，在室温下用 4% 甲醛固定细胞 30 分钟，用 1% 茜素红染色 5 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次15.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>脂肪细胞分化
		<ol>
			<li>配制成脂诱导培养基：含100 mM吲哚美辛、10 mg/mL重组人胰岛素、1 mM地塞米松和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的DMEM基础培养基（1x）。</li>
			<li>将P3代rbSF-MSCs在成脂诱导培养基中培养3周。</li>
			<li>3周后，使用油红O染色中性脂质空泡以确认成脂分化。在室温下用4%甲醛溶液固定细胞30分钟，然后用PBS洗涤3次。16.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>软骨形成分化
		<ol>
			<li>制备软骨诱导培养基：含10 ng/mL TGFβ1、1% ITS添加剂、0.35 mM L-脯氨酸、100 nM 地塞米松、50 mM L-抗坏血酸-2-磷酸和1 mM 丙酮酸钠的DMEM基础培养基（1x）。</li>
			<li>使用团块培养法进行软骨诱导。离心5×10⁵细胞。5 在聚丙烯管（15 mL）中以1500 rpm离心10分钟，使第3代rbSF-MSCs形成沉淀。</li>
			<li>将沉淀物在软骨诱导培养基中培养3周。</li>
			<li>每3天更换一次培养基，持续3周。</li>
			<li>经过3周诱导后，将细胞沉淀用石蜡包埋，切成4 mm切片，并在室温下用0.1%甲苯胺蓝染色30分钟17.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>总RNA提取及定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析
	<ol>
		<li>使用商用RNA提取试剂盒（参见 材料表).
		<ol>
			<li>移去培养皿中的培养基，然后加入1 mL分离试剂。</li>
			<li>通过反复吹打裂解细胞，直至溶液呈均一状态。室温孵育3分钟。</li>
			<li>将细胞裂解液转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
			<li>加入100 µL氯仿，手动振荡15次，室温孵育3 min。</li>
			<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
			<li>加入500 µL异丙醇，在室温下沉淀RNA 10分钟。</li>
			<li>在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。RNA 沉淀应可见于管底。</li>
			<li>移去上清液，然后加入 500 µL 75% 乙醇。短暂离心数秒以洗涤 RNA 沉淀。在 4 °C 条件下，于 7,500 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>去除残留的乙醇。</li>
			<li>将RNA沉淀溶解于10 µL的DEPC水中，将离心管置于冰上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用DNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA（参见 材料表). 
		注意：以下所有步骤均需在冰上操作。
		<ol>
			<li>配制反转录主混合液。</li>
			<li>向每管加入25 µL经DNase处理的RNA，使每管含1 µg RNA。</li>
			<li>使用PCR扩增仪将混合物在以下温度孵育：26 °C孵育10分钟（使随机六聚体退火），42 °C孵育45分钟（逆转录），75 °C孵育10分钟（灭活逆转录酶）。</li>
			<li>立即通过定量实时 PCR 分析所得 cDNA，或将其保存于 -20 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用定量实时PCR系统进行基因表达分析。
		<ol>
			<li>使用qRT-PCR预混液（参见 材料表) 进行 PCR。GAPDH、Runx2、Agg 和 PPARγ 的 PCR 引物序列如下所示： 表1.</li>
			<li>使用2⁻ΔΔCt法计算基因表达量−ΔΔCT 方法</li>
			<li>使用标准统计软件进行统计分析。采用独立样本 t 检验比较组间均值。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

滑膜液中存在间充质干细胞（MSCs），为基于细胞的治疗提供了另一种选择。既往研究表明，损伤部位滑膜液中的间充质干细胞含量更高，这可能与损伤后的时期呈正相关5。滑膜液中的MSCs可能有助于促进损伤后的自发性组织修复18,19。关于滑膜液间充质干细胞（SF-MSCs）的临床应用，文献报道较少，主要原因是SF-MSCs在关节内的作用机制尚未明确20。Jones et al.21 报道，在骨关节炎（OA）早期，膝关节内人源滑膜液间充质干细胞（hSF-MSCs）的数量显著增加7倍。他们认为，增多的SF-MSCs可能有助于维持关节的生理稳态。
理想的动物模型是利用再生医学和转化医学开发治疗方法过程中不可或缺的工具。尽管人类与兔子之间存在明显差异，兔子仍被广泛用作组织再生研究的动物模型...

间充质干细胞（MSCs）被认为在再生医学中具有重要价值，尤其适用于软骨损伤的治疗。MSCs具有较高的扩增能力和多向分化潜能，可分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞以及内脏间质细胞，从而大大拓展了干细胞移植的应用范围1。MSCs可从骨骼肌、滑膜、骨髓和脂肪组织中分离获得2,3,4。研究结果还证实了滑膜液中存在MSCs，既往研究已将滑膜液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）确认为关节再生的潜在理想候选细胞5,6。
然而，针对人类样本的研究和临床前实验面临诸多伦理问题。相比之下，兔子一直是并且继续是最常用于证明间充质干细胞（MSCs）移植能够修复软骨损伤的动物物种。近年来，越来越多的研究人员对兔源间充质干细胞（rbMSCs）进行了研究 体外 和 在体，因为这些细胞在细胞生物学和组织生理学方面与人类间充质干细胞（MSCs）相似。同样，兔间充质干细胞（rbMSCs）能够贴附于塑料表面，并呈现类似于人类MSCs的纺锤形成纤维细胞形态。此外，兔源间充质细胞样本易于获取且操作简便7此外，最关键的要点是rbMSCs表达表面标志物（如CD44、CD90和CD105），并保留多向分化潜能，这与国际细胞治疗学会（International Society for Cellular Therapy）定义的间充质干细胞群体鉴定标准一致。8,9特别是，在TGF-β1诱导下，滑膜液中的软骨祖细胞能够进行非肥大性软骨形成，因此可作为表型稳定的关节软骨再生的适宜细胞来源10,11,12.
然而，滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）的分离方法与其他组织（如脐带、脂肪组织、外周血和骨髓）存在显著差异。目前，用于SF-MSCs纯化和分选的最常用方法是流式细胞术和基于免疫磁珠的分选技术，尽管流式细胞术需要特定的环境和昂贵的仪器设备13。
本文介绍了一种从新西兰白兔中简单且微创采集关节滑液样本的方法。在该操作过程中，兔滑膜液间充质干细胞（rbSF-MSCs）可实现稳定扩增 体外 然后采用基于CD90阳性磁珠的方法进行分离。最后，该方案展示了如何从获取的细胞来源中获得高纯度和高活力的间充质干细胞。
在本实验方案中，分离得到的兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSCs）通过其形态学特征、特定标志物的表达以及干细胞多能性进行表征。基于流式细胞术的免疫表型分析显示，CD44和CD105呈显著阳性表达，而CD45和CD34则为阴性表达。最后，一项 体外 rbSF-MSCs 的检测显示了这些细胞的成骨、成脂和成软骨分化能力。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>使用前在37 &amp;deg;C水浴中预热</td></tr><tr><td>MesenGro Supplement</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>间充质干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>间充质干细胞分化培养基</td></tr><tr><td>等渗盐溶液</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>关节腔穿刺术试剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS，不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>间充质干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Guangdong, China</td><td>150605</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>75%乙醇</td><td>Lircon, china</td><td>170917</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>1%青霉素-链霉素</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>间充质干细胞培养基组分</td></tr><tr><td>MACS Running Buffer</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>含磷酸盐缓冲液（PBS）、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA</td></tr><tr><td>CD90抗体偶联微珠</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>用于磁性激活细胞分选</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>间充质干细胞软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>间充质干细胞成骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%，间充质干细胞软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0.35 mM，间充质干细胞软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM，间充质干细胞软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0.5 mM，脂肪分化培养基组分</td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM，脂肪分化培养基组分</td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL，间充质干细胞软骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-甘油磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>间充质干细胞成骨分化培养基组分</td></tr><tr><td>CD34多克隆抗体，FITC标记</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>造血干细胞标志物</td></tr><tr><td>兔抗小鼠CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1膜糖蛋白（间充质干细胞标志物）</td></tr><tr><td>CD45（单克隆抗体）</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>造血干细胞标志物</td></tr><tr><td>CD105抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>间充质干细胞标志物</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>沉淀RNA提取中的有机相</td></tr><tr><td>三氯甲烷</td><td>Wenge, China</td><td>61553</td><td>提取总RNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>分离总RNA</td></tr><tr><td>SYBR Green预混液</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR420A</td><td>PCR检测</td></tr><tr><td>cDNA合成试剂盒</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR047A</td><td>逆转录为互补DNA</td></tr><tr><td>茜素红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>钙化合物染色</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>软骨组织染色</td></tr><tr><td>油红O溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>脂质空泡染色</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS分离器</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>用于磁性激活细胞分选</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>用于磁性激活细胞分选</td></tr><tr><td>MS柱</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>用于磁性激活细胞分选</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &amp;mu;m尼龙</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>细胞培养皿</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNA提取和PCR</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>γ射线灭菌</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>离心细胞</td></tr><tr><td>二氧化碳细胞培养箱</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR仪</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>实时定量聚合酶链式反应</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>细胞分析仪</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>液体转移</td></tr><tr><td>克隆环</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>分离并挑选单个细胞克隆</td></tr><tr><td>无菌皮下注射器</td><td>Double-Dove, China</td><td>131010</td><td>关节腔穿刺术操作</td></tr><tr><td>兔笼</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>固定兔子</td></tr></tbody></table>

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

间充质干细胞（MSCs）是细胞治疗的主要细胞来源。来源于关节腔滑液的间充质干细胞有望用于软骨组织工程。滑液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）被认为是关节再生的潜在理想候选细胞，其潜在的治疗价值使其成为近期重要的研究课题。来源于新西兰白兔膝关节腔的SF-MSCs可作为优化的转化医学模型，用于评估人类再生医学。通过基于CD90的磁性激活细胞分选（MACS）技术，本方案成功地从该兔模型中分离获得兔滑液间充质干细胞（rbSF-MSCs），并进一步通过诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化，全面验证了这些细胞的MSC表型。因此，该方法可利用简单的设备和操作流程，应用于细胞生物学研究和组织工程领域。

兔骨髓间充质干细胞的分离、纯化与培养 
本方案采用磁珠分选技术（MACS），根据间充质干细胞表面标志物CD90的表达情况分离兔滑膜间充质干细胞（rbSF-MSCs）。兔滑膜间充质干细胞的分离、纯化及鉴定流程示意图以及 体外 培养方案如图所示 图1.
使用 CD90 进行磁性激活细胞分选（MACS）后的细胞形态： 
首先，进行 MACS 时，用 CD90 磁珠对间充质干细胞（MSCs）进行免疫标记。离心后，将最多 107 个细胞重悬于 80 µL 预冷的分选缓冲液中，然后加入 20 µL CD90 磁珠，涡旋混匀，并在 4 °C 下孵育 15 分钟。随后，用 1 mL 分选缓冲液洗涤细胞，并将细胞重悬于 500 µL 分选缓冲液中。在进行磁性分选前，重复一次洗涤步骤。这一关键步...

本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。

间充质干细胞（MSCs）是基于细胞治疗的主要细胞来源。来源于关节腔滑液的间充质干细胞可能可用于……

该方法可通过提供一种直接从滑膜液中纯化间充质干细胞的方案，帮助解决干细胞领域分选流程中的关键问题。本技术的主要优势在于，我们建立了一种简单且经济的从兔滑膜液中分离和纯化磁珠激活细胞分选（MACS）的方案。通常在研究中，由于该方法的应用，我们付出了巨大努力，因为细胞群体的铺板依赖于单细胞悬液的制备。我们最初产生这一方法的想法，是在注意到目前仅有磁性激活细胞分选法获得了美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床应用。按照文本方案中所述，首先对动物实施麻醉。为从兔膝关节采集关节滑液，需选择膝关节周围约五乘五厘米的区域。使用安全型电动剃须刀剃除该区域周围的兔毛。或者，用聚维酮碘溶液和75%乙醇对该操作部位消毒三次。待该区域彻底干燥后，铺上无菌洞巾。从膝关节外侧关节腔使用无菌皮下注射器注入一到两毫升等渗盐水溶液。将膝关节活动三到四次，然后在室温下抽吸全部滑膜液。在四小时内，通过40微米尼龙细胞滤网过滤滑膜液，以去除任何碎屑。培养兔滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）时，将过滤后的液体收集至50毫升离心管中，在室温下以1,500 rpm离心10分钟。离心后弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀。用完全培养基重悬沉淀后，将细胞悬液接种于100毫升培养皿中。将培养皿置于含5%二氧化碳的湿润环境中，37摄氏度孵育。48小时后，更换新鲜培养基以去除任何非贴壁细胞。作为第零代传代，每周更换培养基两次，持续两周。初次接种后14天，培养皿中应已形成大量菌落。选择直径大于2毫米的菌落。通过在培养皿底部描画所选菌落的周长，标记其位置。使用细胞刮除器弃去直径小于两毫米的克隆。用克隆环将选定的克隆加入约五微升 0.25% 胰蛋白酶进行消化，并将克隆转移至新的培养皿中传代。当细胞融合度达到约 80% 时，吸除培养基。然后，向每块培养皿中加入一到两毫升的0.25%胰蛋白酶EDTA。将培养皿孵育两到三分钟，以使细胞脱落。待细胞脱落后，加入等量的培养基以中和胰蛋白酶的活性。将细胞悬液通过40微米细胞滤网，并将滤液收集到15毫升离心管中。然后在室温下以600 × g离心10分钟，沉淀细胞。用MACS缓冲液重悬细胞沉淀。进行磁性标记时，使用血细胞计数板确定细胞数量。将细胞悬液在4°C条件下以300 × g离心10分钟。彻底吸除上清液后，每一千万个总细胞加入80 µL重悬缓冲液。对于总共一千万个细胞，加入20微升与单克隆抗兔CD90抗体偶联的微珠。将磁珠与细胞在离心管中充分混匀，然后在4摄氏度避光孵育15分钟。每一千万个细胞加入一毫升缓冲液至离心管中，然后在4°C条件下以300 × g离心十分钟，以洗涤细胞。离心后弃去上清液。将沉淀物重新悬浮于每一千万个细胞500微升的缓冲液中。将色谱柱（柱翼朝前）放入磁性分离器的磁场中。每一千万个细胞用500 µL缓冲液冲洗磁性分离柱。将单细胞悬液转移至色谱柱中。让阴性细胞通过磁场，以弃去这些未标记的细胞。每一千万个细胞用500 µL缓冲液洗涤柱子一到两次，并弃去流出液。将柱子转移至一个15 mL离心管中。每一千万个细胞向柱中加入一毫升缓冲液。然后立即推动柱塞进入柱中，以冲洗出磁性标记的细胞。使用第二个磁性分离柱重复上述操作，以提高CD90阳性细胞的纯度，从而富集洗脱组分。将细胞悬液在300 × g离心10分钟，吸去上清液，用培养基重悬沉淀。经磁珠激活的细胞分选后，将细胞接种至100毫升培养皿中。在37 °C、含5% CO₂的湿润细胞培养箱中孵育培养皿。当原代培养达到约 80% 至 90% 汇合度时（约七至十天），使用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 消化贴壁细胞，并以 1:2 的比例传代，获得第二代细胞。采用相同方法将细胞传至第三代，可用于体外检测。图中显示的是在倒置显微镜下观察的兔滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）在磁珠分选（MACS）前后单层培养的形态。分选前，贴壁的兔滑膜液细胞群体具有异质性，包含多种细胞类型和大小，如椭圆形、长梭形、短梭形和星形形态。第2代和第6代细胞的主要形态为梭形。经CD90磁珠分选后，细胞群体表现出均一的形态。传代培养后，细胞数量增加。流式细胞术分析表明，兔滑膜间充质干细胞对间充质干细胞标志物CD44和CD105呈阳性。尽管对内皮细胞标志物CD34和造血细胞标志物CD45呈阴性，结果表明，在磁珠分选（MACS）前，兔滑膜间充质干细胞（SF-MSC）群体中约含有40%的MSC细胞；经过MACS分选后，富集的细胞群体中MSC细胞比例超过99%。图中显示了MAC分选前后CD90阳性标志物的流式细胞术分析结果。经茜素红染色表明，在成骨诱导培养三周后形成了矿化结节。经过三周的成脂诱导后，通过细胞内油红O染色检测到富含脂质的空泡积累。经过三周的软骨诱导后，对细胞团块进行甲苯胺蓝染色的组织学检测。酸性蛋白聚糖阳性表明形成了类软骨细胞。诱导三周后，检测成骨细胞标志物、脂肪生成标志物和软骨生成标志物的相对mRNA表达水平。掌握该技术后，可在两到四小时内完成操作。观看本视频后，您应能充分理解如何直接分离并纯化新西兰白兔滑膜液中的间充质干细胞。在进行该操作时，需特别注意选择直径大于两毫米的菌落。在进行免疫磁珠分选前，也需制备单细胞悬液，因为附着在标记细胞上的非目标细胞会随磁珠保留下来。完成此步骤后，可进一步采用其他方法，如荧光激活细胞分选，以探讨间充质干细胞纯化过程的安全性与有效性等更多科学问题。该技术建立后，为关节软骨再生领域的研究人员探索用于关节软骨修复的理想CD细胞提供了重要基础。请注意，所有操作均在拱形冷却台进行，执行该实验步骤时应始终采取佩戴手套等防护措施。该技术的应用意义在于关节软骨损伤的治疗，因为来源于滑膜液的MASC是关节软骨再生的潜在理想候选细胞。

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从兔模型中分离纯化滑液源性间充质干细胞的磁活化细胞分选策略

从大鼠股骨和胫骨中分离出MSCs，并通过磁性细胞分选进行富集。通过流式细胞术确认分选细胞表面标志物的表达。这些细胞还在克隆密度下培养以形成单个克隆，然后使用克隆环分离这些克隆。...

大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离与富集及单克隆来源MSCs的分离

介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。...

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

本方案描述了一种通过酶消化、密度梯度分离、贴壁筛选以及CD146+磁珠分选技术，从大鼠中分离获取原代肺组织驻留型间充质基质细胞的方法。...

从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞

我们介绍了从鼠类腹股沟（皮下）和性腺周围（内脏）脂肪组织库中分离基质血管组分（SVF）的技术，以评估其基因表达和胶原酶活性。该方法包括利用免疫磁珠细胞分离技术富集Sca1high脂肪来源干细胞（ASCs）。...

脂肪库特异性Sca1high 脂肪源性干细胞（ASCs）的免疫磁珠分离

建立从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞（MSCs）的方案，其中样本通过注射器抽吸无创采集。细胞分离后，采用流式细胞术进行细胞表型分析。 体外...

从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞及其细胞表型分析

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。...

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

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通过三维生物反应器培养大规模制备滑膜液间充质干细胞来源外泌体

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从小鼠关节炎组织中分离和培养原代滑膜巨噬细胞与成纤维细胞

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磁珠分选法从鼠类分离血管壁定居的CD34+干细胞

下颌骨骨髓来源的间充质干细胞在多种分化、自我更新及免疫调节方面具有重要功能。它们已成为基因治疗、组织工程和再生医学中前体细胞的关键来源。本文介绍一种从大鼠下颌骨骨髓中分离间充质干细胞的独特方法。...

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养技术

本方案描述了一种基于磁珠的分选方法，该方法使用藻红蛋白（PE）标记的流式细胞术抗体和抗PE微珠，以分离特定的间充质干细胞亚群。在测试条件下，该方法可获得高纯度的目标标志物阳性细胞，同时保持基于CCK-8的增殖/代谢活性，且无需昂贵的细胞分选仪或针对特定目标的定制磁珠。...

利用间接磁珠法分离和鉴定表达podoplanin的间充质干细胞亚群

了解利用磁活化细胞分选技术从新西兰白兔滑液中分离纯化间充质干细胞的经济高效方案。该方法为干细胞研究领域提供了一种简便可靠的细胞纯化策略，适用于软骨再生等临床应用研究。

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

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