Name: 巨噬细胞内细胞内生长的定量化是评价利什曼原虫寄生虫毒力的快速可靠方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学习利用小鼠骨髓来源巨噬细胞定量分析利什曼原虫胞内生长动力学的方法，用于评估不同毒力菌株。该技术快速经济、可靠高效，可显著减少动物使用，为抗利什曼病药物研发提供重要工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目 RO1 AI067979（授予 NWA）的支持。 
YK 获得了霍华德·休斯医学研究所/马里兰大学帕克分校本科生奖学金。

所有实验操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议进行，并已获得马里兰大学动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。第1至第4节中所述的所有步骤均须在生物安全柜内的层流环境中无菌操作。在整个实验过程中操作活体Leishmania寄生虫时，应使用个人防护装备并格外小心。
1. 骨髓来源巨噬细胞（BMMs）的分离与分化8,30,31
<ol>
	<li>第0天： 处死4至6周龄雌性小鼠 C57BL/6 或 BALB/c 小鼠置于一氧化碳中2 将动物处死并通过颈椎脱位确认死亡。将剪刀和镊子浸泡于70%乙醇中以确保其无菌。用70%乙醇喷洒手套，以保证在骨髓细胞分离过程中全程无菌操作。</li>
	<li>将安乐死的小鼠固定在解剖板上，用大头针固定其前肢，并用70%乙醇充分喷洒消毒。</li>
	<li>在髋关节附近用剪刀做一个约1厘米的小切口。将剪刀小心插入皮下，分离下方肌肉，并环绕髋关节一周剪开皮肤。 
	注意：可旋转解剖板以更好地接触髋关节。</li>
	<li>小心地将腿部皮肤向脚踝方向剥离并取下。在踝关节处或低于踝关节的位置切断足部，注意务必保留胫骨完整无损。 
	注意：此时腓骨连接较松，可用镊子轻易分离。</li>
	<li>通过操作股骨手动定位髋关节，以确定其旋转点。使用剪刀小心地在髋关节上方切断腿部，保留股骨近端头部完整。</li>
	<li>用剪刀尽可能去除腿部的肌肉和结缔组织。清除踝关节处残留的皮肤以及髋关节上方多余的骨组织。</li>
	<li>将清洗干净的腿骨置于含有青霉素/链霉素（1%终浓度）的无菌RPMI中，放入冰上的培养皿内。</li>
	<li>重复步骤 1.4 至 1.6，以分离另一侧后肢的胫骨和股骨。</li>
	<li>使用无菌镊子和无菌#10刀片，从浸在RPMI中的骨骼上去除残留的肌肉和结缔组织。</li>
	<li>将骨骼置于培养皿盖上。用刀片在踝关节上方小心切割胫骨，以暴露骨髓。在膝关节下方紧邻处切割，将胫骨从腿部其余部分分离。</li>
	<li>用10 mL无菌RPMI培养基（添加青霉素/链霉素，终浓度1%）注入10 mL注射器中，并安装25G针头。</li>
	<li>用镊子夹住胫骨，垂直置于冰上放置的50 mL锥形管上方。用注射器将约5 mL RPMI培养基缓慢注入骨的一端，使骨髓从另一端冲出并流入锥形管中。总共使用10 mL RPMI冲洗骨髓，直至骨骼变白。 
	注意：彻底冲洗后，骨骼应变为白色。若未变白，需继续冲洗以去除骨髓。若胫骨远端过于狭窄而无法插入针头，可能需要用刀片将其末端修剪。</li>
	<li>在膝关节上方和髋关节下方立即切断股骨，以暴露骨的两端以便获取骨髓。用总共10 mL RPMI以与胫骨相同的方式冲洗股骨中的骨髓。</li>
	<li>重复执行步骤1.6至1.13，对剩余骨骼进行清洗和灌注，并将灌注出的骨髓细胞收集至同一个50 mL锥形管中 
	注意：如果在灌洗骨髓之前，解剖过程中骨骼发生任何断裂，请勿使用该骨骼中的骨髓。</li>
	<li>将用于收集四根骨骼中冲出的骨髓的锥形管在4 °C、300 x g条件下离心10分钟。</li>
	<li>将60 mL无菌BMM培养基（RPMI，含20% FBS、1%青霉素/链霉素、1.2 mM Na-丙酮酸盐、25 µg/mL人M-CSF）加入175 cm²培养瓶中2 带滤膜瓶盖的细胞培养瓶</li>
	<li>离心后弃去上清液，用5 mL BMM培养基通过轻柔吹打重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞悬液转移至培养瓶中，并用培养瓶中的BMM培养基冲洗锥形管两次，以确保最大程度回收细胞。确保细胞悬液充分混入培养基中，并从初始的175 cm²培养瓶中均匀分配30 mL至新的培养容器。2 细胞培养瓶转移至第二个175 cm²培养瓶2 带滤膜瓶盖的细胞培养瓶</li>
	<li>将两个分别含有30 mL细胞悬液的烧瓶于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养2 以分离任何污染的成纤维细胞、常驻巨噬细胞及其他贴壁细胞。</li>
	<li>第1天： 将含有未分化骨髓细胞的上清液从培养瓶转移至100 mm × 15 mm非组织培养处理的聚苯乙烯培养皿中，每皿约10 mL，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2. 弃去培养瓶。</li>
	<li>第3天或第4天： 向每个培养皿中再加入5 mL BMM培养基（预热至37 °C），并在37 °C、5% CO₂条件下继续培养2.</li>
</ol>
2. 在盖玻片上接种BMM用于感染（第7或8天）
<ol>
	<li>在每个空的6孔细胞培养板孔底部放置四片（4）无菌的12 mm玻璃盖玻片（经高压灭菌并储存在密闭玻璃容器中）。 
	注意：使用连接真空泵的吸头夹取每片无菌12 mm盖玻片。将盖玻片放入孔中时避免重叠，并通过捏紧管子中断真空，使盖玻片在目标位置释放。</li>
	<li>吸除已接种贴壁骨髓来源巨噬细胞（BMM）的培养皿中的培养基（及任何非贴壁细胞），并用预热至37 °C的无钙镁氯化物的无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS -/-）轻轻冲洗贴壁细胞2次。</li>
	<li>向每个培养皿中逐滴加入5 mL含1 mM EDTA的无菌1×PBS -/-，于37 °C孵育5分钟以解离贴壁的BMM。使用显微镜确认细胞是否已解离。</li>
	<li>将所有悬浮于含1 mM EDTA的1×PBS -/-中的解离细胞收集至50 mL锥形管中。用5 mL PBS -/-冲洗每个培养皿2次，并将冲洗液加入细胞悬液中。 
	注意：在收集过程中，可使用额外的PBS -/-稀释细胞悬液，以保护巨噬细胞免受EDTA毒性影响。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，用移液器将巨噬细胞重悬于5–10 mL BMM培养基中。将重悬的细胞置于冰上，以防止其贴附于管壁或发生聚集。</li>
	<li>使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板中计数活细胞。 
	注意：对于重悬于5 mL培养基中的BMM细胞，通常将25 µL细胞悬液与445 µL PBS -/-及30 µL 0.4%台盼蓝溶液混合（相当于最终计算时考虑20倍稀释因子），可在血细胞计数板中实现方便的定量。仅计数未被台盼蓝染色的细胞（活细胞）。若该混合液浓度过高或过低，可调整细胞悬液体积。通常，每只小鼠单次制备的BMM产量在2 × 107至5 × 107个细胞之间。</li>
	<li>将细胞悬液用BMM培养基调整至所需接种浓度（5 × 105/mL），并将2 mL细胞悬液分配至6孔板的每个孔中，使每孔含有1 × 106个巨噬细胞。 
	注意：此步骤至关重要，可确保每孔获得足够数量的巨噬细胞，使盖玻片表面细胞分布均匀。检查孔内盖玻片是否重叠或漂浮于培养基中，如有，可用无菌移液器吸头轻轻调整。</li>
	<li>于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
</ol>
3. 感染性形式的纯化 L. amazonensis
注意：准备用于感染的Leishmania——从静止期前鞭毛体培养物中纯化出环形前鞭毛体8,13，或使用标准的L. amazonensis无细胞分化方案将前鞭毛体在培养中分化为无鞭毛体形态6,8。
<ol>
	<li>使用密度梯度介质纯化Leishmania前循环型前鞭毛体（材料）33
	<ol>
		<li>在无菌、无内毒素的水中配制40%的密度梯度介质储备液。</li>
		<li>将密度梯度溶液用10倍浓缩的M199培养基（不含血清）稀释，制备成在M199培养基中浓度为10%的溶液。</li>
		<li>所有溶液均通过0.22 µm滤膜过滤。 
		注意：储备液可在避光条件下于4 oC保存，但不得超过1个月。</li>
		<li>在15 mL锥形离心管底部加入2 mL 40%密度梯度介质溶液。</li>
		<li>使用巴斯德移液管，小心地将2 mL M199中的10%密度梯度介质溶液叠加在40%密度梯度层上方，避免两层之间混合。</li>
		<li>通过在1,900 × g下离心10分钟，从静止期培养物中收集1 × 109个寄生虫。</li>
		<li>将细胞重悬于6 mL杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）中。</li>
		<li>使用巴斯德移液管，轻轻地将2 mL细胞悬液直接叠加在10%密度梯度介质层上方，避免各层之间混合。</li>
		<li>在室温下以1,300 × g离心10分钟。 
		注意：由于不同Leishmania物种之间的物理特性差异，每种物种的离心条件可能需要稍作调整，以确保最高得率。</li>
		<li>从上层10%密度梯度介质边界处形成的条带（0%与10%密度梯度介质层之间的界面）收集寄生虫（富含前循环型前鞭毛体）。</li>
		<li>用等体积的DMEM稀释寄生虫，并通过离心（室温下1,900 × g，10分钟）收集。</li>
		<li>重悬于500 µL DMEM培养基中，使用血细胞计数板计数以确定产量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌培养条件下（低pH/升高温度）生成L. amazonensis无鞭毛体6,8,13
	<ol>
		<li>将5 mL对数生长期前鞭毛体培养物（pH 7.4，26 oC）与等体积的无鞭毛体培养基（pH 4.5）混合，使用25 cm2培养瓶（共10 mL培养基），并在26 °C下过夜培养。</li>
		<li>将培养瓶从26 °C转移至32 °C。</li>
		<li>3或4天后，在32 °C下用无鞭毛体培养基按1:5比例传代培养。</li>
		<li>在接下来的3至4天内（最长7天）检查寄生虫，判断其是否可用于感染实验。 
		注意：健康的无菌培养无鞭毛体应呈椭圆形，无可见鞭毛。部分分化的无鞭毛体呈较大椭圆形并带有短鞭毛。培养物中不应出现大量聚集体——大量聚集体表明寄生虫未生长或正在死亡。无鞭毛体培养物可按1:5比例传代，最多维持3周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 利什曼原虫亚马逊种（L. amazonensis）感染
<ol>
	<li>根据所需的感染复数（MOI）稀释寄生虫悬液（通常每巨噬细胞3-5个前鞭毛体无鞭毛型[MOI为1:3或1:5]，每巨噬细胞1个无鞭毛体[MOI为1:1]）。将Leishmania用不含钙镁离子的PBS（PBS -/-）稀释至50–100 µL，加入已含有2 mL培养基的每孔中。</li>
	<li>将骨髓来源巨噬细胞（BMMs）与无鞭毛体共孵育1小时，或与前鞭毛体无鞭毛型共孵育3小时，于34 oC条件下进行感染。 
	注意：最佳感染温度可能因物种而异。</li>
	<li>孵育结束后，用预热至37 °C的2 mL不含钙镁离子的PBS（PBS -/-）彻底清洗每孔，共洗3次以去除未结合的寄生虫。 
	注意：轻柔分散PBS，防止盖玻片相互重叠。轻轻摇晃培养板后吸出液体。若使用多种寄生虫株，应使用不同的吸头以避免交叉污染。</li>
	<li>对1小时或3小时时间点的样本进行固定：每孔加入1.5–2 mL含2%多聚甲醛（PFA）的PBS -/-溶液，孵育10分钟。随后用PBS -/-洗涤3次。最后一次洗涤后不要吸干，将含有盖玻片的培养板置于PBS中并冷藏，直至染色。</li>
	<li>对于后续时间点，在每孔中加入2 mL新鲜BMM培养基，并于34 °C继续孵育。</li>
	<li>按照步骤4.3所述方法，对剩余时间点的样本进行固定，并将培养板冷藏保存至染色前。</li>
</ol>
5. DAPI 染色与盖玻片封片
<ol>
	<li>吸弃含盖玻片孔中的 PBS，加入 1.5 mL 含 0.1% 非离子型去垢剂的 PBS -/-。室温孵育 10 分钟，随后用 2 mL PBS -/- 洗涤 3 次。</li>
	<li>向含盖玻片的孔中加入 1 mL 含 2 µg/mL DAPI（用水将 5 mg/mL 储存液稀释而成）的 PBS -/-，室温再孵育 1 小时。 
	注意：DAPI 孵育时间对于正确观察细胞内 Leishmania 寄生虫至关重要。由于巨噬细胞核体积较大且 DNA 含量高，染色较快；而细胞内寄生虫的细胞核染色较慢。因此，需延长孵育时间，超过仅观察 BMM 细胞核所需的时间，以使 DAPI 能够穿透寄生虫的质膜和核膜。适当染色后，除核 DNA 外，还可观察到位于寄生虫鞭毛窝附近的线粒体动基体 DNA。</li>
	<li>用 2 mL PBS -/- 对含盖玻片的每孔洗涤 3 次，然后用镊子小心提起并翻转盖玻片，使细胞面朝下，用市售的抗荧光淬灭封片试剂将其封固在玻璃显微镜载玻片上。 
	注意：盖玻片极为脆弱，操作需谨慎。提起时避免对其施加压力，尤其不要触碰孔壁。加入数滴 PBS -/- 可降低盖玻片与孔板之间的表面张力，有助于顺利提起。可用细针辅助将盖玻片从孔底撬起。将盖玻片放置于载玻片上后，用镊子轻轻按压，排出封片介质中的气泡。若盖玻片在提起过程中破裂或可能已翻转，请勿重新封片，直接使用备用的第四张盖玻片即可。</li>
	<li>将载玻片冷藏保存，直至进行定量分析。</li>
</ol>
6. 感染定量
<ol>
	<li>在荧光显微镜下观察经DAPI染色的载玻片，使用100倍物镜聚焦于巨噬细胞&#160;使用浸油的物镜（激发波长358 nm；最佳发射波长461 nm）。 
	确保聚焦于玻璃载片与盖玻片之间的巨噬细胞层。</li>
	<li>定量分析巨噬细胞数量（经DAPI染色的大细胞核）以及围绕每个巨噬细胞核聚集的较小无鞭毛体细胞核数量（参见 图2A，DAPI）的视野数，使用手动计数器进行计数。 
	注意：由于无鞭毛体的细胞核体积较小，可能无法在同一焦平面上全部观察到。首先在聚焦于巨噬细胞细胞核时计数可见的无鞭毛体细胞核，然后使用微调焦功能，在巨噬细胞细胞核上下不同焦平面中检查是否存在其他寄生虫细胞核。</li>
	<li>移动到另一个视野以重复定量。使用独立的计数键记录已计数的视野数量。在每个盖玻片上以平行排布的方式移动视野，避免重复计数。</li>
	<li>每盖玻片至少定量200个巨噬细胞。每个感染时间点设三个复孔（3个盖玻片）进行定量。若因盖玻片重叠、封片质量差或玻片破裂等原因导致其中一个盖玻片不适合计数时，需计数第四个盖玻片。 等等。 
	注意：若任一盖玻片上无法计数到200个巨噬细胞，则计数备用的第四张盖玻片。</li>
	<li>根据原始定量数据，计算感染率，以每个巨噬细胞内的无鞭毛体数（无鞭毛体/巨噬细胞）或每100个巨噬细胞中的无鞭毛体数（无鞭毛体/100个巨噬细胞）表示，并计算被感染巨噬细胞的百分比。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益，

上述BMM感染实验所产生的定量数据，可使研究人员在相对较短的时间内（最长2周，而传统方法需2个月）获得感染率，并可靠地确定毒力特性的变化。 体内 实验）。该方法依赖于DNA特异性染料DAPI，可特异性地染色巨噬细胞和寄生虫的细胞核，从而实现对感染细胞的快速鉴定与定量。相比之下，其他染料（如吉姆萨染液）会以不同的强度结合多种不同的细胞组分，使显微观察分析变得复杂37使用DAPI可识别细胞内寄生虫，并将其与细胞结构清晰区分开（仅宿主细胞的细胞核会被染色，且其大小比寄生虫细胞核大数个数量级），从而更简便、快速地对感染进行定量分析。
与任何实验方法一样，本方法存在一些局限性，并包含若干需要谨慎操作的关键步骤。In vivo 条件下，Leishmania 感染在吞噬作用发生前会引发复杂的先天免疫应答，从而决定感染的最终进程38。因此，实验设计中模型小鼠品系的选择至关重要。本方案中使用的 C57BL/6 和 BALB/c...

利什曼病是一类由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫物种引起的人类疾病，其临床表现具有广泛的谱系 利什曼原虫约有1200万人目前感染了 利什曼原虫 全球范围内，超过3.5亿人面临风险。该疾病的病理特征取决于 利什曼原虫 物种和宿主因素，并且症状从无害的自愈性皮肤病变到致命的内脏利什曼病不等。若不加以治疗，内脏利什曼病具有致死性，其致死率在原虫寄生虫感染所致的人类疾病中仅次于疟疾1尽管疾病病理和症状存在广泛差异，所有 利什曼原虫 物种具有双宿主生活周期，分别在昆虫和脊椎动物宿主体内交替进行前鞭毛体和无鞭毛体阶段。在脊椎动物体内， 利什曼原虫 靶向宿主巨噬细胞进行侵袭，并诱导寄生泡（PVs）的形成。寄生泡是一种具有吞噬溶酶体特性的酸性区室，其中高毒力的无鞭毛体形式进行复制。在慢性感染期间，无鞭毛体可在宿主组织中长期存在，并可传递给未感染的白蛉，从而完成传播循环。因此，在人类疾病发展的背景下，无鞭毛体是最关键的 利什曼原虫 生命周期形态2研究无鞭毛体在巨噬细胞吞噬泡内复制的机制对于理解 利什曼原虫 毒力3,4,5,6,7 以及新型有效疗法的开发。
我们在此描述一种本实验室常规使用的方法，用于研究 利什曼原虫 在骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）中的感染与复制，涉及对细胞内病原体数量的定量评估 利什曼原虫 随着时间的推移，该过程包括从小鼠骨髓中分离单核细胞，并在体外培养中将其诱导分化为巨噬细胞。 体外 感染具有感染性的形式（前鞭毛体或无鞭毛体）的 利什曼原虫 并在感染后的72至96小时内，每隔24小时对细胞内寄生虫数量进行定量。本实验室已应用该检测方法评估多种环境因素和寄生虫基因的影响，包括鉴定出铁在促进寄生虫生长中的关键作用 L. amazonensis 通过小鼠足垫病变发育研究进一步验证了其毒力6,8,9,10,11,12,13,14,15. 由于所有致病性 利什曼原虫 物种在宿主巨噬细胞内建立其复制生态位，该检测方法可普遍用于所有病原体的毒力测定 利什曼原虫 物种
进行BMM感染可实现对宿主-寄生虫相互作用的单细胞水平分析，从而更深入地理解Leishmania寄生虫与其偏好的宿主微环境——巨噬细胞的PVs之间的相互作用。多个研究团队已成功应用巨噬细胞感染实验16,17,18,19,20,21,22，以探究宿主巨噬细胞和Leishmania特异性基因的功能，及其在表征胞内感染的复杂相互作用中的潜在参与。BMM感染可用于量化寄生虫的生长情况，作为宿主因素影响胞内存活能力的读数指标，例如杀菌性一氧化氮的产生、活性氧物质的生成，以及其他在溶酶体样PVs内遇到的不利条件23。巨噬细胞感染实验还被用于筛选潜在的抗利什曼药物候选分子，以推动治疗药物的开发13,24。
的 体外 BMM感染的特性在评估方面相较于其他方法具有多种优势 利什曼原虫 毒力。然而，此前多项研究在考察胞内寄生虫随时间推移的存活机制时，并未将感染量化为速率20,21,24此外，许多研究集中于追踪 体内 随着时间推移评估感染情况时，仅通过测量皮肤病变大小及其他与寄生虫复制间接相关的生理症状来进行25,26,27. 体内 感染是评估寄生虫毒力的严格方法，但仅基于足垫肿胀程度测量病灶大小往往不够充分，因为这种测量反映的是感染组织中的炎症反应，而非寄生虫的绝对数量。因此，在足垫病灶发育检测之后，必须对感染组织中的寄生虫负荷量进行定量分析，而这一过程需要耗时较长的有限稀释实验。28此外， 体内 研究通常需要在不同时间点处死多只动物，以获取目标组织6,8,9,10,11,13相比之下，仅需一只动物即可获得大量BMMs，且这些细胞可在允许于不同时间点评估感染情况的条件下进行接种培养。此外，与 体内 研究，执行 体外 BMM感染可实现对实验条件的更精确控制。通过定量感染的巨噬细胞及其所感染的寄生虫，可精确调控感染复数（MOI）和培养条件。对这些因素的精细控制对于鉴定特定细胞通路的特征及其对感染进程的影响至关重要。
鉴于这些优势，目前仅有极少数研究Leishmania毒力的课题组充分利用了巨噬细胞内复制的定量评估方法，这在一定程度上令人意外。本文讨论了可能阻碍该检测方法更广泛应用的一些常见问题，并提供了一步一步的操作流程，以促进其正确实施。考虑到该方法的精确性和多功能性，本文所述的BMM感染实验不仅可用于探索影响Leishmania毒力的宿主-病原体相互作用，还可用于研究其他在巨噬细胞内复制的微生物29。尤为重要的是，该实验还可开发为一种快速且经济的抗利什曼原虫药物研发的临床前筛选方法。

<table><tbody><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶屏障移液器吸头（100–1000 &amp;mu;L）</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶屏障移液器吸头（20–200 &amp;mu;L）</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>气溶胶屏障移液器吸头（2–20 &amp;mu;L）</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Bard-Parker肋纹碳钢手术刀片 #10</td><td>Aspen Surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD鲁尔锁头10 mL注射器</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide针头，25G&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 35 mm × 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片：12 mm圆形</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>J.T. Baker</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>200度乙醇</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm × 15 mm 非组织培养处理聚苯乙烯培养皿</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG Texas Red</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>血红素</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Isoton II稀释液</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gemini</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199（10倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（不含钙镁）</td><td>ThermoFisher</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯圆锥形离心管 15 mL</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯圆锥形离心管 50 mL</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠Lamp-1抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>重组人M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&amp;nbsp; 血细胞计数板&amp;nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基（1倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>表面活性剂Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀，4 1/2&quot;</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊，细尖头</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Z1库尔特颗粒计数器，双阈值</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

巨噬细胞内生长的定量分析是一种快速可靠的毒力评估方法 利什曼原虫 寄生虫

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

生命周期 利什曼原虫，利什曼病的致病原，在昆虫和脊椎动物宿主内分别交替存在于前鞭毛体和无鞭毛体阶段。尽管利什曼病的临床症状因感染物种不同而差异显著，可表现为良性的皮肤病变，也可发展为致命性的内脏疾病形式，所有 利什曼原虫 在生命周期的脊椎动物阶段，该物种存在于宿主巨噬细胞内。 利什曼原虫 因此，感染性直接与其侵入、在巨噬细胞内寄生泡（PVs）中存活和复制的能力相关。因此，评估寄生虫在细胞内复制的能力是测定其毒力的可靠方法。利用动物模型研究利什曼病的发展过程耗时长、繁琐且常具挑战性，尤其是针对具有重要致病意义的内脏型利什曼病。本文介绍一种用于追踪细胞内寄生虫发育过程的方法 利什曼原虫 在骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）中。感染后72至96小时内，每隔24小时测定细胞内寄生虫数量。该方法可可靠地确定多种遗传因素对 利什曼原虫 毒力。例如，我们展示了如何通过单等位基因缺失的 利什曼原虫 线粒体铁转运蛋白基因（LMIT1) 损害了 Leishmania amazonensis 突变菌株 LMIT1/ΔLmit1 在BMMs内生长，表现出与野生型相比毒力显著降低。该实验方法还可精确控制实验条件，能够单独调控各个因素，以分析不同因素（营养物质、活性氧等）的影响。 等等因此，适当地实施和量化BMM感染研究为传统的动物模型研究提供了一种无创、快速、经济、安全且可靠的替代方法。

利什曼原虫 具有两种感染形式——在培养的稳定期由前循环型前鞭毛体分化而来的前鞭毛体，以及作为细胞内阶段的无鞭毛体（图1）。在某些情况下 利什曼原虫 物种如 L. amazonensis，前鞭毛体细胞也可通过转移至较低pH（4.5）和较高温度条件下，在无菌培养中分化为无鞭毛体32 °C），类似于BMM PVs内部的条件8,34仅利什曼原虫的前鞭毛体或无鞭毛体形式 利什曼原虫 能够诱导PVs的形成，并在被宿主巨噬细胞吞噬后在细胞内进行复制35未分化的对数期前鞭毛体无致病性，且无法促进寄生泡的形成 (图2).
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所有致病性利什曼原虫（Leishmania）物种均在其脊椎动物宿主的巨噬细胞内寄居并增殖。本文介绍一种在体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞中感染利什曼原虫（Leishmania）并精确量化其胞内生长动力学的实验方案。该方法适用于研究影响宿主-病原体相互作用及利什曼原虫（Leishmania）毒力的各个独立因素。

利什曼原虫（Leishmania）是利什曼病的致病因子，其生命周期在昆虫和脊椎动物宿主体内交替进行，包括前鞭毛体和无鞭毛体两个阶段……

本实验的总体目标是通过体外感染小鼠骨髓来源的巨噬细胞，并定量分析寄生虫的胞内生长动力学，从而评估不同利什曼原虫株的毒力。该方法有助于我们解答关于宿主巨噬细胞和病原体自身因素如何共同决定感染性利什曼原虫毒力的关键问题。该技术的主要优势在于，与体内研究相比，它是一种快速、经济且可靠的方法，所需实验动物数量显著减少。该技术的应用前景涉及利什曼病的治疗，因为它可用于评估突变利什曼原虫株的感染能力，或治疗性化合物的疗效。此方法的可视化演示至关重要，因为骨髓来源巨噬细胞的分离以及细胞内寄生虫定量步骤仅通过书面方案难以掌握。首先将一只4至6周龄的雌性小鼠固定在解剖板上，并用70%乙醇对动物进行消毒。使用剪刀在髋关节附近做一个一厘米长的切口，并环绕关节周围剪开皮肤。将腿部的皮肤向脚踝方向轻轻剥离，以完整脱去肢体的皮肤，然后在踝关节处或其下方切断足部，保留胫骨完整。为定位髋关节，可活动股骨以确定其旋转点，再用剪刀在髋关节上方切断腿部，保留股骨近端头部完整。尽可能去除腿部的肌肉和结缔组织，将清理后的骨骼置于含有无菌 RPMI 的培养皿中，RPMI 中添加抗生素并置于冰上。采集第二组腿骨后，使用灭菌镊子和10号刀片去除残留的肌肉和结缔组织。将清理后的骨骼转移至一个空的培养皿盖中，用手术刀切除每根胫骨的两端，以暴露骨髓。用镊子将一根胫骨置于冰上盛有50毫升锥形管的管口，将连接在装有添加抗生素培养基的10毫升注射器上的25号针头插入胫骨一端。向骨内灌注约5至10毫升培养基，使液体流入锥形管，直至所有红色骨髓组织被冲出，骨骼呈白色。当骨髓完全收集后，离心合并的骨髓样本，并将骨髓细胞沉淀重悬于5毫升骨髓来源巨噬细胞培养基中。将骨髓细胞悬液转移至含有60毫升无菌骨髓来源巨噬细胞培养基的175平方厘米细胞培养瓶中，并用培养瓶中的培养基冲洗管子两次，以确保最大程度回收细胞。第二次冲洗后，取30毫升细胞等分试样转移至第二个175平方厘米细胞培养瓶中，每个培养瓶均用带滤膜的瓶盖封闭。随后，将两份培养物在37°C和5% CO₂条件下孵育过夜，以使固有巨噬细胞与可能污染的成纤维细胞或其他贴壁细胞分离。次日早晨，从每个培养瓶中转移10毫升含有未分化骨髓细胞的上清液至各自的100 × 15毫米非组织培养处理的聚苯乙烯培养皿中，并将细胞放回细胞培养孵育箱继续培养2至3天。随后，每皿加入5毫升新鲜的37°C骨髓来源巨噬细胞培养基对细胞进行换液，并将培养板放回孵育箱。培养第7或第8天时，使用连接真空泵的吸管头将4个经高压灭菌的12毫米玻璃盖玻片转移至6孔培养板每个孔的底部，注意避免重叠。为实验的每个时间点准备相同的培养板。接下来，用新鲜的37摄氏度PBS洗涤骨髓来源的巨噬细胞培养物两次，每孔加入5毫升不含钙和镁并补充1毫摩尔EDTA的PBS。在37摄氏度孵育5分钟后，收集脱落的细胞至50毫升锥形管中，并用额外的5毫升不含钙和镁的PBS冲洗每块培养板两次。离心后，将巨噬细胞重悬于5至10毫升预冷的新鲜骨髓来源巨噬细胞培养基中，置于冰上。计数后，用新鲜骨髓来源巨噬细胞培养基将细胞稀释至每毫升5 × 10⁵个细胞的浓度，并每孔加入2毫升细胞悬液至6孔板中。随后，将细胞在细胞培养箱中孵育过夜。为了用L. amazonesis感染细胞，将寄生虫悬液稀释至适当的实验感染复数，并向包括实验所有时间点在内的六孔板的每个孔中加入50至100微升的寄生虫悬液。将骨髓来源的巨噬细胞在适当的感染时间和温度条件下孵育。随后，用每孔2毫升新鲜的37摄氏度、不含钙和镁的PBS洗涤孔板三次，并用1.5至2毫升的2%多聚甲醛固定初始时间点的样本10分钟。对于对应较晚时间点的培养板，向每个孔中加入2毫升新鲜的骨髓来源巨噬细胞培养基，并将培养板放回相应的培养箱中。随后，按照前述方法对剩余各时间点的细胞进行固定和洗涤，并将样品在4°C条件下保存于新鲜的PBS中。对细胞进行DAPI染色时，先将上清液替换为1.5毫升不含钙和镁的PBS（含0.1%非离子型去垢剂），室温孵育10分钟，随后用不含钙和镁的PBS洗涤三次，每次2毫升。接下来，在1毫升PBS中加入终浓度为每毫升2微克的DAPI，室温避光孵育细胞1小时。经过三次洗涤后，将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上，每张载玻片使用市售抗荧光淬灭封片剂进行封固。随后，为了定量感染细胞的数量，使用荧光显微镜的100倍油镜物镜结合手动计数器，识别围绕每个较大的DAPI染色细胞核周围聚集的小型无鞭毛体细胞核数量。利什曼原虫有两种感染形态：前鞭毛体的后期感染形态（metacyclic promastigotes），其由培养物在静止期时从前鞭毛体的早期形态（procyclic promastigotes）分化而来；以及无鞭毛体（amastigote），即存在于脊椎动物宿主细胞内的感染形态。在此，可在感染开始后一小时观察到在骨髓来源巨噬细胞内通过无共生培养分化形成的无鞭毛体，此时尚未通过吞噬溶酶体融合形成含虫空泡。在48小时时，可观察到容纳多个寄生虫的明显大型含虫空泡，这是毒力型利什曼原虫感染的典型特征。相比之下，无毒力的对数期前鞭毛体无法启动寄生泡的发育，不能复制，并最终在宿主巨噬细胞内被杀死。在本实验中，感染后至72小时，细胞内野生型无鞭毛前体利什曼原虫的数量持续增加，而线粒体铁离子导入功能受损的突变型寄生虫则几乎未见或完全未见细胞内增殖，表明线粒体活性是利什曼原虫在巨噬细胞内生长所必需的。使用野生型和突变型无菌无鞭毛体进行的巨噬细胞感染实验显示，其细胞内生长模式与无鞭毛前体利什曼原虫相似，但野生型寄生虫的感染能力甚至高于无鞭毛前体利什曼原虫。需要注意的是，前鞭毛体感染存在约24小时的初始延迟期，这代表了被吞噬的前鞭毛体首先分化为无鞭毛体所需的时间，之后才开始增殖。一旦掌握该技术，若操作得当，可在15天内完成。在进行该实验时，重要的是使用合适的小鼠品系，并对巨噬细胞和寄生虫细胞进行精确的定量，以确保所有实验中的感染复数（MOI）保持一致。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养骨髓来源的巨噬细胞，并用利什曼原虫感染这些细胞，随后通过DAPI核染色对细胞内寄生虫的生长情况进行定量分析。请务必注意，操作利什曼原虫可能具有极高危险性，在进行该实验时，必须采取相应预防措施，例如使用生物安全柜、穿戴个人防护装备，并避免使用锐利器械。

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学习利用小鼠骨髓来源巨噬细胞定量分析利什曼原虫胞内生长动力学的方法，用于评估不同毒力菌株。该技术快速经济、可靠高效，可显著减少动物使用，为抗利什曼病药物研发提供重要工具。

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