巨噬细胞内生长的定量分析是一种快速可靠的毒力评估方法 利什曼原虫 寄生虫

本实验的总体目标是通过体外感染小鼠骨髓来源的巨噬细胞，并定量分析寄生虫的胞内生长动力学，从而评估不同利什曼原虫株的毒力。该方法有助于我们解答关于宿主巨噬细胞和病原体自身因素如何共同决定感染性利什曼原虫毒力的关键问题。该技术的主要优势在于，与体内研究相比，它是一种快速、经济且可靠的方法，所需实验动物数量显著减少。

该技术的应用前景涉及利什曼病的治疗，因为它可用于评估突变利什曼原虫株的感染能力，或治疗性化合物的疗效。此方法的可视化演示至关重要，因为骨髓来源巨噬细胞的分离以及细胞内寄生虫定量步骤仅通过书面方案难以掌握。首先将一只4至6周龄的雌性小鼠固定在解剖板上，并用70%乙醇对动物进行消毒。

使用剪刀在髋关节附近做一个一厘米长的切口，并环绕关节周围剪开皮肤。将腿部的皮肤向脚踝方向轻轻剥离，以完整脱去肢体的皮肤，然后在踝关节处或其下方切断足部，保留胫骨完整。为定位髋关节，可活动股骨以确定其旋转点，再用剪刀在髋关节上方切断腿部，保留股骨近端头部完整。

尽可能去除腿部的肌肉和结缔组织，将清理后的骨骼置于含有无菌 RPMI 的培养皿中，RPMI 中添加抗生素并置于冰上。采集第二组腿骨后，使用灭菌镊子和10号刀片去除残留的肌肉和结缔组织。将清理后的骨骼转移至一个空的培养皿盖中，用手术刀切除每根胫骨的两端，以暴露骨髓。

用镊子将一根胫骨置于冰上盛有50毫升锥形管的管口，将连接在装有添加抗生素培养基的10毫升注射器上的25号针头插入胫骨一端。向骨内灌注约5至10毫升培养基，使液体流入锥形管，直至所有红色骨髓组织被冲出，骨骼呈白色。当骨髓完全收集后，离心合并的骨髓样本，并将骨髓细胞沉淀重悬于5毫升骨髓来源巨噬细胞培养基中。

将骨髓细胞悬液转移至含有60毫升无菌骨髓来源巨噬细胞培养基的175平方厘米细胞培养瓶中，并用培养瓶中的培养基冲洗管子两次，以确保最大程度回收细胞。第二次冲洗后，取30毫升细胞等分试样转移至第二个175平方厘米细胞培养瓶中，每个培养瓶均用带滤膜的瓶盖封闭。随后，将两份培养物在37°C和5% CO₂条件下孵育过夜，以使固有巨噬细胞与可能污染的成纤维细胞或其他贴壁细胞分离。

次日早晨，从每个培养瓶中转移10毫升含有未分化骨髓细胞的上清液至各自的100 × 15毫米非组织培养处理的聚苯乙烯培养皿中，并将细胞放回细胞培养孵育箱继续培养2至3天。随后，每皿加入5毫升新鲜的37°C骨髓来源巨噬细胞培养基对细胞进行换液，并将培养板放回孵育箱。培养第7或第8天时，使用连接真空泵的吸管头将4个经高压灭菌的12毫米玻璃盖玻片转移至6孔培养板每个孔的底部，注意避免重叠。

为实验的每个时间点准备相同的培养板。接下来，用新鲜的37摄氏度PBS洗涤骨髓来源的巨噬细胞培养物两次，每孔加入5毫升不含钙和镁并补充1毫摩尔EDTA的PBS。在37摄氏度孵育5分钟后，收集脱落的细胞至50毫升锥形管中，并用额外的5毫升不含钙和镁的PBS冲洗每块培养板两次。

离心后，将巨噬细胞重悬于5至10毫升预冷的新鲜骨髓来源巨噬细胞培养基中，置于冰上。计数后，用新鲜骨髓来源巨噬细胞培养基将细胞稀释至每毫升5 × 10⁵个细胞的浓度，并每孔加入2毫升细胞悬液至6孔板中。随后，将细胞在细胞培养箱中孵育过夜。

为了用L. amazonesis感染细胞，将寄生虫悬液稀释至适当的实验感染复数，并向包括实验所有时间点在内的六孔板的每个孔中加入50至100微升的寄生虫悬液。将骨髓来源的巨噬细胞在适当的感染时间和温度条件下孵育。随后，用每孔2毫升新鲜的37摄氏度、不含钙和镁的PBS洗涤孔板三次，并用1.5至2毫升的2%多聚甲醛固定初始时间点的样本10分钟。

对于对应较晚时间点的培养板，向每个孔中加入2毫升新鲜的骨髓来源巨噬细胞培养基，并将培养板放回相应的培养箱中。随后，按照前述方法对剩余各时间点的细胞进行固定和洗涤，并将样品在4°C条件下保存于新鲜的PBS中。对细胞进行DAPI染色时，先将上清液替换为1.5毫升不含钙和镁的PBS（含0.1%非离子型去垢剂），室温孵育10分钟，随后用不含钙和镁的PBS洗涤三次，每次2毫升。

接下来，在1毫升PBS中加入终浓度为每毫升2微克的DAPI，室温避光孵育细胞1小时。经过三次洗涤后，将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上，每张载玻片使用市售抗荧光淬灭封片剂进行封固。随后，为了定量感染细胞的数量，使用荧光显微镜的100倍油镜物镜结合手动计数器，识别围绕每个较大的DAPI染色细胞核周围聚集的小型无鞭毛体细胞核数量。

利什曼原虫有两种感染形态：前鞭毛体的后期感染形态（metacyclic promastigotes），其由培养物在静止期时从前鞭毛体的早期形态（procyclic promastigotes）分化而来；以及无鞭毛体（amastigote），即存在于脊椎动物宿主细胞内的感染形态。在此，可在感染开始后一小时观察到在骨髓来源巨噬细胞内通过无共生培养分化形成的无鞭毛体，此时尚未通过吞噬溶酶体融合形成含虫空泡。在48小时时，可观察到容纳多个寄生虫的明显大型含虫空泡，这是毒力型利什曼原虫感染的典型特征。

相比之下，无毒力的对数期前鞭毛体无法启动寄生泡的发育，不能复制，并最终在宿主巨噬细胞内被杀死。在本实验中，感染后至72小时，细胞内野生型无鞭毛前体利什曼原虫的数量持续增加，而线粒体铁离子导入功能受损的突变型寄生虫则几乎未见或完全未见细胞内增殖，表明线粒体活性是利什曼原虫在巨噬细胞内生长所必需的。使用野生型和突变型无菌无鞭毛体进行的巨噬细胞感染实验显示，其细胞内生长模式与无鞭毛前体利什曼原虫相似，但野生型寄生虫的感染能力甚至高于无鞭毛前体利什曼原虫。

需要注意的是，前鞭毛体感染存在约24小时的初始延迟期，这代表了被吞噬的前鞭毛体首先分化为无鞭毛体所需的时间，之后才开始增殖。一旦掌握该技术，若操作得当，可在15天内完成。在进行该实验时，重要的是使用合适的小鼠品系，并对巨噬细胞和寄生虫细胞进行精确的定量，以确保所有实验中的感染复数（MOI）保持一致。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养骨髓来源的巨噬细胞，并用利什曼原虫感染这些细胞，随后通过DAPI核染色对细胞内寄生虫的生长情况进行定量分析。请务必注意，操作利什曼原虫可能具有极高危险性，在进行该实验时，必须采取相应预防措施，例如使用生物安全柜、穿戴个人防护装备，并避免使用锐利器械。