Name: 利用相扑融合策略生成国产、未加标签的杭丁顿蛋白 Exon1 单体和纤维 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学习利用相扑融合策略制备无标签杭丁顿蛋白Exon1单体和纤维的方法。该方案通过金属亲和层析和反相高效液相色谱纯化，可获得高纯度天然蛋白，适用于神经退行性疾病研究。

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本工作主要由CHDI基金会和瑞士国家科学基金会的资助项目提供支持。我们感谢Sophie Vieweg博士在开发这一新表达系统过程中提供的有益讨论，同时也感谢Lashuel课题组其他成员分享他们使用该表达系统的经验以及提出的宝贵意见和反馈。我们还感谢Oliver Hantschel教授提供了ULP1质粒。作者感谢John B. Warner博士和Senthil K. Thangaraj博士对稿件进行的严格审阅。

1. 表达重组 Httex1 23Q 和 43Q
<ol>
	<li>配制所需的缓冲液和溶液。配制1000倍氨苄青霉素（AMP，100 mg/mL）储备液，经0.2 µm滤膜过滤，分装后于-20 °C保存。配制LB培养基（每1 L H2O中加入25 g LB Miller），高压灭菌。配制1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）储备液，经0.2 µm滤膜过滤，分装后于-20 °C保存。</li>
	<li>采用热激法将含有人源Httex1与N端His6-SUMO标签融合的pTWIN1质粒转化至化学感受态E. coli B ER 2566菌株中34。 
	注：也可使用E. coli BL21 DE3菌株，但此情况下观察到更多的截短产物。</li>
	<li>用无菌移液枪头从琼脂平板上挑取单菌落，接种于1 L锥形瓶中的200 mL含1×AMP的LB培养基中。将培养物置于细菌培养摇床中，30 °C、180 rpm振荡培养20小时（过夜）。</li>
	<li>用无菌移液器取1 mL培养液样品，使用一次性塑料比色皿和分光光度计测定其在600 nm处的光密度（OD600）（确保测量值在0.1至1之间，必要时用LB培养基稀释）。根据测定结果计算所需接种量，使3 L培养体系的初始OD600为0.05（若预培养物OD600 = 3，则需50 mL）。</li>
	<li>向四个5 L三角瓶中各加入3 L含1×AMP的LB培养基，并按上述计算量加入预培养物进行接种。将培养物置于细菌培养摇床中，37 °C、180 rpm振荡培养。</li>
	<li>每隔30分钟用无菌移液器取1 mL培养液样品，使用一次性塑料比色皿和分光光度计测定OD600。当OD600达到0.1（通常在1–2小时内）时，将细菌培养摇床温度调至14 °C，继续培养并降温。此后仍每隔30分钟取样并测定OD600。 
	&#8203;注：不同培养摇床的降温速度可能不同，因此开始降温的时间需根据具体设备调整。然而，由于SUMO融合蛋白较为稳定，温度梯度的变化对蛋白产量影响较小。</li>
	<li>当OD600达到0.3–0.4（通常在1–2小时内）时，取诱导前样品用于SDS-PAGE分析蛋白过表达情况。计算样品体积以确保在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE上获得可比的细胞量和良好的信号强度：对于10孔胶，体积 = 0.2 mL/OD600；若使用15孔胶，则取一半体积。
	<ol>
		<li>对于OD600 = 0.4的细菌培养物，取500 µL。用无菌移液器取相应体积的培养液，离心（18000 × g，4 °C，2分钟），弃上清。将沉淀保存于-20 °C，待后续分析时使用（步骤1.11）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每份3 L培养液中加入1.2 mL 1 M IPTG储备液（终浓度0.4 mM），诱导蛋白表达。继续在14 °C下培养16小时（过夜）。 
	注：添加IPTG时，培养温度通常已降至约20 °C，具体取决于培养摇床的性能。</li>
	<li>按照步骤1.7所述方法，取诱导后样品用于SDS-PAGE分析蛋白过表达情况。</li>
	<li>将培养物在1 L离心管中离心收集细胞（3993 × g，4 °C，10分钟）。弃去上清，将细胞沉淀置于冰上，并立即进行下一步纯化操作。</li>
	<li>通过SDS-PAGE分析蛋白过表达情况35,36。将诱导前和诱导后的样品分别重悬于20 µL电泳缓冲液和20 µL 2×上样缓冲液中。在95 °C金属浴中加热5分钟，趁热上样20 µL至15%分离胶。以180 V电压电泳90分钟。按照试剂说明书用考马斯亮蓝染色。将结果与图1C中的代表性结果进行比较。 
	注：本方案可在此处暂停，细胞沉淀可冷冻并保存于-80 °C数周。为获得最佳效果，建议使用新鲜细菌沉淀，避免冻存。反复冻融可能导致细胞裂解及Httex1降解，从而降低蛋白产量和质量。</li>
</ol>
2. 通过固定化金属亲和层析法（IMAC）裂解细胞并纯化His6-SUMO Httex1融合蛋白
<ol>
	<li>在玻璃瓶中配制 2 L 缓冲液 A（50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、500 mM NaCl、15 mM 咪唑）。在玻璃瓶中配制 1 L 缓冲液 B（50 mM Tris、500 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 7.4）。溶解盐类后，用 10 N HCl 调节 pH，并使用瓶顶滤器（0.65 µm）将溶液过滤至新的瓶子中。配制 1000 倍浓度的苯甲基磺酰氟（PMSF，0.3 M）储存液，分装为 100 µL 每管，于 -20 °C 保存。 
	注意：本方案设计为可在 8–9 小时内完成从细菌沉淀裂解到反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化及冻干的全部步骤。为减少聚集和蛋白水解，建议快速操作、避免中断，并在 4 °C 或冰上完成所有步骤。</li>
	<li>向 100 mL 预冷的缓冲液 A 中加入 100 µL PMSF 储存液和五片蛋白酶抑制剂（每 30 mL 最终体积加 1 片）。将细菌沉淀加入缓冲液中，用磁力搅拌子搅拌并用无菌 10 mL 移液器反复吹打以均质化悬浮液（约 30 分钟）。</li>
	<li>将细菌悬浮液分装至 50 mL 一次性塑料离心管中，每管 40 mL。在冰水浴中对每份样品进行超声处理以裂解细胞（70% 振幅，总超声时间 5 分钟，每次超声 30 秒，暂停 30 秒）。 
	注意：超声过程中必须防止样品温度升高。建议在冰浴中加入适量水以增强超声期间的散热效果。若使用不同型号的超声仪，可能需要调整超声参数。其他裂解方法如法国压滤器或微流化器也可使用，且可能有助于避免样品加热和蛋白聚集。本实验室未配备此类设备，但采用当前超声方案已获得良好结果。</li>
	<li>取 50 µL 裂解液用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。离心样品（18000 × g，4 °C，2 分钟），用移液器将可溶性组分转移至新试管中。用移液器将不溶性组分重悬于 50 µL 缓冲液 A 中。将样品置于冰上，待进行 SDS-PAGE 分析（步骤 2.6）。</li>
	<li>通过离心澄清裂解液（39191 × g，4 °C，60 分钟）。</li>
	<li>在离心过程中，通过 SDS-PAGE 分析细胞裂解效果。分别向裂解液的可溶性和不溶性组分中加入 50 µL 2× 上样染料。95 °C 加热 5 分钟，趁热上样 2 µL 至 15% 凝胶。在 180 V 条件下电泳 90 分钟。按照制造商说明用考马斯亮蓝染料染色凝胶。将结果与图 1C中的代表性结果进行比较。</li>
	<li>用 0.45 µm 注射式滤器过滤上清液。取 20 µL 过滤后的上清液用于 SDS-PAGE 分析（步骤 2.11）。 
	&#8203;注意：通常可获得 90 至 100 mL 澄清且过滤后的上清液。通常使用 3 个注射式滤器即可满足需求。若过滤困难，可尝试提高离心速度和/或延长离心时间。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用快速蛋白液相色谱（FPLC）系统通过固定化金属亲和层析（IMAC）从澄清的细菌裂解液中分离 His6-SUMO Httex1 融合蛋白。37
	<ol>
		<li>将澄清的裂解液注入超载环，以 2 mL/min 流速上样至 Ni-NTA 柱（按制造商说明书进行再生、清洗和重新装填，建议先进行一次空白运行）。以 10 mL/min 流速用 10 个柱体积（CV，200 mL）的缓冲液 A 洗涤未结合蛋白。</li>
		<li>以 2 mL/min 流速用 2.5 CV（50 mL）100% 缓冲液 B 洗脱融合蛋白。上样和洗涤阶段使用 50 mL 分步收集，洗脱阶段使用 5 mL 分步收集。将结果与图 1D中的代表性结果进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取每份洗脱组分 20 µL 进行 SDS-PAGE 分析，并根据 IMAC 层析图谱的峰形合并含有融合蛋白的组分。加入（2S,3S）-1,4-双（巯基）丁烷-2,3-二醇（DTT）和 L-半胱氨酸粉末（终浓度均为 100 mM），通过轻轻颠倒离心管使其溶解。 
	注意：根据我们的经验，不同组分中融合蛋白的纯度相近。为防止高浓度组分发生聚集，建议在 IMAC 后尽快合并纯化的融合蛋白组分。此外，建议立即进行 SUMO 标签的切割和 HPLC 纯化。如有必要，可在本步骤暂停。将稀释后的融合蛋白溶液在液氮中速冻，于 -80 °C 保存，解冻后继续纯化，产率无明显下降。将稀释后的融合蛋白溶液在 4 °C 保存 24 小时也可获得类似结果。</li>
	<li>通过 SDS-PAGE 分析 IMAC 效果。向每个样品中加入 20 µL 上样染料。将粗提物（2.7）、未结合组分、洗涤组分以及洗脱峰各组分各取 2 µL 上样至 15% 凝胶。在 180 V 条件下电泳 90 分钟。按照制造商说明用考马斯亮蓝染料染色凝胶。将结果与图 1D中的代表性结果进行比较。</li>
</ol>
3. His6-SUMO 标签的切割及高效液相色谱纯化
注意：三氟乙酸（TFA）为挥发性液体，可导致严重灼伤，需小心操作。所有操作均应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（即一次性丁腈手套、护目镜和实验服。
<ol>
	<li>在5 L的瓶子中，使用塑料注射器将5 mL的TFA加入5 L的水中（溶剂A：H2O，0.1%（TFA）。用塑料注射器向2.5 L乙腈瓶中加入2.5 mL TFA（溶剂B：乙腈，0.1% TFA）。</li>
	<li>按照制造商建议准备高效液相色谱（HPLC）系统。进行空白运行以确保色谱柱清洁。</li>
	<li>在加入ULP1之前，取100 µL融合蛋白样品，用于通过UPLC监测切割反应（步骤3.5）。</li>
	<li>将20 mL融合蛋白转移至新的50 mL离心管中，加入0.4 mL ULP1储存液，冰上孵育。将剩余的融合蛋白置于冰上保存。 
	注意：泛素样特异性蛋白酶1（Ubiquitin-like-specific protease 1）的带His标签的催化片段403-621（以下简称 &#34;ULP1&#34;) 用于切割SUMO标签。融合蛋白比切割后的Httex1更稳定，因此不建议对整批样品进行SUMO标签切割。建议取适量分装样品，其体积应可直接并完全上样至HPLC柱。</li>
	<li>每10分钟取100 µL裂解反应样品，通过超高效液相色谱（UPLC）监测反应进程。将样品离心（18000 rpm，4 °C，2 min），取2 µL上清液进行UPLC分析（流动相B在A中的梯度从10%升至90%，0.25至3 min；10% B维持1 min；仪器操作请参照生产商说明书）。比较加入ULP1前后的样品所得色谱图，并将结果与代表性结果进行对比。 图2B.</li>
	<li>一旦SUMO切割完成（UPLC色谱图中融合蛋白的峰消失，并完全转化为新出现的SUMO和Httex1峰），用注射器滤器（0.22 µm）过滤样品。 
	注意：SUMO 蛋白酶切割反应通常非常迅速（在 4 °C 下反应 10–20 分钟），因此采用运行时间为 4 分钟的超高效液相色谱（UPLC）分析是监测该反应的有效工具。在高效液相色谱（HPLC）纯化前对样品进行过滤，主要是为了延长色谱柱使用寿命的预防性措施。样品不应出现浑浊。</li>
	<li>采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）纯化过滤后的样品（流动相A中含25–35%流动相B，40分钟内线性梯度洗脱，流速15 mL/min；0–10 min：5% B；10–12.5 min：5%至25% B；12.5–52.5 min：25%至35% B；52.5–57.5 min：35%至95% B；仪器操作请参照制造商说明书）。将结果与代表性结果进行比较 图2C. 
	注意：Httex1 和 His6-SUMO 可通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）有效分离。然而，在色谱峰的起始和末尾部分可能含有少量截短的 Httex1。收集较小的组分以获得最大量的高纯度目标物质。 
	&#8203;注意：使用适当的安全设备（即，实验服、隔热手套和面罩）在处理低温液体时。</li>
	<li>采用电喷雾离子化质谱法（ESI-MS，自动进样器，进样量 10 µL，流速 0.6 mL/min，流动相：A 中含 20% B，不使用色谱柱，仪器操作请参照制造商说明书）和超高效液相色谱法（UPLC）（梯度条件：在 0.25 至 3 分钟内，流动相 B 在 A 中的比例从 10% 升至 90%，随后保持 10% B 1 分钟，仪器操作请参照制造商说明书）分析 HPLC 分级组分。将纯度相近的组分合并至 50 mL 塑料管中，液氮冷冻后冻干。称重，将冻干蛋白转移至 2 mL 塑料管中，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>采用UPLC、ESI-MS和SDS-PAGE对纯化后的材料进行表征。将100 µg冻干的Httex1溶解于1.5 mL离心管中的8 µL纯TFA中，在室温下于密闭试管中孵育20分钟。在通风橱中用氮气或氩气流小心蒸发TFA。使用低压力的氮气或氩气，以避免样品损失。
	<ol>
		<li>将蛋白溶解于 100 µL H2O. 按照步骤 3.8 的方法，取 2 µL 进行超高效液相色谱（UPLC）分析，取 5 µL 进行电喷雾质谱（ESI-MS）分析。将 20 µL 蛋白溶液与 20 µL 2× 上样缓冲液混合。</li>
		<li>通过 SDS-PAGE 分析 1 µg 至 10 µg 的样品量。在 180 V 条件下电泳运行 90 分钟。根据生产商说明书使用考马斯亮蓝染料对凝胶进行染色。将结果与代表性结果进行比较 图2D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Httex1 蛋白的解聚与重溶解
注意：TFA 为挥发性液体，可导致严重灼伤，需小心操作。所有操作均应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（即 一次性丁腈手套、护目镜和实验服。
<ol>
	<li>在50 mL离心管中，用预混粉末配制10 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，pH 7.4）。每次使用前，通过0.2 µm滤膜过滤DPBS溶液。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，将150 µg冻干的Httex1溶于12 µL纯TFA中，于室温下在密闭试管中孵育20分钟。在通风橱中用氮气或氩气气流小心蒸发TFA。使用低压氮气/氩气以避免样品损失38。 
	注意：通常，使用4 µL TFA溶解并解聚50 µg蛋白。此过程将在试管内壁形成一层蛋白膜。为防止Httex1在后续步骤中立即聚集，请使用预冷缓冲液，始终保持蛋白在冰上操作，并避免高浓度。</li>
	<li>将解聚后的蛋白溶于1 mL预冷的DPBS中，并用1 M NaOH调节pH至7.2–7.4。将蛋白溶液通过100 kDa离心滤膜过滤至1.5 mL塑料离心管中（20000 × g，4 °C，20分钟）。 
	注意：Httex1的理论计算浓度应高于目标终浓度，以补偿可能的损失。过滤步骤对于去除蛋白溶解过程中可能形成的聚集体是必要的。</li>
	<li>使用基于氨基酸分析的UPLC标准曲线测定Httex1浓度（检测波长λ214），并送2 µg蛋白进行氨基酸分析以验证浓度10。计算需加入多少体积的DPBS以获得3 µM的Httex1浓度。</li>
	<li>加入计算量的DPBS将蛋白稀释至3 µM。在启动聚集实验方案前，将离心管保持在冰上。 
	注意：Httex1 43Q不应在溶液中储存。应始终根据上述方案新鲜配制蛋白溶液。Httex1蛋白最佳储存方式为冻干粉末，置于-20°C保存。</li>
</ol>
5. 使用超高效液相色谱和圆二色光谱监测 Httex1 43Q 的聚集动力学以及通过透射电子显微镜表征聚集体
<ol>
	<li>按照先前报道的方法制备用于透射电子显微镜（TEM）的甲酸铀酰溶液39。</li>
	<li>通过将3 µM的Httex1 43Q溶液在DPBS中于37 °C孵育来启动其聚集（使用上述去聚集方案中制备的1 mL溶液）。 
	注意：Httex1的聚集可在更高浓度下进行，具体取决于实验的需求和目的。</li>
	<li>在指定时间点（0、1、2、4、6、8、12、24、48和120小时）使用UPLC定量可溶性蛋白的含量。取35 µL等分试样，通过离心去除不溶性聚集体（20000 × g，4 °C，20分钟）。将4 µL上清液注入UPLC。利用仪器软件根据峰面积的变化计算可溶性单体的比例40。将结果与图3A中的代表性结果进行比较。</li>
	<li>使用圆二色光谱（CD）在0和48小时表征二级结构的变化。取100 µL等分试样，测量椭圆度（1 mm石英比色皿，195 nm至250 nm，20 °C，每0.2 nm采集一个数据点，扫描速度10 nm/min，数字积分时间2 s，带宽1.0 nm）。采集样品的6次光谱，使用卷积宽度为99的二项式滤波器进行平均和平滑处理。以平均残基摩尔椭圆度（θMRE）作图41。将结果与图3B中的代表性结果进行比较。</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）表征聚集体的结构和形态特征。将3 µL蛋白溶液滴加到经辉光放电处理的Formvar/碳支持膜覆盖的200目铜网上，静置1分钟。用15 μL水洗涤网格两次，再用15 μL 0.7%（w/v）甲酸铀酰洗涤一次，并用15 μL 0.7%（w/v）甲酸铀酰染色30秒。对网格进行TEM分析。将结果与图3C中的代表性结果进行比较。</li>
</ol>

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作者声明，他们对本文内容不存在任何利益冲突。

在本实验方案中，我们概述了一种高效获取毫克级天然、无标签Httex1蛋白的方法，该蛋白包含23或43个谷氨酰胺残基。该方法通过将Httex1以C端融合形式连接至His6-SUMO标签进行表达，利用IMAC从细胞裂解液中分离融合蛋白，并在HPLC纯化Httex1之前切除标签。尽管SUMO策略已被用于多种其他蛋白的制备，但我们的方法表明，SUMO的独特性质还可用于生成此前难以处理和表达的内在无序、易聚集、具有淀粉样形成倾向的蛋白43,44。我们所提供的方案简明易行，其操作难度与制备&#34;性质良好&#34;蛋白的方案相当。SUMO融合标签在表达及IMAC纯化过程中可有效溶解并稳定Httex1蛋白，而此前采用intein策略时出现的标签提前切割10以及蛋白聚集问题均不再发生。
内在无序蛋白特别容易发生降解。尽管采用本方案时N端N17区域的降解并非问题，但Httex1的PRD区域仍可能发生截短。由于截短后的蛋白在疏水性、电荷和大小方面与Httex1非常相似，因此通过色谱方法去除这些截短产物具有挑战性，故最好从源头上防止其产生。严格遵循实验方案、始终在冰上操作并使用足量的蛋白酶抑制剂，有助于将观察到的截短水平降至极低。在Httex1的C末端添加融合标签可轻松消除PRD区域的截短，因为截短后的蛋白将同时丢失亲和标签。然而，若需要保持天然序列，则此方法不可行，因为Httex1以脯氨酸结尾，据我们所知，目前尚无任何C末端融合标签能够实现在脯氨酸后高效且无痕的切割。
该实验方案中最关键的步骤是对ULP1酶切去除SUMO标签后释放的Httex1蛋白的处理。该蛋白应立即通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化。幸运的是，这一反应效率高且速度快，通常在4 °C条件下10–20分钟内即可完成。相比之下，使用内含肽（intein）策略时，内含肽的完全切割需要数小时，因此在切割不完全与蛋白聚集之间必须进行权衡，以最大化产率。对于突变型Httex1蛋白，必须快速处理，因为在酶切反应中相对较高的浓度下，该蛋白会开始发生聚集；而23Q变体则在较长时间内保持稳定。在RP-HPLC纯化过程中，SUMO的另一优势也显现出来：Ssp DnaB内含肽具有较强的疏水性，会牢固地吸附在色谱柱上，而SUMO更具亲水性，能够从C4反相色谱柱中完全洗脱。尽管商业化的ULP1价格较高，但根据已发表的方案29，该蛋白可被高效地大量制备。
在使用Httex1之前应用去聚集处理方案的重要性再怎么强调也不为过。诸如Httex1之类的冻干polyQ蛋白虽然稳定且可长期储存，但在水和缓冲液中并不能完全溶解。预先形成的寡聚体或纤维的存在可能对蛋白的聚集动力学和生物物理特性产生显著影响45。本文所述的去聚集处理方案可实现蛋白的解聚，去除预先形成的聚集体，并从冻干样品中获得单体形式的Httex1溶液。我们观察到，通过SUMO方法和内含肽策略获得的Httex1在聚集动力学和纤维形态方面表现相似。
与之前制备 Httex1 的方法相比，本文所述的 SUMO 策略具有多项优势，拓展了研究该蛋白在健康与疾病状态下结构和功能特性的可能性。SUMO-Httex1 融合蛋白易于操作，可冷冻保存，或在室温下以溶液形式稳定保存24小时，而游离的 mHttex1 则会迅速发生聚集。SUMO-Httex1 融合蛋白的良好稳定性与高溶解度，使得对蛋白进行操作，或在 mHttex1 中引入酶学与化学修饰变得更加灵活，而这些修饰在切割后通常难以实现。这包括引入翻译后修饰、荧光团、自旋标记、生物素标签等， 等等。 本文所展示的进展应能：1）促进未来对Httex1结构与功能关系的阐明；2）生成用于研究Htt聚集及病理扩散的新工具；3）推动开发新型检测方法，以鉴定可稳定突变型Httex1并阻止其聚集的分子；4）鼓励来自其他领域的科学家投身于该蛋白的研究，共同推进亨廷顿病治疗策略的探索。

Htt 是一种 348 kDa 的蛋白质，已被发现参与多种生理功能1当Htt的N端含有超过36个残基的扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）区域时，会导致亨廷顿病（HD）2,3亨廷顿病（HD）的病理特征是纹状体和大脑皮层中出现细胞内包涵体，进而导致受累组织的神经元死亡和萎缩4,5已检测到多种包含多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列的N端Htt片段 死后 亨廷顿病患者脑组织中的病变，被认为是由亨廷顿蛋白的蛋白水解加工过程所产生6最近的研究表明，Httex1 也可能由于异常的 mRNA 剪接而形成。Httex1 含有致病性的多聚谷氨酰胺（polyQ）突变，其在动物中的过表达能够重现亨廷顿病（HD）的许多关键特征。7，从而强调了该片段在亨廷顿病病理及疾病进展中可能具有的核心作用6,8,9.
由于带有扩展多聚谷氨酰胺（polyQ）序列的突变型Httex1（mHttex1）具有高度聚集倾向，目前大多数表达系统均依赖于将Httex1瞬时融合至某些蛋白质（如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、硫氧还蛋白（TRX）或麦芽糖结合蛋白（MBP））和/或短肽（如多聚组氨酸），以不同程度地改善其表达水平、稳定性、纯化效率和/或溶解性10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28。融合伴侣通过一段包含蛋白酶切割位点（如胰蛋白酶、烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶或PreScission蛋白酶）的短序列与Httex1相连，以便在聚集开始前或纯化前对融合蛋白进行切割并释放出Httex1。这些方法的局限性包括：非无痕切割可能导致额外残基残留，以及在Httex1序列内部发生错误切割而产生截短片段，此外还可能因切割不完全而导致产物异质性（详见Vieweg et al. 对该策略优缺点的深入讨论）10。 为克服上述局限，我们近期开发了一种表达策略，首次实现了无标签的天然Httex1的制备，该方法利用Synechocystis sp.（Ssp）DnaB内含肽与Httex1的N端进行瞬时融合10。尽管内含肽切割具有无痕性和特异性，并可获得毫克级蛋白产物，但仍存在两个可能降低产率的缺点：一是在表达过程中可能发生提前切割，二是切割过程需持续数小时，这可能导致蛋白因聚集而损失，尤其是对于含扩展polyQ重复序列的Httex1。
为解决这些局限性并优化天然、无标签Httex1的制备策略，我们开发了一种新的表达系统，该系统基于SUMO（确切而言是酵母同源物Smt3）与Httex1的瞬时融合。SUMO系统用于重组蛋白表达的首次报道发表于2004年29，其中展示了SUMO融合蛋白的表达率和溶解度均有所提高。SUMO标签可由泛素样蛋白特异性蛋白酶1（ULP1）切割，该酶无需识别位点，而是识别SUMO的三级结构，从而几乎完全避免了错切的可能性30此外，ULP1介导的切割反应迅速且无痕，不会留下额外的残基。而使用自催化内含肽时观察到的融合标签过早切割问题，10，通过要求使用外源蛋白酶而完全避免了这一问题。如今，SUMO策略已广泛用于重组蛋白的生产31,32,33本文中，我们证明该方法特别适用于生成如Httex1这类具有内在无序性、易聚集且具有淀粉样蛋白生成倾向的蛋白质。我们相信，基于SUMO融合的这一方法因其简便性、高效性和稳健性，将使天然、无标签的Httex1更易于被来自不同学科领域的研究人员获取，同时避免使用Httex1的非天然序列 体外这一重要进展将有助于推动未来对Httex1结构与功能关系的阐明研究。
该方案描述了从12 L细菌培养物中纯化Httex1的方法，但也可轻松适用于更小或更大规模的制备。本方案介绍了野生型Httex1（wtHttex1）的制备，其polyQ重复长度低于（23Q）以及突变型Httex1（mHttex1）的制备，其polyQ重复长度高于致病阈值（36Q）（43Q）。

<table><tbody><tr><td>甲酸铀酰（UO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(CHO2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>200目Formvar/碳膜铜网，Cu 50</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>高精度石英SUPRASIL比色皿，光程1 mm，来自Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液成分：杜氏磷酸盐缓冲液（不含 Ca 和 Mg 的 PBS），产品编号 47302（室温），SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria肉汤（Miller's LB肉汤）</td><td>&amp;nbsp;Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&amp;nbsp;蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>抗亨廷顿蛋白抗体，氨基酸 1-82</td><td>默克密理博公司</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD 山羊抗小鼠 IgG（H + L）</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168.P0</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10 &amp;micro;m C4 300 &amp;Aring;，液相色谱柱 250 x 21.2 mm，Phenomenex，19x10 mm 保护柱，未带温控夹套</td></tr><tr><td>乙腈 HPLC</td><td>Macherey-Nagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>无预滤器无菌滤膜注射器 Filtropur S 0.45 μm</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计半微量比色皿</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop，1/16&quot; 配件（&amp;Auml;KTAdesign)，50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER FPLC 用试管，16 x 100 mm，容量 12.0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;100 kD Microcon&amp;nbsp; 快速流过滤器</td><td>默克密理博公司</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 超声波液体处理器</td><td>声学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;配备组分收集器的kta 900&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 圆二色光谱仪</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLC 系统&amp;nbsp;</td><td>沃特斯</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 微米色谱柱&amp;nbsp; ，预热柱（40 &amp;deg;C），流速0.6 mL/min，进样体积4 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>waters 高效液相色谱系统</td><td>沃特斯</td><td></td><td>2489 紫外检测器和 2535 四元梯度模块，FlexInject 外壳中的 20 mL 定量环</td></tr><tr><td>ESI-MS：Finnigan LTQ</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冻干仪</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&amp;nbsp;</td><td>FEI</td><td></td><td>配备LaB6电子枪和4K × 4K FEI Eagle CCD相机（FEI）并在80 kV条件下运行的电子显微镜</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 摇床震荡&amp;nbsp; 培养箱</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用sumo融合策略生成天然无标签的亨廷顿蛋白外显子1单体及纤维

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

亨廷顿病（Huntington's Disease，HD）是一种由HD基因第一外显子中CAG重复扩增（≥36）引起的遗传性致命神经退行性疾病，导致亨廷顿蛋白（Htt）或其N端片段表达出异常延长的多聚谷氨酰胺（polyQ）序列。
亨廷顿蛋白（Htt）的第1个外显子片段（Httex1）是能够在细胞和动物模型中重现亨廷顿病（HD）多种特征的最小Htt片段，也是目前被最广泛研究的Htt片段之一。相较于更长的片段或全长Htt，Httex1较小的分子量使其在实验上更易于通过常规和高分辨率技术进行生物物理表征。然而，突变型Httex1（mHttex1）由于多聚谷氨酰胺（polyQ）长度增加（≥42），具有高度聚集倾向，这使得开发高效表达与纯化系统以大量制备该蛋白变得困难，也限制了不同学科研究人员在无需使用融合蛋白或其他改变蛋白天然序列策略的情况下获取该蛋白。本文介绍了一种基于小泛素样修饰蛋白（SUMO）瞬时融合的优化且稳健的方法，可用于制备毫克级的天然、无标签Httex1。该策略的简便性和高效性将消除对非天然Httex1序列的依赖，从而使更多研究人员能够获得该蛋白，并提高不同实验室间实验结果的可重复性。我们相信，这些进展还将有助于未来深入研究Htt的结构与功能关系，并推动新型诊断工具及治疗手段的开发，以干预或延缓HD的进展。

Httex1 在……中表达 E. coli 带有N端His标签6-SUMO标签。融合蛋白表达与纯化的代表性结果总结如下 图1Httex1 的序列包含 Htt 的 2-90 位氨基酸残基，以 Ala2 起始，因为 Met1 已被完全切除 体内42氨基酸的编号参照23Q变体，所表达的融合蛋白的完整序列如下所示： 图1A质粒将在近期提交至 Addgene，以便与科研社区共享。质粒及所表达的融合蛋白的示意图如下所示 图1BHis6-SUMO Httex1 表达水平中等（图1C）并且在裂解后，23Q 和 43Q 变体的融合蛋白大部分均存在于可溶性组分中。该融合蛋白的迁移位置高于其理论分子量预期值，这在一定程度上是由于 SUMO 结构域的紧密折叠，但主要归因于 Httex1 序列组成的特殊性，其富含谷氨酰胺和脯氨酸残基。通过 IMAC 可将野生型（23Q）和突变型（43Q）的融合蛋白纯化至约 80% 的纯度图1D共纯化宿主蛋白的存在可归因于Httex1的表达水平相对较低以及上样到层析柱的样品体积较大。
His6-SUMO 标签的切割及 Httex1 的纯化过程如图 2A所示。UPLC 是监测 His6-SUMO 标签切割的有效工具（图 2B）。融合蛋白的原始峰逐渐消失，同时出现两个对应于 His6-SUMO 标签和 Httex1 的新峰，且峰形分离良好。切割反应在 10–20 分钟内完成。Western Blot（WB）检测速度较慢，难以高效监测切割反应进程，但为便于参考及验证 SUMO 切割的完全性，图中仍展示了 WB 结果。Httex1 23Q 和 43Q 均可通过 RP-HPLC 与 His6-SUMO 标签良好分离（图 2C），并获得高纯度产物，UPLC、MS 及 SDS-PAGE 分析结果均证实了这一点（图 2D）。
为了证明通过本方法制备的 Httex1 蛋白保留了 Httex1 预期的聚集特性，我们采用沉降实验在 37 °C 下评估了突变型 Httex1 的纤维化动力学，通过圆二色（CD）光谱监测其二级结构的变化，并利用透射电子显微镜（TEM）对聚集物的形态进行表征。由沉降实验测定的 mHttex1 纤维形成聚集动力学的代表性数据如图 3A所示。通过超高效液相色谱（UPLC）定量分析了由于纤维形成导致的可溶性 Httex1 43Q 随时间减少的情况。我们观察到，在孵育 48 小时后，可溶性蛋白已完全耗尽。此外，我们通过 CD 光谱法测定了蛋白的二级结构（图 3B）。Httex1 43Q 在孵育 48 小时后，其构象从无规卷曲（λmin 205 nm）转变为以富含 β-折叠为主（λmin 215 nm）的构象。这一结构变化伴随着在孵育 48 小时时通过 TEM 观察到的长链状纤维聚集物的形成（图 3C）。
<img alt="蛋白质表达、溶解度、纯化；电泳分析、色谱；质粒图谱，IPTG诱导。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1．His6-SUMO Httex1 融合蛋白的表达与纯化。  
(A) His6-SUMO-Httex1-QN 融合构建体的氨基酸序列（His6-SUMO 部分为绿色，Httex1-QN 部分为橙色）；(B) 融合蛋白表达与纯化的示意图；(C) 裂解后融合蛋白表达及溶解度的SDS-PAGE分析；(D) 融合蛋白的IMAC纯化色谱图及各组分的SDS-PAGE分析（红色条带：未结合组分，蓝色条带：洗涤组分，黑色条带：含洗脱峰的组分）； <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质纯化；HPLC 色谱图、SDS-PAGE 结果，显示 SUMO 切割及纯化步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. His标签的切割6 SUMO标签及无标签Httex1-Q的纯化N 蛋白质 
(A）示意图概述；（B) 通过UPLC分析ULP1对SUMO标签的切割效果（蓝色：加入ULP1前；黑色：加入ULP1后20分钟（23Q）和10分钟（43Q））以及WB检测（MAB5492 1:2000，二抗为 goat anti mouse 抗体 1:5000）；C) Httex1 的制备型反相高效液相色谱纯化色谱图；D：通过超高效液相色谱、SDS-PAGE 和电喷雾电离质谱对纯化的 Httex1 进行分析；预期分子量分别为 9943 Da（23Q）和 12506 Da（43Q）。 <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质聚集分析；图示、CD光谱、电子显微镜图像；溶解度、结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3．Httex1-43Q 的聚集：（A）基于UPLC的沉淀分析。（B）0 h和48 h时二级结构的CD光谱。（C）48 h时聚集体的TEM显微图像（比例尺为200 nm）。<a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种基于小泛素样修饰蛋白（SUMO）瞬时融合的稳定且经过优化的实验方案，可用于制备毫克级的亨廷顿蛋白外显子1（Httex1）的天然、无标签单体及纤维。

利用SUMO融合策略生成天然无标签的亨廷顿蛋白外显子1单体及纤维

亨廷顿病（Huntington's Disease, HD）是一种由HD基因第一外显子中CAG重复序列扩增（≥36次）引起的遗传性致命神经退行性疾病，……

该方法可生成携带蛋白质天然序列的无标签第一外显子，为研究该蛋白质的结构与功能关系提供了新的机会，从而有助于我们理解其在健康与疾病状态下的功能。该方法的主要优势在于其简便性、高效性和稳健性。通过消除序列的异质性，该方法将能够并促进不同实验室之间的比较与结果的可重复性。尽管该方法是为亨廷顿蛋白外显子1的制备而开发的，但也可应用于其他易于聚集的体系，如淀粉样β肽和α-突触核蛋白。首先，使用0.45微米注射器滤器过滤先前分离的含有His-SUMO亨廷顿蛋白外显子1融合蛋白的上清液。从过滤后的上清液中取出20微升样品用于SDS-PAGE分析。将澄清的裂解液加入Superloop中。在4°C条件下，使用快速蛋白液相色谱系统通过固定化金属亲和层析法从澄清的细菌裂解液中纯化His-SUMO亨廷顿蛋白第一外显子融合蛋白。以每分钟10毫升的速度，用10个柱体积（即200毫升）的A缓冲液洗涤，以去除未结合的蛋白质。以每分钟2毫升的速度，用2.5个柱体积或50毫升100%缓冲液B洗脱融合蛋白。每管收集的组分取20微升用于SDS-PAGE分析。向每个样品中加入20微升上样染料。取2 µL粗蛋白、未结合组分、洗涤组分以及洗脱峰的每个组分，上样至15%凝胶。在180伏电压下电泳90分钟。电泳结束后，按照生产商说明书用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色。根据色谱图的峰位置合并含有融合蛋白的组分。然后向合并的组分中加入100毫摩尔的DTT和100毫摩尔的L-半胱氨酸，并通过轻轻颠倒离心管使其溶解。为制备高效液相色谱纯化用的溶剂A，将2毫升三氟乙酸加入2升的水瓶中。配制溶剂B时，将2.5毫升三氟乙酸加入2.5升乙腈瓶中。按照制造商建议准备高效液相色谱系统。进行一次空白运行，以确保色谱柱洁净。随后，取 100 微升加入 ULP1 前的融合蛋白，用于通过 UPLC 监测切割反应。将 20 毫升融合蛋白转移至新的 50 毫升离心管中，并加入 0.4 毫升 ULP1 储存液。将样品置于冰上孵育，同时将剩余的融合蛋白也保留在冰上。在中间步骤中不要储存蛋白质，应持续进行纯化直至完成。每10分钟取出100微升裂解反应液，以监测UPLC的反应进程。样品离心后，取每份上清液2微升进行UPLC分析。比较加入ULP1前后的样品所得色谱图。SUMO切割完成后，使用22微米针头过滤器过滤样品。接着，通过反相高效液相色谱法纯化过滤后的样品。通过UPLC和ESI-MS分析HPLC组分。将纯度相似的组分合并至50毫升塑料管中。用液氮冷冻样品并进行冻干。然后将冻干蛋白转移至2毫升塑料管中，在-20摄氏度下保存。在1.5毫升离心管中，将100微克冻干的亨廷顿蛋白第一外显子溶解于8微升纯三氟乙酸中。室温孵育20分钟后，在通风橱中用氮气或氩气气流小心蒸发三氟乙酸。蛋白干燥后，将其溶解于100微升水中。然后取2微升样品进行超高效液相色谱（UPLC）分析。接着将20微升蛋白溶液与20微升2倍上样染料混合。通过SDS-PAGE分析1至10微克的蛋白质样品。在180伏电压下电泳90分钟。电泳结束后，根据制造商说明书用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色。在50毫升离心管中准备10毫升DPBS。每次使用前，通过2微米滤膜过滤DPBS溶液。随后，在1.5毫升离心管中，将150微升冻干的亨廷顿蛋白第一外显子溶解于12微升纯三氟乙酸中。室温孵育20分钟后，在通风橱中用氮气或氩气流小心蒸发三氟乙酸。将解聚的蛋白质溶于1毫升预冷的DPBS中，并用1摩尔氢氧化钠调节pH至7.2至7.4之间。然后将蛋白质溶液通过100千道尔顿的离心过滤器过滤至1.5毫升塑料管中。使用基于氨基酸分析检测的UPLC标准曲线测定亨廷顿蛋白第一外显子的浓度。然后计算需要加入的DPBS体积，以获得3 µM的亨廷顿蛋白第一外显子浓度。通过向试管中加入计算量的DPBS，将蛋白质稀释至3 µM。在开始聚集实验方案之前，将离心管置于冰上保存。必须通过电子显微镜及其他技术进行验证，以确认去聚集实验方案已成功去除任何预先形成的聚集体。此处显示的是所表达融合蛋白的完整氨基酸序列。此处展示了质粒及表达的融合蛋白的示意图。His-SUMO 亨廷顿蛋白第一外显子表达水平中等，无论是在23个谷氨酰胺还是43个谷氨酰胺变异体中，裂解后大部分融合蛋白均存在于可溶性组分中。通过固定化金属亲和层析，野生型和突变型融合蛋白均可富集至约80%的纯度。此处展示了His-SUMO标签的切割及亨廷顿蛋白外显子一的纯化结果。原始的融合蛋白峰被消耗，出现两个对应于His-SUMO标签和亨廷顿蛋白外显子一的新峰，且分离良好。通过反相高效液相色谱，可将含23个谷氨酰胺和43个谷氨酰胺的亨廷顿蛋白外显子一分离出来，并通过UPLC、质谱和SDS-PAGE分析证实其具有高纯度。通过沉降实验测定的m-Huntingtin外显子1纤维形成的聚集动力学显示，在孵育48小时后可溶性蛋白完全耗尽。圆二色光谱（CD）对蛋白质二级结构的分析表明，Huntingtin外显子1含43个谷氨酰胺的序列从无规卷曲构象转变为富含β-折叠的构象。这一结构变化伴随着长链纤维状聚集体的形成，透射电子显微镜（TEM）观察证实了这一点。一旦掌握，若操作得当，该 Huntingtin 第一外显子蛋白的表达与纯化方法可在三天内完成。在进行该实验时，必须牢记：Huntingtin 第一外显子蛋白，尤其是含扩展多聚谷氨酰胺片段的蛋白，极易发生聚集。得益于该方法，我们能够制备足量的 Huntingtin 第一外显子蛋白，开展以往难以实现的研究，以探究该蛋白的结构、聚集特性及毒性，并开发新的检测与定量方法，用于识别和量化与疾病相关的 Huntingtin 第一外显子蛋白形式。SUMO融合蛋白具有稳定性高和溶解性好的特点，这为蛋白质的操作提供了更大的灵活性，并允许在融合蛋白的背景下引入修饰，而这些修饰在切割后通常是无法实现的。我们希望本方法的简便性和高效性能够消除对非天然序列和模型系统的依赖，鼓励来自不同学科的研究人员加入我们，共同探索这种重要蛋白质的生物学功能，并开发治疗亨廷顿病的有效疗法。

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