Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

该程序的总体目标是测量小鼠真皮中的血管渗漏，这是由皮内注射通透性促进剂诱导的。该程序可以帮助回答有关体内血管通透性调节的关键问题，例如哪些分子可以刺激或抑制血管渗漏以及涉及哪些信号通路。该程序的主要优点是快速且相对简单，并且主要使用常见的实验室试剂和材料。

该技术的意义延伸到病理性水肿疾病的治疗。特别是，研究人员可以使用该测定法来识别新的分子靶标，并以相对快速和简单的方式测试相关药物抑制血管通透性的能力。在 0.9% 盐水溶液中制备组胺抑制剂马来酸吡拉明和埃文思蓝染料的单独溶液。

然后在层流柜中工作，通过 0.22 微米过滤器对溶液进行消毒。将两种溶液装入装有 30 号针头的单独的 1 毫升注射器中。接下来，划动鼠标。

然后倾斜鼠标，使头部指向地面，腹部向上。小鼠定位后，通过腹膜内注射每克体重施用 10 微升马来酸吡拉明溶液。接下来，为了促进血管舒张，将鼠标放入 37 摄氏度的热室中 10 分钟。

然后将鼠标移动到鼠标限制器上。接下来，用 70% 乙醇摩擦尾巴以进一步舒张血管。通过尾静脉静脉注射 100 微升 Evans Blue 染料溶液。

为防止出血，请快速将尾部夹在手指和拇指之间，并在注射部位施加压力。将 Evans Blue Dye 静脉注射到小鼠的尾静脉中是该程序中困难且关键的步骤。因此，研究人员在进行其余手术之前必须有能力进行这种注射。

建立能力需要事先实践。使用磷酸盐缓冲盐水的无菌溶液稀释 VEGF 试剂，使剂量的最终体积为 20 微升。然后将 VEGF 渗透性诱导试剂和载体控制器装入两个单独的 300 微升注射器中，这些注射器配有 31 号针头。

将针头与皮肤保持 15 度角，并将 20 微升 VEGF 皮内注射到小鼠侧面。在皮肤内找到一个凸起的气泡以验证注射是否成功。在至少相距 1 厘米的另外两个部位进行皮内注射。

然后转动鼠标以露出第二个侧面，并使用载体溶液重复三次重复注射。在纸上保留每个注射部位的记录以及注射程序终止的时间。然后将鼠标转移到本垒架上。

继续监视鼠标，直到它恢复意识并开始在笼子周围移动。让 VEGF 溶液作用 20 分钟，然后再调用鼠标。在此阶段，按照相同的程序依次将 VEGFA 和载体注射到所有小鼠中。

20 分钟后，将每只被安乐死的小鼠仰卧，并将其脚固定在用干净纸巾包裹的软木板上。接下来，在钝剪刀的帮助下，从死老鼠的下腹部到胸部做一个三到四厘米长的垂直切口。然后用镊子和手术刀从侧面两侧梳理皮肤。

使用手术刀去除渗漏部位周围区域存在的任何脂肪。然后使用镊子和手术刀用泄漏的 Evans Blue 染料切除皮肤区域。切除的皮肤区域必须具有相似的大小。

将皮肤样品转移到 1.5 毫升试管中并相应地标记。将打开的试管放入加热块中过夜，使样品干燥。干燥完成后，在通风橱中向样品中加入 250 μL 去离子甲酰胺。

盖上试管盖并将其放入加热块中过夜以提取 Evans 染料。在台式离心机中以 10， 000 g 或更高的浓度离心样品 40 分钟。离心后，将 100 微升每种含染料的上清液从离心样品中转移到在通风橱中运行的 96 孔板的孔中。

使用分光光度计读取 Evans Blue 吸光度。为了研究 VEGF 诱导的血管渗漏，向小鼠注射 50 ng磷酸盐缓冲盐水中的 VEGFA 或仅磷酸盐缓冲盐水作为载体。该图像显示，与原位载体对照相比，注射 VEGFA 的皮肤样品中泄漏的 Evans Blue 染料的积累有所增加。

这张 96 孔板图像显示了从皮肤样品中以甲酰胺形式提取的负载 Evans Blue 染料。该图形图显示了配对 VEGFA 和仅载体对照样品的归一化吸光度值。该图显示，与仅注射载体相比，注射 50 纳克 VEGFA 显着增加了 Evans Dye 的泄漏。

该图是在量化 VEGFA 光密度与载体样品的倍数变化后获得的。该图显示，与仅使用载体相比，施用 VEGFA 后血管渗漏平均增加三倍。一旦掌握，如果执行得当，这项技术的主要部分可以在两个小时内完成。

在执行此过程时，重要的是将药物诱导的血管渗漏正常化为载体诱导的血管渗漏，以解释小鼠之间的非特异性血管渗漏和差异。该程序可以与其他方法（例如给药）结合使用，以回答诸如是否可以靶向蛋白质以抑制血管通透性等问题。开发后，这项技术为血管生物学领域的研究人员探索转基因小鼠血管高通透性的分子机制铺平了道路，确定了血管渗漏所需的关键信号成分。

看完这个视频，你应该对如何诱导和测量小鼠真皮中的血管渗漏有一个很好的了解。