Name: 用迈尔斯测定法评价皮肤血管 Hyperpermeability 诱导剂的含量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习使用迈尔斯测定法在小鼠皮肤中定量检测血管通透性诱导剂的效果。该方法利用Evans Blue染料和分光光度分析，帮助研究人员快速评估血管渗漏程度并筛选潜在治疗靶点。

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感谢伦敦大学学院眼科研究所生物资源中心的 Laura Denti、Valentina Senatore 及其工作人员在小鼠饲养方面提供的帮助，以及 Camille Charoy 提供的技术支持。本研究得到了医学研究理事会资助（MR/N011511/1，授予 C. Ruhrberg）和英国心脏基金会博士生奖学金（FS/13/59/30649，授予 J.T. Brash）的支持。

所有动物实验均按照英国政府内政部以及机构动物福利与伦理审查委员会（AWERB）的指南进行。
1. 小鼠准备
注意：对至少 8 周龄、最多 6 月龄的成年小鼠进行实验。为了在不同动物之间验证该实验操作的可重复性以及各步骤时间的一致性，每次实验至少使用 2 只、最多 6 只小鼠。为了评估基因修饰小鼠中某种突变对通透性诱导物质的影响，理想情况下，每次实验应使用 2 只突变小鼠和 2 只同窝对照小鼠。
<ol>
	<li>在诱导血管通透性升高前24小时，使用合适的吸入性麻醉剂（如异氟烷）对小鼠进行麻醉。诱导麻醉时使用3%异氟烷，直至小鼠失去翻正反射且对外界刺激无反应。维持麻醉时使用1.5%异氟烷（确保小鼠呼吸频率保持稳定）。在麻醉状态下，使用电动剃毛器小心剃除每只小鼠两侧 flank 部位的毛发，注意避免损伤皮肤。 
	注：使用麻醉是为了避免动物产生应激反应，并减少剃毛过程中的活动，从而防止皮肤损伤。</li>
	<li>将剃毛后的小鼠放回其饲养笼中。对于雄性小鼠，在麻醉恢复后应将每只雄鼠单独饲养于独立笼具中，以防止争斗导致皮肤损伤。对于雌性小鼠，可将其以群体形式放回原饲养笼中。 
	注：若观察到雄性小鼠在笼内出现争斗行为，应在实验前将其提前3天分笼饲养，以便可能存在的皮肤损伤得以愈合。</li>
	<li>持续观察小鼠直至其恢复意识（通常在数秒内）并在笼内活动（通常在1分钟内）。</li>
</ol>
2. 静脉注射伊文思蓝染料
<ol>
	<li>在超净工作台中，分别配制组胺抑制剂马来酸吡拉明（4 µg/µL，溶于0.9%生理盐水）和伊文思蓝染料（1% w/v，溶于0.9%生理盐水）的无菌溶液。将溶液通过22 µm滤器过滤以实现灭菌。</li>
	<li>使用带有30 G针头的无菌1 mL注射器，按每克体重10 µL的剂量向每只小鼠腹腔注射马来酸吡拉明溶液（图1A）。注射时，先固定小鼠颈部皮肤，然后倾斜小鼠使其头部朝下、腹部朝上。在腹部下半区避开中线的位置进行注射，以避免刺中膀胱。 
	注意：8周龄至6月龄小鼠的体重通常在15至30 g之间。马来酸吡拉明可抑制内源性组胺的释放，否则组胺会独立于待测物质引发血管渗漏。</li>
	<li>将小鼠置于37 °C加热舱中10分钟，以促进血管扩张。或者，若当地伦理指南允许，可使用适当的加热灯照射尾部以促进血管扩张。</li>
	<li>每次将一只小鼠放入固定器中，并用70%乙醇擦拭尾部，以清洁注射区域并进一步促进血管扩张。</li>
	<li>使用带有30G针头的无菌1 mL注射器，经尾静脉静脉注射100 µL伊文思蓝染料（图1B）。注射后立即用手指和拇指夹住尾部对注射部位施加压力，以防止出血。 
	注意：通过将灯光照射至注射区域可改善尾静脉的可视化效果。有关小鼠尾静脉注射操作的更多细节可参见已发表的实验方案18。</li>
	<li>让染料循环30分钟。</li>
</ol>
3. 诱导血管高通透性
<ol>
	<li>在超净工作台中使用无菌溶液，将待研究的通透性诱导剂稀释至最终剂量可溶于20 µL体积的浓度。 
	注意：在图1-图2所示的示例实验中，使用VEGFA在PBS中以2.5 ng/µL的浓度刺激血管高通透性，总剂量为50 ng；同时使用PBS作为溶剂对照。</li>
	<li>将待研究的通透性诱导剂和溶剂对照分别装入两个无菌的300 µL注射器（配备31 G针头）。每只小鼠需进行三次重复注射，每次20 µL，因此需准备足够的溶液量（即每只小鼠的试剂和溶剂各准备60 µL，并额外补充针头死体积所需的溶液量）。</li>
	<li>使用异氟烷对第一只待测小鼠进行麻醉（诱导麻醉浓度为3%，直至翻正反射消失且小鼠对外界刺激无反应；维持麻醉浓度为1.5%，确保小鼠呼吸频率稳定）。</li>
	<li>将20 µL通透性促进剂通过皮内注射方式注入小鼠侧腹部（图1C）。确保针头与皮肤呈15°角。观察皮肤是否形成隆起的气泡，以确认注射成功。在另外两个部位重复皮内注射，各注射点之间至少相距1 cm。</li>
	<li>翻转小鼠以暴露另一侧腹部，并使用对照溶剂溶液进行三次重复注射。在纸上记录每个注射位点的位置，以便后续采集皮肤样本时准确定位。 
	注意：此阶段应小心处理小鼠皮肤；例如，在进行皮内注射时避免夹捏皮肤。</li>
	<li>将注射后的小鼠放回其原饲养笼中，并持续观察直至其恢复意识（通常在数秒内）并在笼内自由活动。</li>
	<li>在第一只小鼠恢复期间，立即对第二只小鼠重复步骤3.3至3.5，依此类推（每轮实验最多可处理6只小鼠）。记录每只小鼠的注射时间，以便调整后续实验步骤的执行时间。</li>
</ol>
4. 皮肤真皮层中积累的伊文思蓝的定量分析
<ol>
	<li>在小鼠接受皮内注射后20分钟，按注射顺序依次通过颈椎脱位处死每只小鼠。 
	注意：血管渗漏的持续时间可能因所用通透性诱导剂的不同而有所差异，因此皮内注射与处死之间的时间可能需要优化。</li>
	<li>将每只处死的小鼠仰卧放置，并用大头针将其四肢固定在包裹清洁纸巾的软木板上（图1D）。</li>
	<li>使用钝头剪刀，从腹部下端向上沿中线做一条长约3–4&#160;cm的纵向切口。用镊子和手术刀从两侧剥离皮肤，暴露真皮内侧及伊文思蓝积聚部位（图1E）。将剥离的皮肤固定，用手术刀去除渗漏区域周围的脂肪组织。如需记录，可拍摄代表性照片以展示伊文思蓝在皮肤中的渗漏程度。</li>
	<li>使用镊子和手术刀，分别切除各注射位点（包括通透性诱导剂或对照溶剂注射位点）含有渗漏伊文思蓝染料的皮肤区域。 
	注意：应尽量切除大小相近的皮肤区域，以确保在后续步骤4.7中，每份皮肤样本吸附的甲酰胺体积相近，从而使提取的染料稀释于相似体积的剩余甲酰胺中。步骤3.5中记录的注射图谱有助于确定需切除的区域范围。</li>
	<li>将每份样本放入一个1.5 mL离心管中，并做好相应标记，确保样本平置于管底。将样本保存于-20 °C，待后续使用。若立即处理，则继续执行以下步骤。</li>
	<li>将离心管敞口置于55 °C的烘箱或加热块孔中，过夜干燥皮肤样本。</li>
	<li>在通风橱中，向各样本加入250 µL去离子甲酰胺，盖紧管盖。确保所有皮肤样本均被甲酰胺覆盖，并在55 °C烘箱或加热块中孵育过夜，以提取伊文思蓝染料。</li>
	<li>将样本在台式离心机中以最大速度（&#62;10,000 x g）离心40分钟。</li>
	<li>在通风橱中，从每份样本中吸取100 µL含染料的上清液，分别转移至透明平底96孔板的独立孔中（图2A）。</li>
	<li>使用分光光度计测定伊文思蓝在620 nm处的最大吸收峰，参考波长设为740 nm。 
	注意：620 nm为伊文思蓝的最大吸收波长，而740 nm不被伊文思蓝吸收，作为背景校正参考波长。</li>
	<li>对每只小鼠中同一试剂或溶剂的三份重复注射样本的吸光度读数取平均值，以消除技术误差（图2B）。</li>
	<li>计算通透性诱导剂组相对于溶剂对照组的吸光度读数倍数差异（图2C）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

自1952年首次描述以来17，Miles实验为研究人员提供了一种相对快速、简单且可靠的方法，用于研究血管高通透性的分子机制。例如，Miles实验已被用于检测不同试剂诱导高通透性的能力或效力19,20,21，或用于评估抑制高通透性试剂的有效性8,22,23。另一个例子是，在基因修饰小鼠及其同窝对照小鼠中测试可诱导血管通透性的试剂，以确定特定受体和信号转导蛋白在配体诱导的高通透性反应中的必要性10,11,12,13,14,15,20,23。此后，已采用多种改良版本的Miles实验，例如在所用示踪剂方面的改进。因此，在一些研究中，伊文思蓝已被不同大小的荧光标记葡聚糖或微球所替代11,13。
与用于研究血管高通透性机制的其他检测方法相比，Miles 检测的主要优势在于其操作相对简便，且无需昂贵的设备。此外，作为一种体内技术，该检测可在完整血管的背景下模拟&#160;血管渗漏现象，而不同于跨室通量检测或跨内皮电阻（TEER）检测等体外检测方法，后者仅专注于内皮单层屏障。其他用于检测血管高通透性的体内方法可能与本文所述的 Miles 检测有所不同，例如通过不同的途径递送诱导高通透性的试剂，或在不同部位分析血管渗漏，比如通过尾静脉系统性给予试剂后，在肺或气管中检测血管渗漏11,13,15。Miles 检测的一个局限性在于，原则上，某些试剂的皮内注射除了破坏内皮屏障外，还可能影响血压和血流，从而间接影响血管通透性。然而，最近已有研究表明，该检测可独立于对全身血压的影响，特异性地测量由 VEGF-A 诱导的血管通透性15。Miles 检测的另一个局限性在于，不同组织中的血管床对促进通透性试剂的反应可能不同，因此在皮肤中进行的 Miles 检测所得结果可能无法代表肺或脑等其他器官中的实际情况。
动物的年龄和体重可能影响Miles实验中观察到的渗漏现象。为尽量减少这些变量的影响，研究人员应使用同窝出生或体型和年龄相近的小鼠作为对照。在评估特定目的基因的小鼠突变体时，应通过杂合子与杂合子交配策略产生小鼠，并以野生型同窝小鼠作为对照。此外，建议使用快速可逆的气体麻醉剂（如异氟烷），以避免因某些经胃肠外注射给予的麻醉药物所引起的血管收缩24,25。将伊文思蓝染料注射至小鼠尾侧静脉是本实验方案中的关键步骤，会显著影响实验质量和数据结果。因此，研究人员必须具备尾静脉注射的操作能力，并可能需要在开展Miles实验前积累相关经验或进行练习。此外，若研究人员具备相应操作经验，也可采用其他静脉给药途径，例如眶后注射，以递送伊文思蓝。透皮促进溶液的皮内注射可能造成与试剂无关的皮肤损伤。因此，皮内注射体积不应超过20 µl，且应始终在组胺抑制剂存在下进行，并以溶剂对照注射作为归一化参照。
许多研究人员已使用Miles实验来评估VEGF-A信号通路的组分，例如，因为VEGF-A诱导的血管通透性会导致癌症患者出现腹水16，并在多种新生血管性眼病中引起视力损害性水肿7。因此，我们及其他研究者已利用Miles实验比较在遗传上被改造为缺失VEGF-A信号级联中特定组分的小鼠体内由VEGF-A诱导的血管渗漏情况12,13,14,15,20,23。我们最近利用该方法的研究发现，主要的致病性VEGF-A亚型VEGF165通过VEGFR2和NRP1形成的复合物进行信号传导，其中NRP1的胞质结构域促进ABL激酶介导的SRC家族激酶活化，从而引发高通透性反应14。VEGFA还可促进血管生长，因此，若其高通透性活性能够被特异性抑制，则有可能将其用于治疗缺血组织的血流恢复。因此，阐明引导血管内皮细胞对VEGF-A产生高通透性反应的分子机制的研究，可能有助于识别出可被选择性调控的通路，以抑制癌症或缺血性眼病等疾病中由VEGF-A诱导的病理性水肿。Miles实验无疑将继续作为一种有用的方法，支撑这些以及许多其他类型的机能研究，以阐明血管高通透性的分子调节因子和效应分子。

心血管系统的主要功能是促进所有器官中循环系统与组织之间进行气体、营养物质和代谢废物的交换。血管具有器官特异性的基础通透性水平，以允许此类物质交换1。例如，肾脏中的血管通透性很高，而血脑屏障则形成一个致密且极难穿透的界面2,3,4。构成血管内壁的内皮细胞在循环系统与深层组织之间提供物理屏障，并以器官特异性的方式调控血管通透性。然而，某些刺激会导致内皮屏障部分破坏，从而使液体从循环系统渗出至间质的量超过基础水平1。这种高通透性现象可见于多种情况，例如组织创伤部位、炎症反应、肿瘤、脓毒症，以及因新生血管性疾病导致的眼部病变，或因中风和心肌梗死分别引起的脑组织和心肌缺血5,6,7,8。当高通透性长期升高时，会导致水肿，进而引发组织损伤，例如眼部疾病中的视力丧失9。因此，建立血管高通透性反应的模型对于理解增加内皮通透性的机制，以及评估旨在抑制该过程的药物疗效具有重要意义。
Miles 法是一种成熟、常用且相对简单的技术，通过体内测量血管渗漏来间接评估血管高通透性。in vivo。尽管该方法未考虑可能独立于内皮屏障调控而增加血管渗漏的混杂因素（如血压或血流），但通常认为 Miles 法能够可靠地评估物质对通透性的调节作用，并识别促进其活性的信号介质。因此，Miles 法已广泛应用于多项研究，帮助鉴定出多种血管高通透性介质及其作用机制10,11,12,13,14,15，例如最初被鉴定为血管通透性因子 VPF 的血管内皮生长因子 VEGF-A16。
最初由 Miles 和 Miles 开发用于研究豚鼠的血管通透性17，该检测方法随后被改进为使用小鼠。由于小鼠极其适合进行遗传操作，现已成为阐明血管通透性调控分子机制的首选模式生物。简而言之，将伊文思蓝染料经静脉注射至成年小鼠体内，并使其循环30分钟（图1）。随后，在小鼠两侧体侧多点皮内注射通透性诱导剂或对照溶剂，以诱导血管渗漏（图1）。因此，与白蛋白结合的伊文思蓝染料渗出并积聚于真皮层（图1）。在人道处死小鼠后，从真皮层提取伊文思蓝，并以测试物质与溶剂对照所诱导的光密度比值来计算血管渗漏程度（图2）。

<table><tbody><tr><td>马来酸吡拉明盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>用 PBS 重悬</td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>在通风橱中使用</td></tr><tr><td>Microlance 针头 30g x 0.5&quot;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Plastipak 1ml 鲁尔注射器</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>无菌 MicroFine 注射器 0.3 ml - 8 mm - 30G&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>伊文思蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛发剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>软木板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式制冷离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组血管内皮生长因子 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

利用伊文思蓝染料渗出实验（miles实验）评估皮肤中诱导血管高通透性因子的作用

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

在脊椎动物中，血管内皮的主要功能是作为血液与机体各组织之间的屏障，其对血细胞、血浆大分子和水的通透性可根据生理需求进行调节。在某些疾病状态下，会释放出作用于内皮屏障的细胞因子和生长因子，短暂增加血管通透性；然而，若这些因子持续存在，则可能导致慢性血管高通透性，进而引发损伤组织的水肿。Miles 检测是一种体内技术，可通过间接测量血管渗漏来研究血管高通透性。本文提供了在小鼠中执行该实验的详细方案，小鼠是研究哺乳动物生理学与病理学最常用的模式生物。该方法包括静脉注射伊文思蓝染料以标记循环中的白蛋白，随后在小鼠两侧腹股沟对称部位进行多次皮内注射诱导通透性物质及其溶剂对照溶液。随后，伊文思蓝染料逐渐渗入真皮层并积聚，可被提取并定量，用以评估相对于溶剂对照组，通透性诱导剂所引起的渗漏程度。Miles 检测可用于野生型或基因修饰小鼠模型，并可结合药物干预，以研究调控血管通透性的分子机制，并鉴定能够诱导或阻断高通透性的药物或靶点。

我们采用Miles实验评估VEGF-A在野生型C57/Bl6小鼠中相对于对照溶剂（PBS）诱导血管渗漏的能力。此处展示了一项代表性实验，使用经皮内注射刺激的野生型小鼠 20 µL 含有50 ng VEGF-A的PBS溶液或仅含PBS的对照溶液。与注射PBS的皮肤样本相比，注射VEGF-A的皮肤样本中伊文思蓝染料渗漏明显增加 原位 (图1E）以及在甲酰胺中提取染料后（图 2A). 多次实验的定量结果表明，50 ng VEGF-A 引起的伊文思蓝渗漏显著多于单独使用 PBS 的情况（图2B)，与对照溶剂组相比，血管渗漏平均增加了3倍图2C).
<img alt="小鼠麻醉与注射方法示意图；步骤：腹腔注射吡拉明，静脉注射伊文思蓝，皮内注射待测药物" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：Miles实验中血管通透性增加的诱导 小鼠体内迈尔斯试验（Miles assay）操作步骤的示意图（上图）与相应图像（下图）。A) 富马酸吡拉明在（给药前10至30分钟）通过腹腔注射给药，以防止内源性组胺的释放B静脉注射 100 µl 1%伊文思蓝注入小鼠尾静脉。C30分钟后，通过皮内注射造模剂（50 ng VEGF-A；绿色圆圈）或对照溶剂（PBS；白色圆圈）诱导血管渗漏. (D，E) 为观察伊文思蓝蓄积部位，小鼠在皮内注射后20分钟处死，剥离两侧 flank 部皮肤并铺平固定。i.p.：腹腔注射；i.v.：静脉注射；i.d.：皮内注射；比例尺，1 cm。 <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="PBS与VEGF164的平板实验比较，显示伊文思蓝渗漏结果及统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：Miles实验中血管渗漏的定量分析。（A）从 图1 每个皮内注射位点获取的皮肤样本中，用甲酰胺提取伊文思蓝染料，并将提取液加入96孔板，使用分光光度计测定吸光度。（B, C）通过绘制多组实验的吸光度读数结果进行图示表达：（B）显示促通透性试剂（VEGF-A；深绿色圆圈）和对照溶剂（PBS；灰色圆圈）的归一化吸光度值（光密度，OD）；或（C）显示试剂相对于溶剂的OD倍数变化（误差线：标准误SEM）。图（A）中PBS和VEGF-A样本的三复孔吸光度读数经平均后，分别以白色和绿色圆圈表示于图（B, C）中。<a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种通过将通透性促进剂注射到小鼠皮肤真皮层来检测血管渗漏的实验方案。该技术可用于评估分子促进或抑制血管渗漏的能力，或用于研究调控血管通透性的分子机制。

利用伊文思蓝染料渗出实验（Miles实验）评估皮肤中诱导血管高通透性因子的作用

脊椎动物体内血管内皮的主要功能是作为血液与机体各组织之间的屏障，从而……

本实验的总体目标是测量小鼠真皮中由促通透性物质皮内注射所诱导的血管渗漏。该方法有助于回答有关体内血管通透性调控的关键问题，例如哪些分子能够刺激或抑制血管渗漏，以及参与其中的信号通路是什么。该方法的主要优势在于操作快速、相对简便，且主要使用常规实验室试剂和材料。该技术的应用前景涉及病理性水肿相关疾病的治疗。特别是，研究人员可利用此检测方法快速、简便地识别新的分子靶点，并测试相关药物抑制血管通透性的能力。分别用0.9%生理盐水溶液配制组胺抑制剂马来酸吡拉明和伊文思蓝染料的溶液。然后在超净工作台内操作，通过0.22微米滤膜过滤溶液以完成灭菌。将两种溶液分别装入带有30号针头的1毫升注射器中。接下来，固定小鼠颈部皮肤。 然后倾斜小鼠，使其头部朝向地面，腹部向上。将小鼠放置到位后，通过腹腔注射给予每克体重10微升的马来酸吡拉明溶液。接着，为促进血管扩张，将小鼠置于37摄氏度的加热室中10分钟。然后将小鼠移至小鼠固定器中。接着用70%乙醇擦拭尾部，以进一步促进血管扩张。通过尾静脉静脉注射100 µL伊文思蓝染料溶液。为防止出血，应迅速用手指和拇指夹住小鼠尾巴，并在注射部位施加压力。将伊文思蓝染料经尾静脉注射到小鼠体内是该实验流程中一项困难且关键的步骤。因此，在开展后续操作之前，研究人员必须熟练掌握此项注射技术。建立操作熟练度需要事先练习。使用无菌的磷酸盐缓冲液稀释VEGF试剂，使给药的最终体积为20微升。然后将VEGF通透性诱导试剂和溶剂对照分别装入两支300微升、配有31号针头的注射器中。保持针头与皮肤呈15度角，将20 µL VEGF皮内注射至小鼠侧腹部。观察皮肤内形成隆起的水疱，以确认注射成功。在另外两个相距至少1厘米的部位进行额外的皮内注射。然后将小鼠翻转以暴露另一侧 flank，使用溶剂溶液重复进行三次注射。在纸上记录每个注射位点以及注射操作结束的时间。随后将小鼠转移回饲养笼中。持续监测小鼠，直至其恢复意识并在笼内活动。在呼叫小鼠前，让VEGF溶液作用20分钟。在此阶段，按照相同的操作步骤，依次向所有小鼠注射VEGFA和对照溶剂。20分钟后，将每只安乐死的小鼠仰卧位放置，并用大头针将其四肢固定在包裹了洁净纸巾的软木板上。接着，使用钝头剪刀从死鼠的下腹部至胸部做一条3到4厘米长的纵向切口。然后用镊子和手术刀从两侧腹壁分离皮肤。使用手术刀去除渗漏部位周围存在的任何脂肪组织。然后使用镊子和手术刀切除渗出伊文思蓝染料的皮肤区域。所切除的皮肤区域必须大小相近。将皮肤样本转移至1.5毫升离心管中，并做好相应标记。在通风橱中将管盖打开，置于加热块中过夜干燥。干燥完成后，在样本中加入250 µL去离子甲酰胺。盖上管盖，并将其置于加热块中过夜，以提取伊文思蓝染料。将样品在台式离心机中以10,000 g或更高转速离心40分钟。离心结束后，在通风橱内操作，将每个离心样品中含有染料的上清液100微升转移至96孔板的孔中。使用分光光度计读取伊文思蓝的吸光度。为了研究由VEGF诱导的血管渗漏，将50纳克VEGFA溶于磷酸盐缓冲液中，或仅使用磷酸盐缓冲液作为对照，注射到小鼠体内。图像显示，与对照组相比，注射VEGFA的皮肤样本中渗漏的伊文思蓝染料积累量增加。此96孔板图像显示了从皮肤样本中用甲酰胺提取的伊文思蓝染料。该图展示了配对的VEGFA和仅载体对照样本的归一化吸光度值。结果显示，与仅使用载体相比，注射50纳克VEGFA显著增加了伊文思蓝染料的渗漏。该图是在定量分析VEGFA样本与对照溶剂样本的光密度变化倍数后获得的。图中显示，与仅给予对照溶剂相比，给予VEGFA后血管渗漏平均增加了三倍。若操作熟练，该技术的主要步骤在正确执行的情况下可在两小时内完成。在执行该操作过程中，重要的是将试剂诱导的血管渗漏与载体诱导的血管渗漏进行归一化处理，以消除非特异性血管渗漏及小鼠个体间的差异。该操作可与其他方法（如药物给药）相结合，以回答诸如某种蛋白是否可作为靶点用于抑制血管通透性等问题。该技术建立后，为血管生物学领域的研究人员探索基因修饰小鼠中血管高通透性的分子机制铺平了道路，并有助于鉴定介导血管渗漏所必需的关键信号组分。观看本视频后，您应能够充分理解如何在小鼠真皮中诱导并测量血管渗漏。

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科研

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Biology

生物学

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