Name: 非规范氨基酸选择性压力合成抗菌肽的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 了解如何利用大肠杆菌将非规范氨基酸整合到抗菌肽中，通过琼脂扩散实验和荧光显微镜评估其抗菌活性。该方法支持平行测试多种氨基酸变体，为开发新型抗菌药物提供高效平台。

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J.H.N.、T.B. 和 M.B. 感谢欧盟第七框架计划（SYNPEPTIDE 项目）提供的经费支持。F.-J.S. 和 T.F. 感谢德国联邦教育与研究部（BMBF 计划“HSP 2020”，TU-WIMIplus 项目 SynTUBio）以及德国研究基金会（催化领域卓越集群“Unifying concepts in Catalysis”）提供的经费支持。

1. 表达载体的克隆及营养缺陷型生产菌株的转化
本文中，乳酸乳球菌（L. lactis）的乳酸链球菌素生物合成基因nisABC被克隆并转入基于T7的质粒表达载体中。nisABC的完整DNA序列可在GenBank登录号X6830734中找到。前体肽基因（nisA）被插入至赋予氨苄青霉素抗性的pET-3a载体中。脱水酶基因（nisB）和环化酶基因（nisC）则如先前报道35被插入至赋予卡那霉素抗性的pRSFDuet-1载体中。
注意：对于 nisA，前导序列最后四个氨基酸（ASPR）的密码子被突变为编码VSLR36，以使核心肽中的脯氨酸残基具有唯一性，并确保NisP能够正确加工前体肽。在N端添加了由连接肽残基侧翼分隔的六组氨酸标签，用于纯化目的（见图1）。
<img alt="乳酸链球菌素生物合成示意图；NisB 和 NisC 介导的肽修饰；活性检测实验设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1NisA 生物合成及其翻译后修饰的示意图 E. coli 以及由蛋白酶介导的 leader 序列切割 L. lactis 在后续的活性检测中用作指示菌株。 第一步中，由编码的无活性线性前体乳链肽（包含一个引导肽区和一个核心肽区，其中核心肽区第9位含有一个独特的脯氨酸（粉色）） nisA 由核糖体合成。随后，前体乳酸链球菌肽在NisB的催化下，通过丝氨酸和苏氨酸残基的脱水作用，发生翻译后修饰，生成脱氢丙氨酸（Dha）和脱氢丁氨酸（Dhb）。环化酶NisC则形成硫醚桥 通过 半胱氨酸巯基与Dha或Dhb的迈克尔加成反应。失活的修饰前体nisin从 E. coli 并测试其抗菌活性。在此过程中，它被转运至革兰氏阳性菌的细胞内 L. lactis 指示菌株。前导肽由蛋白酶 NisP 切割（如箭头所示），从而释放出完全活性的乳酸链球菌素。它也可被去除 体外 通过胰蛋白酶处理（*） <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>采用标准热激法37或电穿孔法38将质粒pET-3a nisA(VSLR)和pRSFDuet-1 nisBC转化至上述的脯氨酸营养缺陷型E. coli菌株中。</li>
	<li>取25–100 µL转化后的细胞悬液，滴加至含有氨苄青霉素、卡那霉素和1% (w/v)葡萄糖的琼脂平板上。使用涂布棒或玻璃珠将溶液均匀涂布于平板表面。</li>
	<li>在37 °C条件下培养过夜。</li>
	<li>次日下午，挑取单菌落接种于装有10 mL LB培养基（含氨苄青霉素、卡那霉素和1% (w/v)葡萄糖）的50 mL三角瓶中。</li>
	<li>在37 °C、200 rpm条件下振荡培养过夜（12–16 h）。</li>
	<li>取250 µL无菌80%甘油与550 µL菌液，于2 mL离心管中充分混匀，于80 °C保存作为冻存菌种。</li>
</ol>
2. 新型最低培养基（NMM）的制备
注意：本方案使用 NMM20 作为一种化学成分明确的液体细菌培养基。同时，建议严格遵循配制顺序，否则可能发生沉淀。对于材料表中所列氨基酸形式不同的情况（例如， 盐酸盐），检查其溶解度。NMM19 培养基包含 19 种氨基酸，除待替换的天然氨基酸（此处为脯氨酸）由非天然氨基酸类似物取代外。最终成分浓度见表 1。根据所用生产菌株的不同，生物素和硫胺素可能为可选添加成分。
<ol>
	<li>氨基酸混合物的制备
	<ol>
		<li>将0.5 g Phe、Trp和Tyr溶解于100 mL ddH₂O中2加入几滴浓盐酸至溶解。</li>
		<li>称取其余16种氨基酸各0.5 g，分别与22 mL 1 M KH混合2PO4 和 48 mL 的 1 M K2HPO4. 加入ddH₂O2加水至约800 mL，搅拌至溶液澄清。</li>
		<li>加入溶解的 Phe、Trp 和 Tyr，并用 ddH₂O 定容至 1 L2O.</li>
		<li>使用瓶顶过滤器装置通过真空过滤对氨基酸混合物进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NMM19 的储备溶液
	<ol>
		<li>首先，配制以下组分的1 M储存液：(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、NaH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O和葡萄糖4)2SO4，KH2PO4，K2HPO4，MgSO₄4 以及5 M的NaCl储存液。通过高压灭菌进行灭菌。</li>
		<li>配制50 mL D-葡萄糖（1 M）和CaCl₂（1 M）储备液2 (1 g/L)，FeCl2 （1 g/L）、硫胺素（10 g/L）、生物素（10 g/L）和微量元素（CuSO₄）4，ZnCl2，MnCl2，（NH4)2MoO4；1 mg/L）。使用注射器滤器过滤除菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NMM19 制备
	<ol>
		<li>将所有储备液混合，得到终浓度为 7.5 mM 的 (NH₄)₂SO₄4)2SO4，1.7 mM NaCl，22 mM KH2PO4，50 mM K2HPO4，1 mM MgSO₄4 20 mM D-葡萄糖，50 mg/L 氨基酸混合物 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L 硫胺素，10 mg/L 生物素和 0.01 µg/mL 微量元素</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过 SPI 掺入脯氨酸类似物表达重组乳酸链球菌素
在此部分，前肽（此处： nisA）和 PTM 基因（此处： nisBC进行培养。首先，在含有所有天然氨基酸（cAAs）的条件下培养细胞，因为使用的是LB复合培养基。添加葡萄糖以抑制目标基因的本底表达，否则由于启动子的渗漏性，可能导致野生型肽（此处为：nisin）的产生。只有在目标天然氨基酸（此处为：脯氨酸）耗尽后，才加入非天然氨基酸（ncAA），并在化学成分明确的培养基中诱导目标基因的表达。液体培养物的孵育应在适合的容器中进行，并保证通气。例如， 500 mL置于2 L锥形瓶中，200 rpm振荡培养。
<ol>
	<li>使用无菌移液器吸头，从冻存菌种或新鲜菌落（参见步骤1）开始培养新的过夜培养物。使用含有氨苄青霉素、卡那霉素和1%（w/v）葡萄糖的25 mL LB培养基，在37 °C、200 rpm条件下培养过夜（12-16 h）。</li>
	<li>将10 mL过夜培养物（1% v/v）接种至1 L无菌新鲜培养基中，在37 °C、200 rpm条件下培养至OD600 = 0.5。</li>
	<li>在4 °C条件下，以4,500 x g离心15分钟。</li>
	<li>倒去上清液，用含有抗生素和1%（w/v）葡萄糖的20 mL NMM19（按步骤2.3配制）重悬沉淀，在4 °C条件下，以4,500 x g离心10分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于500 mL相同培养基中，在30 °C、200 rpm条件下孵育1小时。 
	注意：此步骤中进行cAA（此处为脯氨酸）的耗竭。</li>
	<li>将培养物均分为若干份（每种ncAA对应一份），每份加入1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）进行诱导，并添加1 mM脯氨酸类似物（4S/R-氟代脯氨酸、4S/R-羟基脯氨酸或4S/R-甲基脯氨酸）。 
	注意：作为对照，可向其中一份培养物中添加1 mM脯氨酸，以产生野生型肽。</li>
	<li>在28 °C、200 rpm条件下培养过夜（12-16 h）。</li>
	<li>将细胞培养物分装至50 mL离心管中，在4 °C条件下，以5,000 x g离心20分钟。倒去上清液，将沉淀保存于-80 °C，直至纯化。</li>
</ol>
4. 带有组氨酸标签的乳酸链球菌素类似物的分离与纯化
在变性条件下，使用盐酸胍（GuHCl）39（一种强效变性剂）对多肽进行纯化。
注意：氯化胍若吞食或吸入有害，并会引起皮肤和严重眼部刺激。请佩戴护目镜和手套。
<ol>
	<li>配制 250 mL 结合缓冲液（5 M GuHCl、300 mM NaCl、25 mM Tris，pH 7.4）、洗涤缓冲液（300 mM NaCl、25 mM Tris、25 mM 咪唑，pH 7.4）和洗脱缓冲液（300 mM NaCl、25 mM Tris、250 mM 咪唑，pH 7.4）。配制时，将各固体试剂加入 250 mL 瓶中，加入 ddH2O 至 200 mL，充分混匀，并用 1 M NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.4，再用 ddH2O 定容至 250 mL。使用瓶顶过滤器过滤所有缓冲液。</li>
	<li>细胞裂解 
	此处使用超声波破碎仪（最大高频输出功率为 200 W）；请注意，不同仪器在细胞破碎时所需的功率设置可能有所不同。所有操作均在冰上进行。也可选用化学裂解法、液体均质器或法国压滤器替代。
	<ol>
		<li>向每个离心管（步骤 3.8 所得）中加入 12 mL 结合缓冲液，通过涡旋振荡重悬细胞。</li>
		<li>将超声波探头浸入细胞悬液中，设置超声仪振幅为 40%，脉冲模式为开 1 秒、关 5 秒，持续处理 15 分钟。 
		注意：样品之间需清洁超声探头，以防交叉污染。使用 70% 乙醇擦拭探头。</li>
		<li>将裂解后的细胞悬液在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心 40 分钟，沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的反应管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲和层析 
	对于固定化金属离子亲和层析（IMAC）40，可使用蠕动泵或 FPLC 系统配合 1 mL 层析柱（此处填充 Ni-NTA 树脂）。缓冲液的配制见步骤 4.1。 
	注意：由于所表达的重组肽带有 N 端 His 标签前导序列，可通过步骤 6 中的前导肽酶 NisP 切除该标签，从而释放成熟乳链菌肽，因此适用于 IMAC 纯化。纯化过程可在室温或 4 °C 下进行。若所用 IMAC 层析柱允许，流速应设为 1 mL/分钟。
	<ol>
		<li>首先用 5 柱体积（cv）的 ddH2O 洗涤层析柱，以去除保存液。</li>
		<li>用 10 cv 的结合缓冲液进行平衡。</li>
		<li>将细胞裂解液（步骤 4.2 所得）通过注射器滤器去除颗粒后，上样至层析柱。</li>
		<li>用 15 cv 的洗涤缓冲液洗涤层析柱，以去除非特异性结合和未结合的杂质。</li>
		<li>用 10 cv 的洗脱缓冲液进行洗脱，每 1 mL 收集一管至 1.5 mL 离心管中。短期储存（不超过 3 天）可置于 4 °C，长期储存则置于 -20 °C。</li>
		<li>储存前，先用 10 cv 的 ddH2O 洗涤层析柱，再用 5 cv 的 20% 乙醇洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 乳酸链球菌素类似物的液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱分析
注意：有关液相色谱-电喷雾电离飞行时间质谱联用（LC-ESI-TOF-MS）的示例仪器，请参见材料表。
<ol>
	<li>将15-20 µL肽溶液（在步骤4.3中制备）在C5柱上进行HPLC分离，流动相为水（A）和乙腈（B），均添加0.1%甲酸，梯度洗脱条件为20分钟内B相从5%升至80%。用于质谱（MS）分析时，从第5分钟开始收集洗脱液。 
	注意：根据肽的组成及其对HPLC柱的亲和性，可能需要优化样品体积和分离条件。</li>
	<li>使用适当的软件对测得的质谱图进行去卷积处理，并计算不同肽的电荷态41。将观测到的肽种类质量与经cAA → ncAA取代修饰后的野生型肽计算质量进行比较。需注意，线性前体肽在翻译后会经历八次脱水（-8 H2O）和五次环化修饰（见图1）。 
	注意：若使用含钠缓冲液，正离子模式下的质谱分析可能出现钠加合物，表现为额外的峰（每个钠加合物使去卷积后的质量增加22.99 Da）。为去除这些加合物，可进行HPLC纯化42或充分透析43。</li>
</ol>
6. 抗微生物活性测试
<ol>
	<li>在无菌条件下制备 GM17-琼脂平板
	<ol>
		<li>在 30 °C 下，使用含 1% (w/v) 葡萄糖（即 GM17）和 5 µg/mL 氯霉素的 M17 肉汤培养基，制备携带质粒 pNG nisPT44 的指示菌株 L. lactis NZ9000 的过夜培养物45。</li>
		<li>测定 OD600，将新鲜培养基接种至 OD600 = 0.1，并培养至 OD600 = 0.4–0.6。随后将培养瓶置于冰上。 
		注意：每次 OD600 测定均会消耗一定体积的培养液。请注意，每块检测用琼脂平板需要 1 mL 细菌培养物。如有需要，请相应扩大液体培养体积。</li>
		<li>配制 1.5% 琼脂：在玻璃培养瓶中称取 4.5 g 琼脂，加入 300 mL ddH2O，混匀后高压灭菌。</li>
		<li>在 300 mL ddH2O 中配制 2× M17 肉汤（两倍浓缩），并进行高压灭菌。</li>
		<li>将含 10 µg/mL 氯霉素和 2% 葡萄糖的 25 mL 2× M17 肉汤与 1 mL L. lactis 预培养物（4% v/v）混合。</li>
		<li>加入 25 mL 熔融状态的 1.5% 琼脂（新近高压灭菌或微波加热融化）。 
		注意：在此之前，需将培养瓶冷却至可触温度（约 50 °C），因为 L. lactis 是一种对高温敏感的中温微生物。</li>
		<li>将混合液倒入大型培养皿中，晾干 10–15 分钟。</li>
		<li>用火焰灭菌玻璃巴斯德吸管的末端，待其冷却后，使用较宽的一端在凝固的 GM17-琼脂平板上打孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>取 1 mL 标记好的 E. coli 表达培养物（在步骤 3.7 中制备）置于 1.5 mL 离心管中，于 7,000 × g 离心 3 分钟。吸除上清培养基，将菌体沉淀重悬于 500 µL Na-P 缓冲液（50 mM 磷酸钠缓冲液，pH 7.4，由 0.5 M 磷酸二氢钠和 0.5 M 磷酸氢二钠配制而成）中。</li>
		<li>在冰上进行超声处理（参见步骤 4.2.2）。将超声探头浸入细胞悬液中，设置超声仪振幅为 30%，脉冲模式为开启 1 秒、关闭 5 秒，持续 3 分钟。</li>
		<li>将细胞裂解液于 13,000 × g 离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的预冷反应管中。</li>
		<li>用 Na-P 缓冲液将各组细胞提取物上清液稀释并归一化至总体积 1 mL，且 OD600 = 0.6（根据收获时的细胞密度进行调整）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活性检测
	<ol>
		<li>将每种归一化后的样品各取 40 µL 加入指示琼脂平板的孔中（图 3）。以 400 µg/mL 氯霉素作为抗菌阳性对照，以洗脱缓冲液作为空白阴性对照。待所有样品完全扩散进入琼脂后，于 30 °C 过夜培养。</li>
		<li>使用平板扫描仪或数码相机拍摄琼脂平板图像。可通过手工或使用 ImageJ46 软件测量抑菌圈直径。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 荧光显微镜
为了观察抗菌肽（AMPs）对细菌细胞的影响，可使用光学显微镜和荧光显微镜。需要注意的是，尼生素（nisin）的作用机制依赖于破坏细菌膜的稳定性并形成膜孔6。本实验中使用尼罗红对细菌细胞膜进行染色，细胞裂解后膜结构会变得弥散并发生聚集。
注意：有关示例仪器，请参见材料表。添加的AMP溶液量可根据肽浓度和生物活性进行调整。
<ol>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>用二甲基亚砜（DMSO）配制10 mM Nile red 储存液。</li>
		<li>将L. lactis指示菌株培养至OD600 = 1.0，操作同步骤6.1.1–6.1.2。</li>
		<li>取1 mL菌液，在4 °C、5,000 × g条件下离心3分钟。</li>
		<li>弃上清，用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）47重悬菌体。</li>
		<li>再次离心并重悬。</li>
		<li>加入1 µL Nile red储存液，轻轻混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微图像采集
	<ol>
		<li>在激发波长为520 nm的条件下，将30 µL细胞悬液加至盖玻片上。</li>
		<li>设定采集时间为0.2 s，动力学序列频率为0.1 Hz，序列长度为200张图像。</li>
		<li>加入0.3–1.5 µL细胞裂解液或IMAC样品（分别来自步骤6.2.4或4.3.5）。对于IMAC样品，可用洗脱缓冲液作为阴性对照。</li>
		<li>监测并记录波长≥560 nm的荧光发射信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>显微图像序列以视频文件（.avi）形式存储。单张图像使用ImageJ46进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

通过使用SPI插入脯氨酸类似物，可以对目标乳酸链球菌素（nisin）结构进行显著修饰，从而创造出具有独特序列组合和化学特性的新型肽类变体。这种方法能够突破经典基因技术的基本限制，即只能使用20种常见氨基酸（cAAs）的侧链化学结构。体内化学多样化修饰nisin（如上所述）展示了一种通用策略，可用于补充天然翻译后修饰（PTMs），并显著拓展核糖体合成及翻译后修饰肽类（RiPPs）的化学空间。我们认为，扩展天然氨基酸的种类尤其为抗菌肽（AMPs）的发展带来了巨大前景。在蛋白质中，通过20种cAAs在三维结构中的精确排列可实现极为多样的功能。然而，由于AMPs通常仅由7-100个氨基酸残基组成3，仅依赖cAAs来实现类似结构特征的方法将受到限制。因此，天然形式的RiPP类AMPs通常经历广泛翻译后修饰也就不足为奇了4。同理，非常见氨基酸（ncAAs）作为替代性构建单元，在改善AMPs的药效学和药代动力学参数方面也具有广阔前景（参见Baumann et al. 201735 及其中引用的文献）。
本研究所采用的SPI方法具有实验装置相对简单、操作直接且可重复性高的优点。由于能够实现全局替换，因此也可将多个非天然氨基酸（ncAA）引入目标肽段中。然而，该方法可能不适用于目标基因产物中频繁出现的氨基酸的替换。原则上，可通过定点突变改变非预期位点，但这些额外的改变可能会影响抗菌肽（AMP）的多种性质，包括其结构和生物活性。一旦获得用于生产的营养缺陷型菌株，便可测试多种非天然氨基酸，而无需在基因层面进行大量修改。此外，该方法不仅限于使用营养缺陷型的E. coli菌株，也可在天然生产宿主中进行。例如，Zhou et al. 证明，在天然色氨酸（Trp）营养缺陷型的L. lactis中，SPI方法同样可用于新型核糖体合成后修饰肽（RiPPs）的生产：通过使用定义明确的培养基，成功将三种色氨酸类似物引入乳酸链球菌素（nisin）的四个位点50。
由于SPI方法可实现目标cAA被ncAA的全局替换，因此通常适用于多种目标肽和蛋白质。目前已提供多种营养缺陷型E. coli菌株（见步骤1），可分别用于测试多种cAA被ncAA替换的效果。其中，使用metA缺陷型菌株（例如，B834(DE3)）引入甲硫氨酸类似物最为常见。结构类似甲硫氨酸的类似物包括叠氮高丙氨酸（Aha）和高丙炔基甘氨酸（Hpg），这些商业化可得的ncAA能够被高效地掺入。这两种类似物均可引入生物正交反应基团，分别允许带有相应炔基或叠氮基团的分子进行连接。例如，可通过一价铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）51将荧光染料或聚乙二醇（PEG）分子偶联上去。
尽管两种重组非天然氨基酸（ncAA）整合方法（SPI 和 SCS）通常能够获得足够的目标产物量，但其产量往往低于相应肽和蛋白质的野生型表达水平。由于纯度通常与生产效率相关，因此可能需要额外的纯化步骤，尤其是对于丰度较低的产物。在本研究涉及的重组乳酸链球菌肽（nisin）生产中，带有 His 标签的前导序列可通过从细胞裂解液中选择性富集，显著简化 RiPP 的纯化过程。本方案所展示的纯化步骤可提高 nisin 的纯度和浓度，但通常仍不足以获得可用于准确测定产率和比活性的抗菌肽（AMP）纯度。除固定化金属离子亲和色谱（IMAC）外，常用的 AMP 纯化方法还包括高效液相色谱（HPLC）、离子交换色谱（IEC）和沉淀法。例如 使用丙酮或三氯乙酸（TCA）或其组合——从而形成一个多步骤纯化方案52需要注意的是，它们通常带有多正电荷的特性有助于离子交换层析（IEC）纯化。冻干法常用于储存纯化的抗菌肽（AMPs）。
理想情况下，用于整合到抗菌肽（AMPs）中的非天然氨基酸（ncAAs）应价格合理且可商业获得，或可通过简单且可重复的化学合成方法轻松制备。SPI方法的另一个同等重要的先决条件是，该ncAA能够被内源性或共表达的氨酰-tRNA合成酶（aaRS）识别、活化，并装载到对应的tRNA上。这一点可通过实验验证 体外 通过氨基酸活化或tRNA氨酰化实验53作为一种简便的替代方法，可同时在添加和不添加非天然氨基酸（ncAA）的条件下，对绿色荧光蛋白（GFP）等模型蛋白进行SPI测试表达。此外，生长培养基中的溶解性、细胞通透性以及化学稳定性也是重要的影响因素。
在此示例中，使用一种革兰氏阳性指示菌株筛选抗菌活性。该菌株表达前导肽酶NisP，可催化乳酸链球菌素成熟过程的最后一步。前导序列（为纯化目的而带有His标签）的切除也可由此完成 体外 通过纯化的NisP处理50 或胰蛋白酶54除了本研究范围之外，还可采用类似方法测试抗菌肽对病原生物和多重耐药菌株的抑菌或杀菌作用。具有临床相关性的目标菌种包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、多重耐药菌（MDR） 结核分枝杆菌，VRE， 鲍曼不动杆菌, 肺炎链球菌, 铜绿假单胞菌 和 肺炎克雷伯菌除了本文所述的琼脂平板扩散法外，还可使用接种了目标细菌并添加了抗菌肽（AMP）的适宜液体培养基进行生长抑制实验。通过肉汤稀释法，可利用纯化肽段测定其最小抑菌浓度（MIC）。55此处介绍的活性测定方法也可用于评估含抗菌肽（AMP）溶液相对于参考化合物（例如市售的乳酸链球菌素，nisin）的生物活性和效价。
RiPPs 的重组生产通常是可行的39，通常包括 PTM 基因的共表达。一旦将生产菌株转入含有合适非天然氨基酸（ncAA）的化学成分明确或合成的最低培养基中，就会发生对应天然氨基酸（cAA）的残基特异性替换。因此，只要目标 RiPP 的重组生产可行，并且能够找到使 ncAA 掺入和翻译后修饰（PTM）产生足够目标产物的条件，该方法也可用于其他 RiPPs 的生产。需要注意的是，在无细胞蛋白合成（SPI）过程中，除了宿主细胞的蛋白质组外，肽类 PTM 机器也可能被 ncAA 修饰。因此，目标蛋白表达的诱导时机以及后续孵育时间可能需要优化。由于 ncAA 掺入 PTM 酶可能影响其稳定性和活性，理论上可能影响加工后 RiPP 的产量。PTM 酶功能是否充足可通过质谱（MS）和生物活性检测中加工后前体肽的形成来判断。如上所述，可采用不同的诱导型启动子，先在无 ncAA 条件下表达 PTM 基因，再在添加 ncAA 后诱导前体肽基因的表达。通常情况下，在加入 ncAA 之前必须抑制含 cAA 的目标肽的生产，因此需要对前体基因进行严密的抑制。在本方案中，通过向培养基中添加葡萄糖实现代谢抑制。特别是由于前体肽加工所需的 PTM 酶通常来源于遗传距离较远的宿主，若尚未建立有效的重组表达系统，则其表达温度和对应基因的密码子使用可能需要优化。原则上，前体肽中 ncAA 的存在可能干扰 PTM 酶的识别与加工过程，例如乳酸链球菌素（nisin）中的 NisBC 和 NisP。因此，在将 ncAA 掺入抗菌肽（AMPs）时，建议首先进行小规模表达实验，以确定合适的表达条件并验证 AMP 活性检测的可靠性。

20世纪抗生素的发现以及针对病原微生物开发新型抗菌化合物的同步进展，使得细菌感染的靶向治疗成为可能。然而，由于耐甲氧西林Staphylococcus aureus（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、多重耐药（MDR）Salmonella typhimurium噬菌体10型（DT10）以及Klebsiella pneumoniae等多重耐药病原体的出现，迫切需要开发新的抗菌剂1。抗菌肽（AMPs）是一类多功能且通常具有高度特异性的化合物，因其理化性质、结构灵活性、分子大小、疏水性及作用机制，成为新药研发的有力候选者2。AMPs是小分子肽，通常由7至100个氨基酸组成。它们常具有富含带正电荷精氨酸和赖氨酸残基的阳离子结构，可与带相反电荷的靶向微生物细胞膜相互作用3。AMPs中的一个特殊亚类是核糖体合成并在翻译后修饰的肽类（RiPPs）4，这类肽由真菌界和细菌域的多种生物产生。其中最著名且广泛应用的RiPP之一是乳酸菌素（nisin），由乳酸菌Lactococcus lactis（L. lactis）天然产生。由于其抗菌特性以及靶向菌株尚未产生耐药性，nisin已在食品工业中作为生物防腐剂使用超过50年5。研究表明，nisin可破坏细菌细胞膜并形成孔道，从而对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出抗菌活性6。通过与脂质II结合，nisin还能抑制细菌细胞壁的合成7。Nisin由nisA基因编码为一条线性前体肽，包含前导肽区和核心肽区（图1）。在核糖体合成后，前体肽prenisin首先由脱水酶NisB进行修饰，其中前体肽核心区域的丝氨酸和苏氨酸残基被脱水生成脱氢丙氨酸（Dha）和脱氢丁氨酸（Dhb）8。随后，在环化酶NisC催化的酶促迈克尔加成反应中，这些脱水残基与半胱氨酸偶联形成羊毛硫氨酸环（因此将含羊毛硫氨酸环的抗生素称为&#34;lantibiotic&#34;）。这种翻译后修饰（PTM）由环化酶NisC催化完成。在L. lactis中，修饰后的prenisin通过转运蛋白NisT被运出细胞，再由蛋白酶NisP切除前导肽，从而释放出成熟且具有活性的nisin形式9。负责切割前导肽的NisP具有高度底物特异性，因为它只能高效地加工已修饰的nisin10。
通常，活性 RiPPs 由翻译后修饰酶（例如 NisBC）作用产生，这些酶可显著拓展短肽的化学空间，例如通过乙酰化、糖基化、甲基化或磷酸化等方式。通过直接引入非天然氨基酸（ncAAs），这种复杂性可进一步扩展。尽管抗菌肽（AMPs）的化学合成在许多情况下是可行的，但由于其结构复杂，大规模生产面临挑战。例如，乳链菌肽 S（lactosin S）的全化学合成需经过 71 步反应，最终产率为 10%；而尼生素（nisin）的化学合成粗产物收率仅为 0.003%11,12。因此，生物合成提供了一种可行的替代方案，因其能够生成正确的立体中心并实现较高的产物浓度。
迄今为止，已有超过150种非天然氨基酸（ncAAs）， 例如， 含有氟或叠氮基团的功能基团已被引入重组蛋白中，且已有若干例关于非天然氨基酸修饰抗菌肽（AMPs）的报道13,14,15,16通过引入非天然氨基酸（ncAAs），相较于传统的诱变方法，可产生新的理化特性。现有肽类的多样性得以提升，有望开发出新型抗生素。
将非天然氨基酸（ncAA）掺入重组肽的一种方法是基于营养缺陷型细菌菌株的选择性压力掺入法（SPI）17。这些菌株无法合成与ncAA对应的天然常见氨基酸（cAA）。该方法利用了多种天然氨酰-tRNA合成酶（aaRSs）普遍存在的底物特异性较宽的特性18。除了其天然的cAA底物外，这些酶通常还能识别并活化目标ncAA，并将其装载到相应的tRNA上。这导致ncAA以残基特异性的方式被核糖体掺入目标基因产物中（即 cAA → ncAA 取代）。当然，这种方法仅在目标ncAA在结构和化学性质上与天然氨基酸相似，并且能够被细胞生理环境、翻译机制以及目标肽或蛋白序列所耐受的情况下才可行。在特定的实验设置中，将营养缺陷型宿主细胞培养于添加了限量天然氨基酸（待被取代者）的限定培养基中。通过细胞生长或更换为不含cAA的培养基，导致细胞内cAA的耗竭。随后，加入ncAA并诱导目标基因的表达。在此目标基因表达阶段，ncAA不可避免地也会被掺入宿主细胞的许多其他蛋白质中。然而，SPI体系的毒性保持在较低水平，因为大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）宿主菌株被转化携带了一个质粒，该质粒含有受强启动子控制的目标基因（通常采用高效竞争性的T7启动子/RNA聚合酶系统）19。诱导表达后（通常在cAA耗尽时），宿主细胞停止生长，其胞内酶系统主要被用于表达质粒上的目标基因。可通过定点突变技术确定目标基因中ncAA特异性插入的位点20。
作为一种用于非天然氨基酸（ncAAs）整合的模型肽，选择了五环抗菌肽尼生素A（nisin A）。该肽由34个氨基酸组成，其核心肽序列中仅含有一个脯氨酸残基（图1与枯草芽孢杆菌蛋白酶、ericin A 和 S、表皮素以及乳酸链球菌素 Z 和乳酸链球菌素 Q 相似，保守的脯氨酸似乎对活性至关重要9,21cAA 脯氨酸在肽基-脯氨酸酰胺键旋转及二级结构稳定中起着尤为重要的作用。其侧链环的构象（外式/内式褶皱）可对酰胺键产生热力学稳定效应。对脯氨酸褶皱构象进行靶向化学修饰（如羟基化、氟化、甲基化）常会显著影响多种生物结构的折叠稳定性、骨架刚性及功能22因此，可以合理预期Pro→脯氨酸类似物的取代将赋予乳链菌肽的B环（即第二个环）以新颖且不寻常的特性。
此处为一种脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株用于重组乳酸链球菌肽的生产。这需要表达前体肽基因 nisA 以及修饰酶基因 nisBC该基因编码的肽产物带有N端His标签前导序列，用于纯化 通过 亲和层析。用于活性测定， L. lactis 表达并分泌NisPT用于激活&#160;重组乳酸链球菌素变体来自 E. coli 细胞裂解物或纯化的肽样品（图1）。NisP 切割前导序列后释放出成熟的抗菌肽。在该琼脂扩散法中，抗菌肽样品扩散进入固体培养基，可抑制革兰氏阳性微生物的生长。经培养后，可通过观察生长抑制圈直观判断。此外 L. lactis 作为指示剂，修饰后的乳酸链球菌素变体对以下对象表现出抗菌活性 粪肠球菌, Bacillus cereus, 金黄色葡萄球菌，&#160;和 Lactobacillus johnsonii21,23.
在RiPPs中引入非天然氨基酸（ncAA）的一种替代且实验上不同的方法是终止密码子抑制（stop codon suppression, SCS）24。该方法需要一对正交的tRNA/氨酰-tRNA合成酶（aaRS），以对应特定的ncAA。理想情况下，这三个组分均具有生物正交性，即它们不与内源性的tRNA和aaRS发生相互作用。可通过改造酶的活性位点并筛选突变合成酶的基因文库，获得针对特定ncAA的aaRS25。此外，引入ncAA需要一个被重新分配且不编码天然氨基酸（cAA）的密码子。通常使用琥珀终止密码子24,26。
最近，已建立用于将含α-氯乙酰胺且兼容点击化学的非天然氨基酸（ncAAs）通过残基特异性插入法（SPI）引入NisA27。例如，Nε-烯丙氧羰基赖氨酸（Nε-alloc-lysine）已通过位点特异性（SCS）和残基特异性（SPI）两种方法被引入锁链肽captistruin，并随后在体外通过钌催化的复分解反应进行修饰28。与SPI相比，SCS方法更为复杂，因其需要共表达正交的tRNA/氨酰-tRNA合成酶（aaRS）配对系统。迄今为止，已有针对脯氨酸插入的正交配对系统被开发出来29，但据我们所知，尚未有报道实现脯氨酸类似物的插入。
需要注意，并非所有非天然氨基酸（ncAA）都能通过 SPI 方法实现掺入。首先，ncAA 进入细胞质的过程受到多种位于细胞质膜上的转运蛋白调控，对于像 E. coli 这样的革兰氏阴性菌而言，该膜即为其内膜。通常情况下，E. coli 能够将多种结构和化学性质上与天然氨基酸相似的氨基酸类似物转运进入细胞。其次，许多化学反应性强或不稳定的 ncAA 可能会抑制细胞生长，因其对宿主细胞的代谢和生理具有毒性30。因此，在使用前应预先测试 ncAA 对表达宿主的摄取效率和毒性。为避免对翻译后修饰（PTM）系统产生非特异性失活等副作用，可采用严格调控的基因表达系统，使天然氨基酸被掺入到修饰酶（如 nisBC）中，而 ncAA 被掺入到目标基因（如 nisA）中。这一策略可通过使用两个不同的启动子并分别诱导目标基因表达来实现，已在专门设计的 SPI 方案中得到验证31。如上所述，SPI 方法依赖于氨酰-tRNA 合成酶（aaRS）较宽的底物特异性，从而允许 ncAA 的活化及其对应 tRNA 的荷载。随后，该 tRNA 被运送至核糖体，进而形成酰胺键并完成目标（多）肽的折叠。在此过程中，校对和编辑机制可能发挥重要作用32。因此，选择在结构和化学性质上与天然氨基酸（cAA）尽可能相似的目标 ncAA 至关重要。其他关键因素还包括 ncAA 的足够稳定性（在培养基中以及暴露于细胞代谢环境下的稳定性）及其溶解性。此外，该 ncAA 应易于从商业途径获得，或能够通过化学方法简便合成。
本文描述了一种用于SPI的技术方案，可实现将非天然氨基酸（ncAAs）特异性地掺入重组类细菌素肽（RiPPs）的特定残基位点。具体而言，利用大肠杆菌（E. coli）作为宿主 organism，将不同的脯氨酸类似物掺入抗菌肽尼辛A（nisin A）中。通过质谱分析验证氨基酸的替换情况，并采用生长抑制实验和荧光显微镜结合微生物指示菌株对肽产物的生物活性进行分析。
成功表达含特定非天然氨基酸的重组乳酸菌素，其基本要求是需要一种合适的脯氨酸营养缺陷型 E. coli 菌株。为实现这种营养缺陷，proA 基因必须失活，例如通过基因组敲除实现。完全缺失细胞内脯氨酸生物合成能力（即，proABC 基因缺失）且无法回复突变的菌株可作为稳定的营养缺陷型菌株。常用的基因敲除方法包括噬菌体转导或依据 Datsenko &amp;#38; Wanner 方法进行的单基因敲除33。此外，proA 基因敲除菌株可从公共资源库（如 Addgene、CGSC 或 Keio 菌种库）获得。由于本文所示的重组 nisABC 表达依赖于 T7 启动子的使用，表达宿主菌株必须携带可诱导的 T7 RNA 聚合酶基因。这可通过将 λDE3 前噬菌体整合至宿主基因组实现，例如使用商业化试剂盒。或者，也可将 BL21(DE3) 等菌株按上述方法改造为营养缺陷型。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>0035.2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>P749.3</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3904.3</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3076.2</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3144.3</td><td></td></tr><tr><td>一水合L-天冬酰胺</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>HN23.1</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T202.1</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3467.3</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3772.1</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3774.1</td><td></td></tr><tr><td>L-甘氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3187.3</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3852.3</td><td></td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3922.3</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3984.3</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸一水合物</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>4207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>9359.4</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>4491.2</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T205.3</td><td></td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>4682.4</td><td></td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T206.2</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>4858.2</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>4879.4</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3746.3</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>0261.2</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>6780</td><td>配制20% (w/v) 溶液用于加入熔化的琼脂中</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>PN93.2</td><td></td></tr><tr><td>氯化亚铁</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>372870</td><td></td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3822.2</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜</td><td>Merck, Germany</td><td>102792</td><td></td></tr><tr><td>氯化锰</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>KK36.2</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>Merck, Germany</td><td>108816</td><td></td></tr><tr><td>正钼酸铵</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>7533.3</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>K029.5</td><td>大肠杆菌工作浓度为100 &amp;micro;g/mL，用ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O配制100 mg/mL储备液</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T832.2</td><td>大肠杆菌工作浓度为50 &amp;micro;g/mL，用ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O配制50 mg/mL储备液</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3886.1</td><td>乳酸乳球菌工作浓度为5 &amp;micro;g/mL，用乙醇配制37 mg/mL储备液</td></tr><tr><td>(4S)-氟脯氨酸</td><td>Bachem, Switzerland</td><td>F-3970</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-氟脯氨酸</td><td>Bachem, Switzerland</td><td>F-3975</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-羟脯氨酸</td><td>Bachem, Switzerland</td><td>F-1395</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-羟脯氨酸</td><td>Bachem, Switzerland</td><td>F-2980</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-甲基脯氨酸</td><td></td><td></td><td>化学合成</td></tr><tr><td>(4R)-甲基脯氨酸</td><td></td><td></td><td>化学合成</td></tr><tr><td>盐酸 (HCl)</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>P074.4</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR, Germany</td><td>20825.324</td><td></td></tr><tr><td>M17肉汤</td><td>Sigmal-Aldrich, Germany</td><td>56156</td><td>商品化产品，成分和配制方法参见 Terzaghi BE &amp; Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>来自乳酸乳球菌的乳酸链球菌素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>N5764</td><td>商品化产品，可用于生物活性参考</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>3899.3</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL LC-MS自动进样瓶</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>VWR, Germany</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td><td>需LC-MS级</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>VWR, Germany</td><td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td><td>需LC-MS级</td></tr><tr><td>1 mL 镍-NTA IMAC柱，例如 HisTrap FF Crude</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>29-0486-31</td><td>IMAC可使用不同厂家和树脂</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 瓶顶过滤器</td><td>VWR, Germany</td><td>10040-470</td><td>使用真空泵对溶液进行无菌过滤</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 聚偏氟乙烯膜注射器滤器</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>CCY1.1</td><td>使用注射器对溶液进行无菌过滤，并去除细胞裂解液中的颗粒</td></tr><tr><td>锁扣式注射器，聚丙烯，50 mL</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T552.2</td><td>用于溶液的无菌过滤&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf离心管</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（聚苯乙烯，无菌）</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>尼罗红</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>72485</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 &amp;Delta;proA 菌株</td><td>CGSC, Keio collection</td><td>JW0233-2</td><td>脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌K-12菌株</td></tr><tr><td>大肠杆菌 B834(DE3)</td><td>Novagen (Merck), Germany</td><td>69041</td><td>甲硫氨酸营养缺陷型大肠杆菌B菌株</td></tr><tr><td>&amp;lambda;DE3 溶原化试剂盒</td><td>Novagen (Merck), Germany</td><td>69734-3</td><td></td></tr><tr><td>乳酸乳球菌 NZ9000 pNG nisPT</td><td></td><td></td><td>细菌指示菌株，参见 Khusainov R &amp; Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td></tr><tr><td>适用于1.5 mL Eppendorf离心管的台式离心机</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>P1</td><td></td></tr><tr><td>FPLC系统</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>&amp;Auml;kta Purifier 10 或同类设备</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>TI Eclipse 宽场荧光显微镜&amp;nbsp; 配备100倍（数值孔径1.4）物镜和汞灯</td><td>荧光显微镜示例配置</td></tr><tr><td>电子倍增CCD (EMCCD) 相机</td><td>Andor Technologies, UK</td><td>Andor Luca&amp;nbsp;</td><td>荧光显微镜示例配置</td></tr><tr><td>荧光激发滤光片</td><td>Thorlabs, USA</td><td>二向色立方体 (TLV-U-MF2-TRITC)</td><td>荧光显微镜示例配置</td></tr><tr><td>荧光发射滤光片</td><td>AHF Analysentechnik, Germany</td><td>T 560 LPXR</td><td>荧光显微镜示例配置</td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>LH26.1</td><td>荧光显微镜示例配置</td></tr><tr><td>浸油</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td>Immersol 518 F</td><td>荧光显微镜示例配置</td></tr><tr><td>探头式超声破碎仪</td><td>Bandelin, Germany</td><td>Sonopuls HD3200 配 MS-72 超声探头</td><td>最大高频输出200 W</td></tr><tr><td>C5 HPLC色谱柱 (2.1x100 mm, 3 &amp;micro;m 粒径)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>567227-U</td><td>质谱分析示例配置</td></tr><tr><td>与HPLC系统联用的ESI-TOF</td><td>Agilent, USA</td><td>Agilent 6530 准确质量QTOF 配 1260 HPLC</td><td>质谱分析示例配置</td></tr></tbody></table>

通过非经典氨基酸的选择性压力整合产生的抗菌肽

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

自然界通过改变单个氨基酸组成单元的序列，拥有多种方式来创造新的蛋白质功能。然而，所有这些变异均基于20种标准氨基酸（cAAs）。为了向多肽中引入额外的理化性质，非标准氨基酸（ncAAs）的整合在蛋白质工程中正被越来越广泛地应用。由于核糖体合成并经翻译后修饰的肽段通常较短，因此利用ncAAs对其进行修饰尤为具有吸引力。通过特异性修饰个别残基，可生成新的功能基团和化学反应位点。选择性压力整合（SPI）方法利用营养缺陷型宿主菌株，在化学成分明确的培养基中缺乏某种必需氨基酸的条件下进行培养。若干结构和化学性质相似的氨基酸类似物可被相应的氨酰-tRNA合成酶激活，从而在目标肽或蛋白质序列中实现残基特异性的cAA(s) → ncAA(s)替换。尽管在SPI方法背景下，ncAAs也会在重组基因表达阶段被整合到宿主的蛋白质组中，但细胞的大部分资源主要用于目标基因的表达，这使得ncAAs能够高效地实现残基特异性整合，并通常伴随产生大量修饰后的目标产物。本文所述的工作描述了 体内 将六种脯氨酸类似物掺入由乳酸乳球菌天然产生的抗菌肽乳酸链球菌肽（一种羊毛硫抗生素）中 Lactococcus lactis. 乳链菌肽的抗菌特性可在其于营养缺陷型菌株中发酵和表达期间发生改变并进一步拓展 大肠杆菌 在限定培养基中培养菌株。因此，通过残基特异性地将天然氨基酸（cAAs）替换为非天然氨基酸（ncAAs），可改变抗菌活性和特异性。采用抗菌活性检测和荧光显微镜技术，检测新型乳酸链球菌素变体对革兰氏阳性菌生长抑制的效果。 乳酸乳球菌 指示菌株。采用质谱法确认生物活性乳链菌肽变体中非天然氨基酸（ncAA）的掺入。

本方案旨在通过SPI方法实现非天然氨基酸（ncAA）修饰的乳酸链球菌素变体的制备，其中可特异性地将脯氨酸类似物掺入指定残基。此前已有报道，通过重组方法生产完全修饰的野生型乳酸链球菌素，其产量可达24 mg/L39。采用SPI方法时，目标肽或蛋白的产量通常较高，可接近野生型的生产水平48。作为初步实验，应首先在选定的营养缺陷型宿主中测试重组野生型核糖体合成与翻译后修饰肽（RiPP）的生产能力。本研究中使用脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌E. coli MG1655 ΔproBA::frt ΔproC::frt (DE3)作为宿主菌株。为实现ncAA的掺入，可通过优化培养条件、诱导时机、培养基组成及培养温度，以获得最大肽产量。
抗菌活性检测 
野生型重组乳酸链球菌素的生产和纯化按照上述方案进行。在此过程中，第3.6步使用脯氨酸代替其非天然氨基酸（ncAA）衍生物。采用抗菌活性检测来验证RiPP的产生，并比较纯化前后抗菌活性的变化。在该活性检测中，直接使用洗脱组分和IMAC流穿液，对革兰氏阳性指示菌株L. lactis进行测试（图2）。由于该指示菌株表达NisP，因此分别存在于E. coli细胞裂解液或纯化肽样品中的乳酸链球菌素变体可通过前导肽的蛋白水解切割而被激活。显然，流穿液显示出抑制生长的活性，这可能是由于具有生物活性的物质未结合到IMAC柱上所致。所有测试的洗脱组分均比未纯化样品表现出更高的活性，表明通过IMAC实现了带His标签肽的富集。需要注意的是，在本实验中，洗脱缓冲液（作为阴性对照）未影响L. lactis的生长。
<img alt="抗生素敏感性试验示意图，包含洗脱液、缓冲液和流穿液；药物 Cm (400 µg/mL)。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2．重组表达的野生型乳酸链球菌素经 IMAC 纯化后的抗菌活性检测。将 IMAC 纯化的第 5 至第 15 号洗脱组分及流穿液，与未经纯化的细胞裂解液（经稀释以实现 OD600 标准化）进行比较，检测其对 L. lactis 指示菌株的抑制作用。抑菌圈的大小反映抗菌活性。以浓度为 400 µg/mL 的氯霉素作为阳性对照，IMAC 洗脱缓冲液作为阴性对照。<a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了验证含有六种不同脯氨酸类似物的重组表达乳链菌肽变体的抗菌活性，进行了活性检测实验，以测试其对 L. lactis指示菌株的抑制作用。图3显示了使用六种脯氨酸类似物中其中五种所生产的样品具有生长抑制效果。从抑菌圈大小判断，最佳结果出现在(4R)-氟代脯氨酸、(4R)-羟基脯氨酸和(4S)-甲基脯氨酸的掺入实验中。与平行条件下产生并检测的野生型乳链菌肽相比，这三种乳链菌肽变体表现出相似的抑制强度。然而，仅凭抑菌圈大小无法评估其特异性活性，因为抗菌肽（AMP）的浓度尚未测定。因此，该检测仅用于定性判断所获得的乳链菌肽变体是否保留或丧失了抗菌活性。要确定其特异性活性，必须对乳链菌肽变体的浓度进行定量分析（见讨论部分）。
<img alt="具有分子结构的化学反应过程；图示显示化合物的转化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3含有乳酸链球菌素变体的细胞裂解物的抗菌活性检测 通过 使用脯氨酸类似物的表面等离子体共振成像 nisin 变体与重组野生型样品的比较。所有样品的 OD600-在细胞裂解后，相对于收获的细胞培养密度进行归一化。晕圈表示指示菌株生长抑制形式的生物活性。第一行从左至右：(4R)-氟脯氨酸，(4R)-羟脯氨酸，(4R)-甲基脯氨酸和氯霉素（400 µg/mL；抗菌阳性对照）。第二行：（4S)-氟脯氨酸，(4S)-羟脯氨酸，(4S)-甲烷脯氨酸和脯氨酸（野生型对照）。注意化学命名法； 例如， (4R-氟脯氨酸也被称为 转-4-氟代脯氨酸 <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱法 
在IMAC纯化之后，通过液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱法（LC-ESI-TOF）分析非天然氨基酸（ncAAs）在乳链菌肽中的掺入情况。图4展示了含有(4R)-氟代脯氨酸的乳链菌肽变体的去卷积质谱图。该变体按照上述方法进行IMAC纯化后，直接进行LC-ESI-TOF质谱分析，因此仍保留前导肽。图4A中的主峰对应于含有(4R)-氟代脯氨酸的修饰型乳链菌肽，其去卷积质量为6883.18 Da（计算质量为6882.05 Da；相应野生型肽段在第9位为脯氨酸的计算质量为6864.06 Da）。两个丰度较低且质量较高的峰如图所示，为钠加合物。图4B展示了去卷积算法识别出的主要化合物的不同电荷态。例如，位于1148.11 m/z处的峰对应于六重质子化物种（[M+6H]6+）。
<img alt="质谱结果；A) 归一化丰度 vs. 质量 [Da]，B) 相对强度 vs. m/z。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4．含 (4R)-氟代脯氨酸的 IMAC 纯化重组乳链菌肽变体的液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱分析。（A） 含 (4R)-氟代脯氨酸的乳链菌肽变体（仍带有前导肽）的去卷积质谱色谱图（插图为整体视图）（预期质量 (Da)：[M+H]+ = 6882.05，[M+Na]+ = 6904.03，[M+2Na]2+ = 6926.02)。（B） [M+H]+ 物种的复合质谱图。预期质量 (Da)：[M+5H]5+ = 1377.41，[M+6H]6+ = 1148.01，[M+7H]7+ = 984.15，[M+8H]8+ = 861.26，[M+9H]9+ = 765.67，[M+10H]10+ = 689.21，[M+11H]11+ = 626.64，[M+12H]12+ = 574.50。<a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
荧光显微镜观察 
通过荧光显微镜直接观察指示菌株L. lactis，也可展示重组乳酸菌素及其含非天然氨基酸（ncAA）变体的抗菌活性。尼罗红是一种高度疏水性的荧光染料，用于染色细菌细胞膜。图5展示了菌液聚集状态及单个细胞形态的定性变化。细胞经尼罗红染色后置于显微镜载玻片上。上排图像显示在加入缓冲液、重组野生型乳酸菌素、含(4R)-氟代脯氨酸的乳酸菌素或含(4R)-羟基脯氨酸的乳酸菌素后立即观察的结果；下排图像则显示孵育20分钟后对应的显微图像。
<img alt="荧光显微镜，纳米颗粒分散的图像分析，比较聚集水平" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5．重组乳酸链球菌素对革兰氏阳性菌细胞作用的荧光显微镜观察。 对标记了尼罗红的30 µL L. lactis 指示菌株（OD600 = 1）在加入1 µL缓冲液（A）、0.3 µL重组野生型乳酸链球菌素（B）以及含(4R)-氟脯氨酸（C）和(4R)-羟脯氨酸（D）的0.6 µL乳酸链球菌素变体后，分别于孵育20分钟前（上图）和孵育后（下图）进行显微成像。蓝色圆圈标示细胞聚集或变形的区域，蓝色箭头指向可观察到荧光膜碎片扩散的区域。<a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图5A 显示，在20分钟的观察时间内，细胞的整体形态未发生改变。仅在观察期间沉积的细胞数量增加，因此在所观察的80 µm × 80 µm区域内可见更多的细胞。图5B 显示，革兰氏阳性菌细胞在接触野生型尼生素（nisin）20分钟后出现聚集和模糊现象（以蓝色圆圈标记），即使添加量较低（此处为0.3 µL IMAC洗脱液）也是如此。此外，有亮物质从细胞扩散至缓冲液中，表明在该时间段内，被尼罗红标记的膜碎片发生了移动（以蓝色箭头标记）。这些结果提示发生了细胞裂解，这与既往报道的尼生素处理后所引发的现象一致6,49。在与含(4R)-氟代脯氨酸的尼生素变体孵育后也观察到类似效应（图5C），以及与含(4R)-羟基脯氨酸的尼生素孵育后同样如此（图5D），两者在20分钟后均显示出大量形态扭曲和聚集的细胞，与对照样品（图5A）形成显著对比。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4 </td>
			<td>7.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl </td>
			<td>8.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-葡萄糖</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>所有标准氨基酸 
			（待替换的氨基酸除外）</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2+</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>微量元素 
			(Cu2+, Zn2+, Mn2+, MoOH2+)</td>
			<td>0.01 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硫胺素</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物素</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 按照步骤2制备后NMM19化学成分明确的细菌培养基的组成。

该方案介绍了 大肠杆菌基于选择性压力将非天然氨基酸（ncAAs）引入乳酸乳球菌抗菌肽乳酸链球菌肽（nisin）中。其特性可在重组表达过程中被改变 通过 在定义的培养基中用目标非天然氨基酸（ncAAs）进行替换。通过生长抑制实验和荧光显微镜检测映射其对生物活性的影响。

自然界通过改变单个氨基酸结构单元的序列，拥有多种创造新蛋白质功能的可能性。然而，所有……

本方法的总体目标是将非天然氨基酸掺入核糖体合成的抗菌肽中。通过该方法可产生新的变性肽，检测其中非天然氨基酸的存在，并利用琼脂扩散法测定其抗菌活性。该方法有助于回答抗菌剂或细菌学领域中的一些关键问题，例如特定肽位点在作用机制或耐药性发展中的作用。遵循相同的原理，可以产生多种froops，例如较小的肽，并可针对MRSA等病原体进行检测灵敏度的测试。可以合成自然界中不存在的新肽，用于开发抗菌剂以对抗病原体，并克服现有抗菌药物的不足。该技术的主要优势在于，无需在遗传水平上进行修改，即可并行测试多种非天然氨基酸的多样性。因此，可以相对容易地并行制备多种修饰肽。开始此操作时，在100毫升锥形瓶中准备含有抗生素和1%葡萄糖的25毫升LB培养基。使用新近转化的细菌菌落或冻存的菌种细胞进行接种。将细胞在37摄氏度、200 rpm条件下过夜培养。次日，取10毫升过夜培养物加入1升无菌新鲜培养基中。混匀后将培养物分装为两份，每份500毫升，分别置于两个2升的锥形瓶中，在37摄氏度、200 rpm条件下继续培养2小时。培养2小时后，以无菌培养基作为空白对照，测定OD 600。继续培养，并定期测定OD值，直至OD600达到0.5。随后，取出两份细菌培养物，在4°C、4,500 × g条件下离心15分钟。然后，倒去并弃除上清液。将细胞沉淀重悬于预冷的离心管中，加入20毫升含有抗生素和1%葡萄糖的NMM19培养基，冰上放置。将细胞悬液转移至50毫升离心管中，在4°C、4,500 × g条件下离心10分钟。随后，将细胞沉淀在冰上用5毫升新鲜培养基重悬。将细胞悬液转移至500毫升新鲜培养基中，在30摄氏度、200 rpm条件下孵育1小时。1小时后，将培养物均分为两份，分别加入两个独立的培养瓶中，每瓶对应一种非天然氨基酸（ncAA）或对照组。向每份培养物中加入储备液ncAA，使其终浓度为1毫摩尔；向野生型对照组中加入L-脯氨酸储备液，使其终浓度为1毫摩尔。然后，加入1 mM IPTG诱导目的基因表达。将培养物在28 °C、200 rpm条件下过夜培养。次日，测定OD值，并取每种培养物1 mL用于活性测定。通过在4摄氏度、5,000 × g条件下反复离心20分钟，收集每种培养物的剩余细胞。每次离心后，移除并弃去上清液，直至所有细胞均被收集完毕。将细胞沉淀物储存于-80摄氏度，直至进行肽段纯化。制备GM17琼脂平板时，首先在25毫升锥形瓶中，使用含1%葡萄糖和5微克/毫升氯霉素的M17肉汤，从冻存的甘油菌种中接种5毫升过夜培养的指示菌株。在30摄氏度下静置培养。次日，以GM17培养基作为空白对照测定OD值，并在新锥形瓶中加入5毫升新鲜培养基。接种至OD 600为0.1，继续培养。两小时后，定期间隔测量OD值，直至达到0.4至0.6。随后将预培养物置于冰上并保持低温。称取4.5克琼脂放入玻璃培养瓶中，加入300毫升双蒸水，混匀后高压灭菌，制成1.5%的琼脂。在300毫升双蒸水中配制两份x M17肉汤，并进行高压灭菌。将1毫升乳酸乳球菌预培养物加入含有10微克/毫升氯霉素和2%葡萄糖的25毫升2×M17肉汤中。然后加入25毫升温热的熔融琼脂混合物，将溶液倒入一个大型培养皿中。在保持无菌条件下，干燥培养皿10至15分钟。然后，用火焰灼烧玻璃巴斯德移液管的末端进行灭菌。待移液管冷却后，用其较宽的一端在凝固的琼脂上打孔。在培养皿底部靠近相应孔位的位置标记每个样品的标签。进行活性检测时，取1毫升大肠杆菌生产培养物样品，以7,000 × g离心3分钟。吸除残留培养基，并用移液器将菌体沉淀重悬于500微升磷酸钠缓冲液中。接下来，将超声破碎仪的探头浸入细胞悬液中，在冰上对样品进行超声处理。开始超声。然后，以13,000 × g离心细胞裂解液10分钟，以沉淀细胞碎片。将上清液转移至冰上的新反应管中。用磷酸钠缓冲液将上清液稀释并归一化至1毫升，使其OD 600等于0.6（相对于收获的细胞密度），并混匀。为检测抗菌活性，将40微升归一化后的样品加入指示琼脂的指定孔洞中。等待所有样品完全扩散至琼脂中。将培养皿置于30°C条件下过夜培养。次日，使用平板扫描仪或数码相机拍摄琼脂平板的图像。可通过手工或使用软件测量生长抑制圈的大小。进行荧光显微镜观察时，用DMSO配制10毫摩尔的尼罗红储备液。进行活性检测时，将指示菌株培养至OD 600等于1。取1毫升培养物，在4摄氏度、5,000 × g条件下离心3分钟。随后弃去上清液，并将沉淀用1毫升PBS重悬。然后再次离心样品并重新悬浮。随后，加入一微升尼罗红储备溶液，并轻轻混匀。进行显微成像时，将30微升细胞样品加入盖玻片上，在520纳米激发光下观察。设定采集时间为0.2秒，动力学序列频率为0.1赫兹，序列长度为200张图像。然后，加入 0.3 至 1.5 微升的细胞裂解液或纯化的肽样品。监测并记录波长等于或大于 560 纳米的荧光发射。将图像序列存储为 avi 文件，并使用 ImageJ 分析图像。该图显示了含有脯氨酸类似物的重组抗菌肽对细菌指示菌株的生长抑制作用。在琼脂扩散实验中，样品位置周围可见抑制圈。本视频展示了未添加抗菌肽时指示菌株的时间推移荧光显微镜图像。随着时间推移，由于仅添加了缓冲液，细菌细胞逐渐沉积在盖玻片上，在20分钟的观察期间，细胞形态未发生改变。该荧光显微镜延时成像展示了抗菌肽对指示菌株细胞的作用效果。随着时间推移，细菌细胞在暴露于含有非天然氨基酸4R-羟基脯氨酸的乳酸菌素变体后，逐渐出现聚集和模糊现象，如箭头所示。由圆圈标示，有光泽的物质从细胞扩散到缓冲液中，表明膜片段已被动员。该图显示了指示菌株在野生型尼生素或含有非经典氨基酸的变体存在下孵育后的效应。经抗菌肽处理后，细菌细胞发生聚集，如圆圈所示。细胞裂解液中，如箭头所示，细胞周围出现可见的轻质物质。孵育20分钟后，与阴性对照相比，可见大量变形和聚集的细胞。一旦掌握，该技术可在四天内完成。这包括非天然氨基酸修饰肽的制备，以及使用琼脂孔扩散法和荧光显微镜进行活性检测。在进行该实验时，需注意使用新鲜的细菌培养物和合适的培养基，并小心操作。在活性检测中，务必设置适当的阳性和阴性对照。完成此操作后，可进一步采用亲和层析和/或高效液相色谱法进行多肽纯化。必须通过质谱分析来证实非经典氨基酸的成功掺入。该技术建立后，为研究人员探索新型抗菌肽提供了途径，也可利用其他细菌或微生物宿主生产不同的多肽，并用于检测其抗菌活性。观看本视频后，您应能充分理解如何将非天然氨基酸引入抗菌肽中。

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科研

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