超声引导组织定向细胞植入术在生物学相关转移性肿瘤移植中的应用

该方法的目标是建立用于临床前研究的生物学相关的癌症原位异种移植物。通过超声引导将患者来源的神经母细胞瘤细胞注射到小鼠肾上腺中，无需开放手术或延长恢复时间。这种方法可以帮助回答癌症生物学和转化研究中的关键问题，例如肿瘤进化研究、天然微环境中的治疗反应和转移。

这样的知识将大大提高临床前研究的可靠性并促进药物发现。该技术的主要优点是它是患者来源的、组织导向的、高效且可靠的，可以生成用于癌症治疗研究的原位异种造影模型。高级技术员兼我们的实验室经理 Sahiti Chukkapalli 和我们实验室的研究员 Tina Thomas 将演示该程序中的关键步骤。

使用肿瘤解离试剂盒从肿瘤组织中生成单个患者来源的癌细胞悬液。首先将大约半克肿瘤组织转移到含有 5 毫升补充酶的 RPMI 缓冲液的 100 毫米细胞培养皿中。然后，使用剪刀和组织镊子将肿瘤切成 2 到 4 毫米的小块。

将肿瘤混合物移液到分离管中并关闭管。倒置试管，连接到组织分离剂的袖套上，并使用适当的程序分离组织。解离后，将肿瘤细胞悬液在 37 摄氏度的旋转架上孵育 1 小时。

孵育过程中每 15 分钟研磨一次细胞悬液。孵育后，将细胞悬液转移到新的 50 mL 锥形管中，并加入 10 mL RPMI。然后，将细胞悬液以 314 g 离心 5 分钟。

离心后，去除上清液并将沉淀悬浮在 5 毫升 RPMI 中。将细胞悬液通过 40 微米细胞过滤器，并将过滤后的溶液收集到新鲜的 50 mL 试管中。用 5 ml RPMI 培养基洗涤过滤器后，将细胞悬液以 314 g 离心 5 分钟以收集沉淀。

使用血细胞计数器计数细胞。然后，将沉淀悬浮在 RPMI 中，以获得每 10 微升体积中 5 个细胞的 4 倍 10 的最终浓度。每次注射将 5 微升这种细胞悬液转移到新管中，并将相同体积的基底膜基质转移到新管中，每次注射制备 10 微升细胞溶液，并将其置于冰上。

将鼠标转移到成像平台上，腹部朝下。安装并固定鼻锥以维持异氟醚麻醉。使用脱毛化妆水和剃须刀开始植入手术，以对适当麻醉的 6 至 8 周龄免疫缺陷型 NSG 小鼠的背部和侧面进行脱毛。

将光学软膏涂抹在动物的眼睛上以防止干燥。然后，将鼠标用胶带固定到位，以防止任何意外移动。接下来，使用超声可视化来识别小鼠肝脏、腔静脉、脾脏、左肾和邻近的左肾上腺。

将装有小口径针头的冷冻 Hamilton 注射器装入 10 微升细胞溶液。然后，在超声引导下，轻轻插入一根冷冻的 22 号导管，穿过皮肤和背部肌肉，直接插入左肾上腺，为细胞注射提供通道。取下针头并将导管留在原位。

在整个导管插入过程中，肾上腺以及针头及其轨迹的可视化对于确保对周围结构和器官的损伤最小以及降低小鼠发病率至关重要。然后，引导注射器穿过位于肾上腺中心的导管。当注射器被引导穿过导管时，保持导管稳定性并观察针头前进非常重要。

请注意，针头本身会延伸到导管终止位置后大约 2 毫米处，其位置在超声上很容易看到。将细胞注射到目标肾上腺组织中。将针头留在原位 1 到 2 分钟，让基底膜基质凝固。

基底膜基质凝固后，慢慢取出针头，然后取出导管。最后，将鼠标放入恢复笼中，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位，然后再返回家笼。超声成像监测体内肿瘤进展。

该图像显示了注射后一周肾上腺的超声图像。在这里，注射后 1 周注射神经母细胞瘤的小鼠的发光成像显示不指示肿瘤植入的读数。两周后，超声成像显示肿瘤植入并进展到大约 40 平方毫米的区域。

注射后 2 周的生物发光显示 10 到 7 的辐射率，这表明细胞摄取和肿瘤生长与超声结果相关。注射后 8 周的超声成像显示肿瘤持续生长，面积测量值大于 100 平方毫米。同样，生物发光证实了超声检查结果，辐射水平从 10 增加到 9。

肿瘤的 3-D 超声成像显示体积大于 100 立方毫米，这是我们实验室用于启动临床前治疗试验的基线。切除的肿瘤粗略测量大于 1 厘米，与超声测量和发光信号相关。该媒体演示了如何利用超声引导使用患者来源的神经母细胞瘤细胞成功建立肾上腺原位异种图。

一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在每次注射不到 12 分钟的时间内完成。