Name: 超声引导组织定向细胞植入术在生物学相关转移性肿瘤移植中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学习超声引导注射技术，将患者来源的神经母细胞瘤细胞精准植入小鼠肾上腺，建立原位异种移植模型。该方法无需开放手术，可高效研究肿瘤演化、治疗反应及转移机制，显著提升临床前研究的可靠性并加速药物发现。

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本工作获得了罗伯特·伍德·约翰逊基金会/阿莫斯医学教师发展计划、陶布曼研究所以及密歇根大学小儿外科部的支持。作者谨此感谢 Kimber Converso-Baran 和 Marcus Jarboe 博士在超声注射操作及成像平台使用方面提供的协助。我们感谢 Paul Trombley 在图像绘图方面的帮助。同时感谢密歇根大学放射学系提供分子成像中心和肿瘤成像核心设施的使用权限，这些设施部分由美国国立卫生研究院综合癌症中心（NIH grant P30 CA046592）资助。密歇根大学生理表型分析核心设施部分由美国国立卫生研究院（OD016502）和弗兰克尔心血管中心的资助支持。细胞系鉴定工作在密苏里州哥伦比亚市的 IDEXX RADIL 生物研究设施完成。我们感谢 Tammy Stoll、Rajen Mody 博士以及莫特实体肿瘤肿瘤学项目的支持。最后，我们衷心感谢患者及其家属，他们以自身的激励、勇气以及对我们研究工作的持续支持，给予了我们极大的鼓舞。

所有工作均按照密歇根大学机构审查委员会（HUM 00052430）的规定进行，并符合大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准的程序。动物医学实验室单位（ULAM）负责动物护理的监督。
所有工作均获得密歇根大学机构审查委员会（HUM 00052430）的批准，并符合所有人类研究伦理委员会的法规要求。&#160;人体细胞被视为潜在的生物危害性材料，因此应遵循贵机构要求的所有特殊预防措施和适当的生物安全操作规范。NSG小鼠免疫系统严重受损，易受环境中常见细菌引起的疾病感染。 
在准备移植材料和进行注射操作时，务必始终采用严格的无菌技术。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>在最低必需培养基中培养已建立的人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y、SK-N-BE2 和 IMR32），培养基中添加 10% 胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素和 100 μg/mL 链霉素。IMR32 细胞还需额外添加 1 mM 丙酮酸钠和 0.075% NaHCO₃。3. 所有细胞均在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 70-80% 汇合度.</li>
	<li>在补充有10%胎牛血清和6 mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基中培养人ES细胞系（TC32、A673、CHLA-25和A4573）。所有细胞均在37 °C、5% CO₂条件下培养。2 在细胞融合度为70-80%时.</li>
	<li>将所有细胞系送检进行鉴定。 
	注意：细胞鉴定由外部机构完成，详情请参见致谢部分。</li>
</ol>
2. 原代患者来源肿瘤细胞的制备
<ol>
	<li>在获得患者知情同意的前提下，从接受手术切除以进行局部控制的患者身上采集废弃的人神经母细胞瘤（NB）组织，并将其置于组织保存液中运输至实验室进行保存。 
	注意：所有患者样本均为去标识化处理，并严格按照机构审查委员会（IRB）指南进行操作。</li>
	<li>使用肿瘤解离试剂盒，从肿瘤组织中制备单个患者来源的癌细胞悬液（UMNBL001, UMNBL002）。取约0.5 g肿瘤组织转移至含有5 mL RPMI缓冲液、200 µL酶H、100 µL酶R和25 µL酶A（均来自人肿瘤解离试剂盒）的100 mm细胞培养皿中。</li>
	<li>使用剪刀和组织镊将肿瘤组织剪切成小块（每块2–4 mm），并将这些组织碎片与步骤2.2中的溶液混合。</li>
	<li>用移液器将肿瘤混合物转移至解离管中并盖紧管盖。将管子倒置并安装到组织解离仪的套筒上，运行程序h_tumor_01。</li>
	<li>将上述获得的肿瘤细胞悬液置于37 °C旋转摇床上孵育1小时，期间每隔15分钟进行一次间歇性吹打混匀。</li>
	<li>将细胞悬液转移至新的50 mL锥形管中，加入10 mL RPMI培养基，以314 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于5 mL RPMI培养基中。将此溶液通过40 µm细胞滤网，滤过液收集至新的50 mL锥形管中。用5 mL RPMI培养基冲洗滤网一次，合并滤液后以314 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定细胞密度15。将上述获得的细胞沉淀用RPMI培养基重悬，调整至最终浓度为4 × 105个细胞/10 µL。每次注射前取5 µL该细胞悬液与5 µL Matrigel混合，制成10 µL的细胞注射液。 
	注意：所用RPMI体积取决于细胞密度测定结果。例如，若测得细胞沉淀的密度为4 × 105个细胞，则将沉淀重悬于10 µL RPMI中。</li>
</ol>
3. 癌细胞的荧光素酶标记
<ol>
	<li>用5 mL病毒上清液EF1a-Luc2-IRES-mCherry和5 mL干细胞培养基配制10 mL转导培养基，加入7.5 µL的1×聚凝胺（polybrene）。</li>
	<li>将5 × 106个癌细胞加入转导培养基中混匀，接种于100 mm超低吸附培养板中。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。 
	注意：由于使用低吸附培养板，细胞不会贴壁。</li>
	<li>24小时后，将含细胞的100 mm培养板转移至细胞培养超净台中，将细胞混合液转移至15 mL锥形离心管中。以314 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。用1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀一次，然后将细胞沉淀重悬于含1%胎牛血清（FBS）的1 mL HBSS中。
	<ol>
		<li>根据荧光激活细胞分选（FACS）分析中GFP阳性信号对荧光素酶标记细胞进行分选。将分选后的细胞接种于100 mm细胞培养处理皿中，维持细胞融合度在70–80%，于37 °C、5% CO2条件下培养至后续实验所需状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光素酶检测试剂盒确认荧光素酶信号。将10 × 104个分选后的细胞接种至与发光仪兼容的96孔板中，每孔接种量相同，于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。24小时后，将96孔板恢复至室温，按1:1比例向各孔培养基中加入Steady-Glo试剂。静置5分钟使细胞裂解，随后在分光光度计中检测发光信号。</li>
	<li>将100 mm培养皿置于细胞培养超净台中，弃去上清培养基，用2 mL 1× PBS洗涤细胞一次。</li>
	<li>加入2 mL 0.25%胰蛋白酶，将培养皿放回培养箱中孵育2–3分钟。2–3分钟后，在显微镜下观察细胞是否已脱落，随后加入8 mL RPMI培养基以终止胰酶消化。</li>
	<li>将细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中，以314 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。弃去上清液。用1 mL 1× PBS洗涤细胞沉淀一次，将沉淀重悬于5 mL RPMI培养基中，并使用血细胞计数板15测定细胞密度。将剩余细胞悬液以314 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于RPMI培养基中，调整细胞浓度至4 × 105个细胞/10 µL。取5 µL细胞悬液与5 µL Matrigel混合，配制成每针注射用10 µL的细胞溶液。</li>
</ol>
4. 超声引导下肾上腺（NB）或肾被膜下（ES）移植
注意：所有超声检查均使用高分辨率活体成像系统进行。在所述操作中，采用中心频率为40 MHz、带宽为22–55 MHz的换能器。
<ol>
	<li>所有注射操作均使用6-8周龄的免疫缺陷型NSG小鼠。</li>
	<li>将Matrigel和已灭菌的Hamilton注射器（配备27G针头（1.25&#34;））以及22G导管（外径0.9 mm，长度25 mm）在4 °C条件下冷藏过夜。</li>
	<li>将步骤3中制备的细胞悬液置于冰上保存。</li>
	<li>使用含2%异氟烷（以2 L/min流速输送至O2中）的诱导室对小鼠进行麻醉。 
	注：麻醉充分的标准为小鼠无主动运动且保持自主呼吸。</li>
	<li>麻醉完成后，使用脱毛膏（如Nair）和剃须刀去除动物背部及侧腹部的毛发。</li>
	<li>将动物转移至成像平台，使其腹部朝下，鼻部插入鼻罩并固定，持续吸入异氟烷。</li>
	<li>在动物眼睛上涂抹眼用润滑膏以防止角膜干燥，并用胶带固定小鼠以避免意外移动。</li>
	<li>通过超声成像识别小鼠肝脏、下腔静脉、脾脏、左肾及邻近的左侧肾上腺。</li>
	<li>佩戴无菌手套、口罩和头帽以进行个人防护并维持无菌环境。在超声引导下，将22G导管经皮肤和背部肌肉轻柔插入左侧肾上腺，以建立细胞注射通道。拔出针芯，保留导管原位。</li>
	<li>将预冷的Hamilton注射器（配备细孔针头）吸取10 µL细胞悬液，然后在立体定位引导下经已置入的导管插入至肾上腺中心部位。</li>
	<li>将细胞注入目标肾上腺组织。注射后留针1-2分钟，使Matrigel充分凝固。随后缓慢退出针头，再移除导管。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，并确保其恢复足够的意识以维持胸卧位。 
	注：&#160;由于该技术具有微创性，术后疼痛极轻微，但仍需每日通过小鼠健康检查进行监测。&#34;应补充以下句子：&#34;若在实验过程中发现任何意外的疼痛或痛苦迹象，应立即联系所在机构的兽医支持部门，咨询有关镇痛或其他医疗护理的信息。 
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

超声引导下植入NB和ES细胞是建立可靠的鼠类异种移植模型以用于癌症生物学临床前研究的一种高效且安全的方法。超声引导组织靶向植入成功的关键在于，操作人员需经过专业培训，具备精确定位目标器官的解剖学知识，以及肿瘤细胞立体定位注射的技术专长。
肿瘤组织的解离是建立所述患者来源异种移植模型的关键步骤。原代肿瘤组织包含可能影响肿瘤摄取或移植效果的细胞微环境及周围间质。解离过程完成后，细胞计数可反映样本中的细胞密度，其中每10 μL含2 × 105 个细胞被视为移植及成功成瘤的理想细胞数量。
通过测量生物发光信号，对细胞进行荧光素酶标记可用于验证肿瘤移植情况并监测肿瘤生长，其中106 至 108 被视为肿瘤摄取的指征9为确保转导成功，通过检测荧光素酶活性进行验证 体外 在细胞注射前，通过免疫荧光、荧光素酶检测试剂盒以及检测细胞的生物发光信号来完成检测。生物发光信号的检测参数保持恒定，以确保每周测量数据的一致性...

动物异种移植模型是新型抗癌疗法临床前研究的重要工具。标准的小鼠异种移植模型通常采用细胞皮下侧腹移植，该方法可提供一个高效且易于观察的肿瘤生长监测位点。皮下模型的缺点在于其缺乏肿瘤特异性的生物学特征，这可能限制其转移潜能1。这一局限性可通过使用原位异种移植模型来克服，即在肿瘤的天然组织部位移植肿瘤细胞，从而提供具有转移潜能的相关微环境2。原位异种移植模型能够保留原始的生物学特性，为临床前药物发现提供可靠的模型系统3,4。用于组织定向移植的癌细胞可来源于已建立的细胞系，或来自患者肿瘤组织的原代细胞。与患者来源的异种移植模型相比，来源于癌细胞系的异种移植模型可能表现出与原发肿瘤更高的遗传差异性5。鉴于此，建立患者来源的原位异种移植模型已成为癌症药物研发中测试新型治疗手段的首选标准。
在儿童癌症神经母细胞瘤（NB）中，原位异种移植模型能够重现原发肿瘤的生物学特性，并向NB典型转移部位发生转移6,7。NB起源于肾上腺或沿椎旁交感神经链分布。目前最常见的原位移植方法需要进行开放性经腹腔手术。这类方法通常操作繁琐，动物发病率高，且术后恢复过程复杂。近年来，高分辨率超声已被用于多种小鼠癌症研究模型中肿瘤细胞的组织定向移植8,9。该技术可靠、可重复、高效，并且在建立相关转移性肿瘤异种移植模型方面具有良好的安全性10,11。
通过超声引导下靶器官定位及细胞系和患者来源肿瘤细胞的穿刺植入，建立儿童癌症异种移植模型的方法被展示11。该技术已用于将神经母细胞瘤（NB）靶向植入小鼠肾上腺。尤因肉瘤（ES）主要是一种骨源性癌症，常见于股骨和骨盆等长骨12。病例报告表明，为确定主要发生于骨骼的癌症是否可在肾组织中生长，选择肾被膜下区域作为原位移植的植入部位13。肾被膜下肿瘤细胞植入已被用作研究尤因肉瘤自发转移的有前景的模型14。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID</td><td>Charles River</td><td>394</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NB&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMR-32</td><td>ATCC</td><td>CCL-127</td><td>已建立的人神经母细胞瘤细胞系</td></tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>已建立的人神经母细胞瘤细胞系</td></tr><tr><td>SK-N-Be2</td><td>ATCC</td><td>CRL-2271</td><td>已建立的人神经母细胞瘤细胞系</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC32&amp;nbsp;</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>已建立的人尤文肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>A673</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>已建立的人尤文肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>CHLA-25</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>已建立的人尤文肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>A4573</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>已建立的人尤文肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD BioSciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织解离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>KentScientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>人肿瘤组织解离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS 组织解离仪</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 型管</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;荧光素酶标记&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-GFP1 病毒</td><td>University of Michigan, Vector Core</td><td></td><td>荧光素酶病毒</td></tr><tr><td>Steady Glo-荧光素酶检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生物发光成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ivis Spectrum 成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Promega</td><td>E160X</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;麻醉剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸入用异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-0017-25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;超声引导注射&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 高分辨率成像系统</td><td>Vevo</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器（27 号针头）</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>22 号套管针</td><td>BD Biosciences</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>Major Pharmaceuticals</td><td>301909</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co</td><td></td><td>脱毛剂</td></tr><tr><td>Aquasonic 100 超声传导凝胶</td><td>Parker</td><td></td><td>超声凝胶</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>DAKO</td><td>M3601</td><td>一抗</td></tr><tr><td>酪氨酸羟化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2928</td><td>一抗</td></tr><tr><td>二抗 HRP-聚合物抗体</td><td>Biocare</td><td>BRR4056KG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375E</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>手持式移液辅助器</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>数字动物电子秤&amp;nbsp;</td><td>KentScientific</td><td>SCL-1015</td><td></td></tr><tr><td>游标卡尺</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-16</td><td></td></tr><tr><td>6 孔低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养处理培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr></tbody></table>

利用超声引导组织定向细胞植入法建立具有生物学相关性的转移性肿瘤异种移植模型

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

抗癌疗法的临床前测试依赖于能够模拟癌症固有特性的相关异种移植模型。标准皮下侧腹模型的优点包括操作简便，以及无需侵入性成像即可监测肿瘤进展和治疗反应。然而，这类模型在转化临床试验中常表现出不一致性，且生物学相关特征有限，转移倾向较低，原因是缺乏原生微环境。相比之下，原位异种移植模型位于肿瘤的天然发生部位，已被证明能够模拟肿瘤微环境，并重现远处转移等重要疾病特征。但这类模型通常需要繁琐的外科手术，麻醉时间长，术后恢复期也较长。为解决这一问题，近期癌症研究人员已采用超声引导注射技术建立用于临床前实验的癌症异种移植模型，该方法可快速、可靠地建立组织靶向的小鼠模型。超声成像还为肿瘤移植和生长的长期评估提供了非侵入性手段。本文描述了利用超声引导将癌细胞注射至肾上腺（用于神经母细胞瘤，NB）和肾包膜下（用于尤文肉瘤，ES）的方法。这种微创方法避免了在特定组织部位进行开放手术植入癌细胞的繁琐过程，显著缩短了病态恢复期。我们介绍了使用已建立的细胞系以及患者来源细胞系进行原位注射的操作流程。目前已有商用试剂盒可用于肿瘤组织解离及细胞荧光素酶标记。通过影像引导注射细胞悬液，可提供一种微创且可重复的临床前模型构建平台。该方法还可用于建立膀胱癌、肝癌和胰腺癌等其他癌症的可靠临床前模型，展现出其在多种癌症模型构建中的巨大潜力。

采用上述操作流程，在配备加热手术台的专用操作室内，对小鼠进行了超声引导下NB细胞肾上腺植入。放置四肢电极垫以监测小鼠心脏活动（图1A）。通过鼻罩吸入异氟烷维持动物麻醉状态。使用高分辨率超声探头识别左肾，并在肾脏头侧定位其上方的肾上腺（图1B）。在直接可视化引导下，将穿刺针推进至肾上腺内（图1C）。在该技术初期应用阶段，采用亚甲蓝染料与Matrigel的混合物注射，以确认肾上腺定位的准确性。动物被处死后，通过解剖观察肾上腺被膜下是否存在亚甲蓝染料沉积，验证操作成功（图1D）。
每周采用超声成像和生物发光成像监测肿瘤移植情况及生长速率。感兴趣区域的生物发光成像信号以光子数/秒/平方厘米（photons/s/cm²）表示。...

本文介绍了一种利用超声引导将神经母细胞瘤（NB）和尤文肉瘤（ES）细胞（包括已建立的细胞系和患者来源的肿瘤细胞）注射到具有生物学相关性部位的实验方案，以建立可靠的癌症研究临床前模型。

抗癌疗法的临床前测试依赖于能够模拟癌症固有特性的相关异种移植模型。标准……

本方法的目的是建立具有生物学相关性的癌种原位异种移植模型，用于临床前研究。通过超声引导将患者来源的神经母细胞瘤细胞直接注射至小鼠肾上腺，无需开放手术或长时间恢复。该方法有助于回答肿瘤生物学和转化医学研究中的关键问题，例如肿瘤演化、在原生微环境中对治疗的反应以及转移机制的研究。这一知识将极大提高临床前研究的可靠性，并促进药物发现。该技术的主要优势在于，它源自患者、针对组织，在生成用于癌症治疗研究的原位异种移植模型方面具有高效且可靠的特点。实验关键步骤将由本实验室的高级技术员兼实验室主管Sahiti Chukkapalli，以及本实验室的研究员Tina Thomas进行演示。使用肿瘤解离试剂盒从肿瘤组织制备单个患者来源的癌细胞悬液。首先，将约半克肿瘤组织转移至含有5毫升酶补充型RPMI缓冲液的100毫米细胞培养皿中。然后，使用剪刀和组织镊将肿瘤切成2至4毫米的小块。用移液器将肿瘤混合物转移至解离管中，并盖紧管盖。将管子倒置，安装到组织解离仪的套筒上，使用适当的程序解离组织。解离完成后，将肿瘤细胞悬液置于37摄氏度的旋转摇床上孵育1小时。孵育期间每15分钟吹打重悬细胞一次。孵育结束后，将细胞悬液转移至一个新的50毫升锥形管中，并加入10毫升RPMI培养基。随后，以314g离心5分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL RPMI培养基中。将细胞悬液通过40微米细胞筛网，滤过的溶液收集至新的50 mL离心管中。用5 mL RPMI培养基洗涤筛网后，将细胞悬液在314 ×g下离心5分钟，以收集沉淀。使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后将细胞沉淀重悬于RPMI培养基中，调整细胞浓度至每10 µL体积中含有4 × 10⁵个细胞。每份注射液取5 µL该细胞悬液转移至新的离心管中，加入等体积的基底膜基质，使每份注射液的总体积为10 µL细胞溶液，并置于冰上。将小鼠腹部朝下放置于成像平台上。安装并固定鼻罩以维持异氟烷麻醉状态。开始植入手术：对一只经过适当麻醉的6至8周龄免疫缺陷型NSG小鼠，使用脱毛膏和剃须刀对其背部和体侧进行脱毛。在动物眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。然后用胶带将小鼠固定，防止其发生意外移动。接着，使用超声成像来识别小鼠的肝脏、下腔静脉、脾脏、左肾以及相邻的左侧肾上腺。使用10微升细胞溶液填充一支配有细孔针头的预冷Hamilton注射器。然后，在超声引导下，将一支预冷的22号导管轻柔地穿过皮肤和背部肌肉，直接插入左侧肾上腺，以建立细胞注射通道。拔出针芯，保留导管在原位。在整个导管插入过程中，对肾上腺以及穿刺针及其行进路径进行可视化观察至关重要，以确保对周围结构和器官的损伤最小化，并降低小鼠的发病率。随后，将注射器经已置入肾上腺中心的导管导入。在引导注射器通过导管时，必须保持导管的稳定性，并密切观察针头的推进情况。请注意，针头本身超出导管末端约两毫米，其位置在超声图像上清晰可见。将细胞注入目标肾上腺组织中。针头留置原位一至两分钟，以使基底膜基质凝固。 基底膜基质凝固后，缓慢拔出针头，随后移除导管。最后将小鼠放入恢复笼中，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位，然后将其放回饲养笼。超声成像用于监测体内肿瘤的进展。此图像显示注射后一周的肾上腺超声图像。此处，注射神经母细胞瘤后一周的小鼠生物发光成像结果显示，信号读数不提示肿瘤移植成功。两周后，超声成像显示肿瘤已成功移植并进展至约40平方毫米的区域。注射后两周的生物发光成像显示辐射值达到10的7次方，提示细胞摄取及肿瘤生长，与超声检查结果一致。注射后八周的超声成像显示肿瘤持续生长，面积超过100平方毫米。生物发光成像再次证实了超声结果，辐射值升高至10的9次方。肿瘤的三维超声成像显示其体积超过100立方毫米，这是我们实验室启动临床前治疗试验的基线标准。切除的肿瘤大体测量尺寸超过一厘米，与超声测量结果及生物发光信号相吻合。本视频展示了如何利用超声引导，成功建立来源于患者神经母细胞瘤细胞的肾上腺原位异种移植模型。一旦掌握，若操作得当，每次注射可在不到 12 分钟内完成。

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Cancer Research

癌症研究

超声引导组织定向细胞植入术在生物学相关转移性肿瘤移植中的应用

在本视频中，将来源于人类的黑色素瘤细胞皮下植入免疫缺陷小鼠的 flank 区域。PDX 模型可实现对黑色素瘤细胞的临床前研究，更好地重现 in vivo...

患者来源的异种移植模型构建：一种生成黑色素瘤小鼠模型的技术

建立原发性侵袭性原位膀胱癌异种移植模型的传统技术需要开腹手术并游离膀胱。该操作对小鼠造成显著的病痛，技术难度高且耗时。因此，我们开发了一种利用超声引导的高精度经皮穿刺方法。...

微创建立小鼠原位膀胱异种移植模型

本方案描述了通过将高级别尿路上皮细胞癌细胞经膀胱内灌注，或将结直肠癌细胞经直肠内注射至非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，建立患者来源的原位异种移植模型，以在淋巴结基质细胞影响下实现原发肿瘤生长及自发性转移，从而模拟人类转移性疾病的进展过程。...

源自患者的膀胱上皮细胞癌和结直肠癌原位异种移植模型用于肿瘤生长及自发性转移研究

采用手术原位移植技术，将患者来源的肿瘤组织块植入小鼠体内，同时结合培养的人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系进行针头注射，从而建立人肝转移性葡萄膜黑色素瘤的原位异种移植小鼠模型。...

在免疫缺陷小鼠中建立肝脏原位人眼葡萄膜黑色素瘤异种移植平台

我们描述了一种在超声引导下将小鼠来源的胰腺导管腺癌细胞系直接植入原位肿瘤部位的实验方案。该方法在注射后2至4周内即可通过超声扫描检测到胰腺肿瘤，且与手术原位植入相比，显著减少了肿瘤细胞在腹膜壁上的种植比例。...

超声引导下小鼠胰腺导管腺癌原位移植

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。...

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

骨转移模型的转移发生并不均匀，且发生率并非100%。直接骨内注射肿瘤细胞可能导致肺栓塞。我们提出一种通过将实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移的技术，该方法可实现可重复的移植物植入与肿瘤生长。...

利用实体瘤移植物骨内植入建立原发性骨肿瘤与骨转移模型

中枢神经系统转移瘤PDX模型能够代表人类转移瘤的表型和分子特征，是进行临床前研究的优秀模型。本文介绍了如何建立PDX模型以及适用于临床前研究的最佳接种途径。...

中枢神经系统转移患者来源异种移植模型的建立与应用

我们提出了一种通过超声引导下注射人胰腺癌细胞建立微创原位胰腺癌模型并随后监测肿瘤生长的实验方案。 体内...

通过超声引导注射建立胰腺癌细胞原位异种移植模型

本方案描述了一种高效、非手术的小鼠原位移植乳腺癌患者来源异种移植瘤的方法。该技术包括酶解法解离肿瘤组织，随后直接注射至乳腺脂肪垫中，可实现高通量移植。通过全面的验证确保模型的可靠性，有助于开展针对多种乳腺癌亚型的严谨研究。...

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小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

学习超声引导注射技术，将患者来源的神经母细胞瘤细胞精准植入小鼠肾上腺，建立原位异种移植模型。该方法无需开放手术，可高效研究肿瘤演化、治疗反应及转移机制，显著提升临床前研究的可靠性并加速药物发现。

利用超声引导组织定向细胞植入法建立具有生物学相关性的转移性肿瘤异种移植模型

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