培养小鼠卵巢的全贴装免疫荧光和卵泡定量研究

该程序的总体目标是获得与自动卵泡定量兼容的培养全卵巢的图像。这种方法可以帮助回答生殖生物学领域的关键问题，例如不同的条件如何干扰卵巢健康。这种技术的主要优点是劳动强度较低，并保持了器官的三维结构。

虽然这种方法已经针对出生后第 5 天培养的小鼠卵巢进行了优化，但它也可以应用于其他年龄和组织，例如胚胎性腺或年轻小鼠睾丸。从干净的工作台面开始。用 10% 的漂白剂擦拭，让漂白剂在工作区域表面停留至少五分钟。

五分钟后，用干净的纸巾和 70% 的乙醇去除多余的漂白剂。用 70% 乙醇彻底清洁解剖显微镜，并将干纸巾放在载物台上。用蘸有 70% 乙醇的纸巾包裹干净的镊子和剪刀。

然后在锥形管中制备 50 毫升卵巢培养基，并在 37 摄氏度的水浴中加热。培养基加热后，首先向 35 毫米组织培养板中加入 1 毫升卵巢培养基，以制备板和插入物。然后向 24 孔组织培养板的孔中加入大约 0.55 mLL 培养基，并将插入物放入每个含有培养基的孔中。

确保膜接触介质。将 35 毫米板和 24 孔载板放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳和大气氧气培养箱中。然后在解剖镜旁边放置一个热板，并将温度设置为 37 摄氏度。

如果组织培养箱不靠近解剖区域，请将含有卵巢培养基的 35 毫米组织培养皿中的一个放在热板上。然后开始解剖，用 70% 的乙醇喷洒新鲜安乐死的雌性，并在解剖显微镜下放在干纸巾的顶部。在腹腔切开后，挤出肠道并找到卵巢。

提取卵巢并将其放入 35 毫米培养皿中的培养基中。解剖卵巢后，增加解剖显微镜的放大倍数，以更好地观察卵巢和任何附着的组织。使用干净的细尖镊子，去除所有非卵巢组织，如滑囊和脂肪组织，而不会损坏卵巢。

接下来，将每对卵巢放在预先浸泡的细胞培养插入物上，并调整培养基的体积，以确保其足以保持器官湿润而不完全浸没。将移植的器官放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳和常压氧气的培养箱中。在所需的实验时间点，从板中取出卵巢培养基，并用新鲜制备的 4% PFA 溶液覆盖组织，将培养的卵巢固定在插入物上。

用石蜡膜密封板的边缘以避免蒸发，并将样品在 4 摄氏度下放置过夜。用 70% 乙醇冲洗组织 3 次。然后储存在装有 70% 乙醇的闪烁瓶中，在 4 摄氏度下，直到进一步加工。

从小瓶中取出 70% 乙醇，并在室温下用 PBS 洗涤固定的组织，振荡至少 4 小时，开始染色。去除 PBS 后，加入足够的透化溶液以完全浸没卵巢。置于定轨摇床上，在室温下孵育 4 小时。

用足够的封闭溶液替换透化溶液以完全浸没卵巢。然后将密封的样品瓶在室温下在轨道摇床上孵育至少 12 小时。封闭后，将插入片段放入 24 孔板中，加入约 750 μL 的一抗溶液，确保卵巢完全浸没。

然后将密封板放在定轨摇床上，在室温下孵育 4 天。四天后，去除一抗并加入大量洗涤液。清洗卵巢过夜。

第二天，更换为新鲜的洗涤液，并在轨道摇床上孵育 2 小时或更长时间。洗涤后，加入二抗溶液。保护样品避光，并在定轨振荡器上于室温下孵育两天。

两天后，从样品中取出二抗溶液并加入洗涤液。首先准备 ScaleS0 清除溶液。倒置混合溶液，并在 50 摄氏度下孵育 30 分钟。

对 ScaleS0 清除液进行脱气。然后从免疫染色的卵巢中取出洗涤液。添加清除解决方案。

用铝箔盖住板并将其放回轨道振荡器。在染色和透明化步骤中保持耐心非常重要。一旦组织变得透明，使用细尖手术刀小心地去除含有培养卵巢的插入膜。

将样品放在载玻片上，并用盖玻片轻轻盖住样品。然后继续在能够进行光学切片的显微镜上对样品进行成像。这张图片显示了一个尚未清除的出生后第 5 天的卵巢。

在这里，在加入透明溶液后一小时显示卵巢。卵巢在浸没在透明溶液中的几分钟内会开始变得半透明。可以在不清除的情况下对培养的卵巢进行光学切片，但组织深处的细胞具有难以与背景区分开来的信号，这阻碍了正确的卵母细胞定量。

相比之下，该代表性图像显示了一个透明化的样品，其中可以在整个器官中进行卵母细胞定量。在尝试此程序时，重要的是要记住抗体必须通过组织扩散;因此，较厚的组织将需要更长的孵育时间。看完这个视频，你应该对如何培养、染色和成像整个卵巢有了很好的了解。

本文介绍了免费软件 Fiji ImageJ 的使用，该软件可用于简单的毛囊定量。不要忘记，使用多聚甲醛和叠氮化钠可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用通风柜和个人防护设备。