Name: 心内神经元对体外 Langendorff 系统心脏电生理和心脏交感神经的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习利用离体Langendorff系统分析心内自主神经系统对心脏电生理、心律失常发生和cAMP动态的影响。该方法为研究结构性心脏病提供了可靠平台。

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作者感谢 Hartwig Wieboldt 提供出色的技术支持，以及汉堡埃彭多夫大学医学中心 UKE 显微成像中心（Umif）提供显微镜设备与支持。本研究由汉堡大学心脏中心促进协会（Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V.）和德国心血管研究中心（DZHK）[资助编号 81Z4710141] 提供资金支持。

所有涉及动物的实验程序均经汉堡州地方主管部门及汉堡大学动物护理与使用委员会批准。
1. 兰格多夫装置的准备
注意：使用市售的 Langendorff 灌注系统。
<ol>
	<li>配制改良的 Krebs-Henseleit 溶液（119 mM 氯化钠、25 mM 碳酸氢钠、4.6 mM 氯化钾、1.2 mM 一磷酸钾、1.1 mM 硫酸镁、2.5 mM 氯化钙、8.3 mM 葡萄糖和 2 mM 丙酮酸钠）。向灌注液中通入 95% 氧气和 5% 二氧化碳的混合气体，以防止钙盐沉淀。使用孔径为 0.22 µm 的滤器过滤缓冲液。</li>
	<li>根据需要向缓冲液中添加药理学试剂，以研究其对心脏电生理和心律失常发生的影响。</li>
	<li>启动水浴并将其内灌注液（含 95% 氧气和 5% 二氧化碳混合气体）放入其中。调节水浴温度，使灌注液在到达灌流插管前的温度约为 37 ˚C。</li>
	<li>当温度达到设定值后，立即启动蠕动泵，并用灌注液填充装置。</li>
	<li>在连接心脏前调节泵速，确保将插管安装至装置时，插管内无残留气泡。</li>
</ol>
2. 硬件和软件准备
<ol>
	<li>将数字数据采集系统及其配套软件连接至Langendorff装置，以持续记录灌注压、流速和心率。
	<ol>
		<li>在常规设置中将目标灌注压设定为80 mmHg。</li>
		<li>开始记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带有铂电极的电生理导管（材料表），其电极表面尺寸为0.5 × 0.5 mm，电极间距为0.5 mm，用于数据记录，并通过指定的数字刺激发生器进行刺激。
	<ol>
		<li>将导管放置在心脏连接至装置后所处位置的附近区域。</li>
		<li>从导管中选择2个电极进行刺激准备，刺激周期设定为100 ms。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 心脏的准备
<ol>
	<li>将冷的（约 2 - 4 ˚C）灌流缓冲液（10 - 20 mL 和 40 - 50 mL，确保完全覆盖整个培养皿）加入两个培养皿（直径分别为 6 cm 和 10 cm）以及带有插管的培养皿中，并立即将其置于显微镜旁及下方的冰上。在插管周围打一个双结备用。</li>
	<li>通过颈椎脱位处死动物后，使用梅奥剪刀和细齿镊子打开胸腔，迅速取出心脏。然后用伦敦镊子夹住膈肌上方的主动脉和腔静脉，用斜视剪刀紧贴脊柱切断所有血管和结缔组织，摘取心脏-肺块。</li>
	<li>将心脏-肺块转移至第一个盛有冰冻缓冲液的培养皿（直径 6 cm）中，使用斜视剪刀和伦敦镊子小心去除肺组织，避免损伤心脏。随后将心脏置于显微镜下，使用弹簧剪刀和杜蒙特SS镊子仔细去除胸腺、食管和气管。</li>
	<li>使用弹簧剪刀在右心房上部剪出一个 1.5 - 2 mm 的小孔，用于插入电极导管。在肺动脉上剪一个小孔。然后在主动脉弓分支下方直接剪断主动脉，并清除主动脉周围的组织，以便于打结固定。</li>
	<li>保留左心房周围包含主要心房分布神经节丛的脂肪垫，或通过精细解剖将其完全去除。</li>
	<li>将心脏转移至带有插管的培养皿中，并置于显微镜下。使用杜蒙特SS镊子将主动脉套入插管上，并将预先准备好的结扎线紧紧绑在主动脉周围。确保插管插入主动脉的深度适中，避免阻碍主动脉瓣和冠状动脉开口。</li>
	<li>迅速将插管连接至Langendorff装置。确保插管内无残留气泡。</li>
	<li>将灌流压力调节至 80 mmHg，以实现恒压灌流。</li>
	<li>小心地将导管插入右心房和右心室，避免接触或损伤心脏，并用胶带将导管固定在插管上。</li>
	<li>以预设的 100 ms 周长开始刺激，进行初始 20 分钟的平衡期。</li>
	<li>关闭灌流腔室，以维持稳定的温度环境。</li>
</ol>
4. 电生理参数与心律失常发生
<ol>
	<li>通过导管的远端或近端电极施加程序性刺激，刺激强度为心房或心室起搏阈值的两倍，以评估电生理参数，具体步骤如下所述。
	<ol>
		<li>测定窦房结恢复时间：在以120 ms、100 ms和80 ms的S1S1周长进行10秒固定频率起搏后，记录最长的返回周期长度。</li>
		<li>测定文氏点：以S1S1周长从100 ms开始，每次递减2 ms，直至出现第11次房室结传导中断，此时的最长S1S1周长即为文氏点。测定房室结不应期：采用S1S2程序（12次刺激；S1S1分别为120 ms、110 ms和100 ms；一次短耦联的期外刺激，S1S2间隔每次递减2 ms），记录导致房室结传导中断的最长S1S2间隔。</li>
		<li>测定心房和心室不应期：采用S1S2程序（12次刺激；S1S1分别为120 ms、110 ms和100 ms；一次短耦联的期外刺激，S1S2间隔每次递减2 ms），记录导致心房或心室无反应的最长S1S2间隔10,11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照Lambeth共识标准，采用程序性期外刺激（S1S1：120 ms、100 ms和80 ms，随后给予最多3次额外刺激，耦联间期从60 ms逐步递减至20 ms，每次递减2 ms）或猝发起搏方案（5秒内S1S1从50 ms逐步递减至10 ms，每次递减10 ms），以评估心室致心律失常性10,11,12。</li>
</ol>
5. 心外膜传导测量
注意：使用采样率为 25 kHz 的 128 通道计算机辅助记录系统记录单极心外膜心电图，以实现高分辨率标测。采用 32 通道多电极阵列（MEA；电极间距：300 µm；1.8 × 1.8 mm）。需注意，数据经过 50 Hz 带通滤波，以 12 位分辨率进行数字化，信号范围为 20 mV。
<ol>
	<li>将MEA放置于心脏的指定区域，并将接地电极连接至心脏的另一部分13,14,15。</li>
	<li>将心外膜刺激导管置于MEA附近，并开始持续刺激。</li>
	<li>通过检查信号质量和幅度确认电极接触良好后，开始记录。</li>
	<li>采用离线分析方法测定传导方向上的波传播速度和离散度。</li>
</ol>
6. 基于荧光共振能量转移（FRET）的环磷酸腺苷（cAMP）成像
注意：进行基于FRET的测量时，需从CAG-Epac1-camps转基因小鼠中获取心脏16。
<ol>
	<li>使用围绕体视显微镜搭建的自建成像系统15,17.</li>
	<li>将体视显微镜置于心脏前方并调节至清晰对焦。</li>
	<li>用光源激发cAMP传感器[例如，使用单波长发光二极管（440 nm）。利用分光镜将发射光分为供体和受体通道（对于青色荧光蛋白/黄色荧光蛋白对，使用565dcxr二向色镜以及D480/30和D535/40发射滤光片）。</li>
	<li>通过在腔室周围包裹塑料膜来确保温度稳定。</li>
	<li>使用科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机进行成像。通过开源成像软件（如 Micro-Manager）协调光源与相机的图像采集。</li>
	<li>开始图像采集时，按下 多维采集. 按钮，设置时间间隔，每隔10秒采集一次图像，曝光时间根据荧光信号强度确定（约100毫秒）。</li>
	<li>使用先前所述且可获取的 FRET 实时监测 以及 FRET 实时监测 2 插件17 将图像拆分为两个通道，选择感兴趣区域，并监测比率轨迹。</li>
	<li>实验过程中，根据实验性质，使用含有不同物质的改良 Krebs-Henseleit 溶液灌注心脏。</li>
	<li>实验结束时，通过按下按钮关闭数据采集 停止 按钮并保存图像堆栈。</li>
	<li>使用专用分析软件离线分析FRET数据，该软件可将图像分割为供体和受体通道的两个相同部分，并能在多个感兴趣区域进行FRET分析。 
	注意：一个专用插件（FRET 离线分析）是必需的，该信息由 Sprenger 提供 等17.
	<ol>
		<li>启动软件。通过前往分析界面打开分析 插件 菜单，然后单击 MicroManager，然后在 打开 Micro-Manager 文件.</li>
		<li>运行 FRET 离线分析 使用插件将延时图像拆分为两幅相同的图像，分别用于CFP和YFP通道。</li>
		<li>使用 自由选择 用于在YFP图像中标记感兴趣区域的工具。按下 添加 按钮以将所选内容添加到 多参数测量 窗口</li>
		<li>选择感兴趣的区域 多参数测量 窗口并按下 多 获取每帧和每个区域的平均灰度值表格。将所有数据复制并粘贴到 Excel 工作表中。</li>
		<li>点击 CFP 图像序列. 对CFP图像序列执行与步骤6.10.4相同的操作，并将平均灰度值粘贴至同一Excel表格中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离线校正供体信号渗漏至受体通道的串扰因子17.
	<ol>
		<li>使用以下公式，其中 B 为渗漏因子： 
		比率 = (YFP - B × CFP) / CFP</li>
		<li>通过成像仅表达CFP的心脏，测定渗漏因子B，并测量供体荧光在YFP通道中的百分比（B = YFP / CFP）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 神经形态学
注意：通过完整小鼠心脏的全 mount 免疫染色来分析心脏内自主神经系统。请注意，大部分心脏内神经节位于靠近肺静脉的心外膜脂肪组织中。
<ol>
	<li>使用不同的染色方法来显示神经丝蛋白（神经元的一般结构；鸡抗 NF-H，1:3,000）、酪氨酸羟化酶（TH，交感神经元结构；兔抗） &#945; TH，1:1,000）和胆碱乙酰转移酶（ChAT，副交感神经元结构；山羊） &#945; ChAT，1:50</li>
	<li>在Langendorff装置灌注后，将小鼠心脏置于10 mL甲醛中固定24小时，随后保存于4℃的磷酸盐缓冲液（PBS）中 &#730;C.</li>
	<li>用 Dent's 漂白液（4:1:1 甲醇：30% (w/w) 过氧化氢水溶液）漂白心脏2O：二甲基亚砜（DMSO）中，4 ℃下保存1周 &#730;C，并在PBS中进行甲醇梯度复水（100%、75%、50%、25%；每级1小时）18.</li>
	<li>在4℃条件下，于24孔板中进行以下孵育步骤，并保持轻柔振荡。 &#730;C：
	<ol>
		<li>用1% Triton-X-100/PBS（PBS-T）在室温下对心脏进行3次透化处理，每次1小时，随后在封闭缓冲液[5%牛血清白蛋白（BSA）/PBS-T + 0.2%叠氮化钠]中4℃封闭过夜。</li>
		<li>按如下方法稀释抗体：山羊 &#945; ChAT（1:50），兔 &#945; TH（1:1,000），鸡 &#945; 神经丝蛋白抗体（1:3,000）；用于荧光标记的二抗（1:500；或按制造商说明书）；用于显色标记的生物素化二抗（1:200；或按制造商说明书）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4℃下，将样本在封闭缓冲液中稀释的一抗溶液中孵育1周 &#730;C.</li>
	<li>用 PBS-T 缓冲液清洗心脏，每次 15 分钟，共洗 3 次，然后在封闭缓冲液中进行二抗孵育，持续 4 天。</li>
	<li>用 PBS-T 溶液清洗心脏 3 次，每次 15 分钟，然后在室温下将其置于荧光染色封片剂中孵育 3 小时，或根据制造商说明书使用亲和素-生物素复合物检测试剂盒。</li>
	<li>在含有3,3'-二氨基联苯胺（DAB）的商用缓冲液中预孵育心脏1小时，然后根据制造商说明书，在含DAB的缓冲液中显色，同时进行视觉监控。</li>
	<li>将标本保存在双蒸水中。</li>
	<li>对于石蜡切片，将心脏脱水并包埋于石蜡中。
	<ol>
		<li>剪切 4-&#181;m 厚切片，并根据实验室常规程序进行脱蜡。是否需要以及如何进行抗原修复，需根据每个实验体系的具体情况确定，因其取决于所使用的抗体组合。</li>
		<li>用0.2% Triton-X-100/Tris缓冲盐水（TBS）孵育切片10分钟以进行通透处理，随后用TBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>用3% BSA/TBS在室温下封闭1小时。</li>
		<li>在4℃下孵育过夜 &#730;C [一抗：山羊 &#945; ChAT（1:50），兔 &#945; TH（1:500），鸡 &#945; 神经丝蛋白抗体（1:1,000）或室温孵育2小时（荧光标记的二抗，1:500），溶于1% BSA/TBS中，孵育期间间隔用TBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>加入1 &#181;在二抗溶液中加入终浓度为 g/mL 的 bisbenzimide H33342 三盐酸盐，或采用其他核染色方法。</li>
		<li>使用荧光染色封片剂封片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种著名的离体心脏灌注系统——Langendorff ex vivo 心脏灌注系统，该系统结合不同的标测和刺激技术（包括心内膜和心外膜方法），可用于研究心内神经元对心脏电生理学及心律失常发生的影响。
该实验方案中有多个关键步骤。首先，必须采用一种能够保持心房脂肪垫完整或在不损伤心肌的前提下快速将其去除的制备技术。其次，需在右心房切开一个大小合适的开口，以便八极导管顺利插入右心房和右心室。导管应能轻松进入右心室，且不产生额外压力。在将导管连接至套管时，应避免导管进一步深入心室，以防造成心脏损伤。第三，温度控制是所有兰格多夫（Langendorff）装置中的关键环节1,2,5。在心律失常检测期间，应关闭温控室以维持稳定的温度；但在进行MEA或FRET记录时，温控室需至少部分打开以允许测量操作。此时应尽量缩短记录时间，或采取其他减少热量散失的措施，例如在较长时间的测量过程中用...

兰格多夫 离体 心脏灌注系统仍是开展去神经支配心脏的生理学、生物化学、形态学及药理学研究的重要工具1,2,3,4,5 自20世纪末发明以来th 世纪6迄今为止，该系统仍被广泛应用于各种研究课题（例如，缺血再灌注）或研究心脏药理学效应7,8，是心血管研究中的基本工具。该方法之所以经久不衰，源于其多项优势（例如，可在不受中枢神经系统或其他器官、体循环或循环激素影响的情况下进行测量。如有需要，可将药物以受控方式加入灌注液中，或直接施加于特定结构。实验具有良好的可重复性，且可在较短时间内完成相对大量的实验。由于装置具有部分开放的特性，可能难以实现精确的温度控制，需在实验设计中予以考虑。尽管朗根多夫（Langendorff）系统也用于较大型物种9，主要使用较小的动物，因为实验装置较为简单，且生物变异性更大（例如，可使用转基因小鼠模型。
在本实验方案的设置中，评估了心脏内自主神经系统对基本电生理参数、心室心律失常的发生、心外膜传导以及环磷酸腺苷（cAMP）动态的影响。大量心脏内神经节主要位于心房脂肪垫中，现已明确这些神经节能够独立于中枢神经控制来调节心脏电生理活动；在实验中，这些神经节可保持完整，或通过精细的机械分离手动去除。自主神经系统的药理学调节可通过将药物加入灌流缓冲液实现全局调节，或通过靶向调控心房神经节实现局部调节。实验结束后，由于持续灌流已清除所有血细胞，心脏组织非常适合进行免疫组织化学评估，这可提高染色质量。
所述技术的总体目标是为深入研究自主神经系统对小鼠心脏电生理学及心律失常发生的影响提供新的视角。采用该技术的原因在于，可以在不受中枢神经系统影响的情况下研究并调控自主神经系统。其主要优势之一是便于开展药理学实验，可用于测试新旧药物潜在的致心律失常或抗心律失常特性。此外，目前已有多种心脏疾病的转基因和基因敲除小鼠模型，可用于探究心律失常、心力衰竭或代谢性疾病背后的发病机制。该方法加深了我们对自主神经系统在心房水平如何影响心室电生理活动及心律失常诱发过程的理解。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401676</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>丙酮酸钠 bioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>碳合气（95% O₂ + 5% CO₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>SOL-Group，TMG 技术与医疗气体有限公司，克雷费尔德，格尔茨霍芬，德国</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤器 Steritop-GP 0.22</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>改良克雷布斯-亨莱溶液</td></tr><tr><td>硫酸阿托品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0257</td><td>神经调节</td></tr><tr><td>氯化六甲双铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2138</td><td>神经调节</td></tr><tr><td>烟碱游离碱 98-100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>神经调节</td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>30%（w/w）的过氧化氢水溶液</td><td>默克，KGA，德国达姆施塔特</td><td>H1009</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>德国达姆施塔特默克公司</td><td>D8418</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>18912-014</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分</td><td>Biomol，德国汉堡</td><td>11924.03</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>鸡抗神经丝蛋白</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>兔抗酪氨酸羟化酶</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>山羊抗胆碱乙酰转移酶</td><td>EMD Millipore</td><td>AP144P</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha; 兔IgG Alexa 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A21206</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha; 山羊IgG Alexa 568</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11057</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>驴 &amp;alpha; 鸡IgY Alexa 647</td><td>默克，KGA，德国达姆施塔特</td><td>AP194SA6</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>生物素偶联的驴 &amp;alpha; 兔IgG</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AP182B</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>生物素偶联的驴 &amp;alpha; 山羊IgG</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AP192P</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>生物素偶联的山羊 &amp;alpha; 鸡IgY</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BAD010</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>Vectashield封片剂</td><td>Vector Laboratories，伯林盖姆，加利福尼亚州，美国</td><td>H-1000</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>Vectastain ABC试剂盒</td><td>Vector Laboratories，伯林盖姆，加利福尼亚州，美国</td><td>PK-4000</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>稳定型 DAB/Plus</td><td>Abcam plc，英国剑桥</td><td>ab103723</td><td>整体染色</td></tr><tr><td>HistoClear</td><td>DiaTec，德国班贝格</td><td>HS2002</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>双苯并咪唑 H33342 三盐酸盐（Hoechst）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>B2261</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>Vectashield HardSet 封片剂</td><td>Vector Laboratories，伯林盖姆，加利福尼亚州，美国</td><td>VEC-H-1400</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>灌注系统</td><td>HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH，德国马尔-哈格斯泰滕</td><td>&amp;nbsp;73-4343</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>数据采集系统及其用于导管和生理参数的配套软件</td><td>Powerlab 8/30 &amp;& Labchart，ADInstruments，达尼丁，新西兰</td><td>PL3508 PowerLab 8/35</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>八极导管</td><td>CIB&amp;rsquo;ER 小鼠，NuMed 公司，美国纽约州霍普金顿</td><td>定制</td><td>朗根多夫装置</td></tr><tr><td>刺激发生器</td><td>STG4002，Multi Channel Systems，德国吕特林根</td><td>STG4002-160&amp;micro;A</td><td>刺激设置</td></tr><tr><td>刺激软件</td><td>Multi Channel Systems，德国吕特林根</td><td>MC_刺激 II</td><td>刺激设置</td></tr><tr><td>心外膜心电图数据采集系统及相应软件</td><td>ME128-FAI-MPA-系统，Multi Channel Systems，德国吕特林根</td><td>USB-ME128-系统</td><td>MEA 设置</td></tr><tr><td>多电极阵列</td><td>MEA，EcoFlexMEA36，Multi Channel Systems，德国吕特lingen</td><td>EcoFlexMEA36</td><td>MEA 设置</td></tr><tr><td>多电极阵列记录软件</td><td>Multi Channel Systems，德国吕特林根</td><td>MC_Rack</td><td>MEA装置设置</td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine Science Tools GmbH，德国海德堡</td><td>15003-08</td><td>心脏制备</td></tr><tr><td>斜视剪刀</td><td>Fine Science Tools GmbH，德国海德堡</td><td>14575-09</td><td>心脏制备</td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>Fine Science Tools GmbH，德国海德堡</td><td>14110-15</td><td>心脏制备</td></tr><tr><td>Dumont SS 镊子</td><td>Fine Science Tools GmbH，德国海德堡</td><td>11203-25</td><td>心脏制备</td></tr><tr><td>伦敦产钳</td><td>Fine Science Tools GmbH，德国海德堡</td><td>11080-02</td><td>心脏制备</td></tr><tr><td>窄型镊子</td><td>Fine Science Tools GmbH，德国海德堡</td><td>11003-13</td><td>心脏制备</td></tr><tr><td>塑料薄膜</td><td>Parafilm M，Bemis NA，美国威斯康星州尼纳赫</td><td></td><td>耗材</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica M165FC；Leica Microsystems GmbH，德国韦茨拉尔</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED，安多弗，英国</td><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;E-100</td><td>FRET</td></tr><tr><td>DualView</td><td>Photometrics，图森，亚利桑那州，美国</td><td>DV2-SYS</td><td>FRET</td></tr><tr><td>DualView滤光片组</td><td>Photometrics，图森，亚利桑那州，美国</td><td>05-EM</td><td>FRET</td></tr><tr><td>optiMOS 科学级 CMOS 相机</td><td>Qimaging，加拿大不列颠哥伦比亚省萨里市</td><td>01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td>FRET</td></tr><tr><td>成像软件 &amp;nbsp;</td><td>Micro-Manager；美国加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学 Vale 实验室</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>分析软件</td><td>Image J 软件；公共领域，NIH，美国</td><td></td><td>FRET</td></tr></tbody></table>

心内神经元对心脏电生理学及心律失常发生的影响 离体 朗根多夫系统

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

自20世纪末发明以来th 世纪，兰格多夫 离体 心脏灌注系统仍是研究去中枢神经支配心脏中一系列生理学、生物化学、形态学及药理学参数的重要工具。本文介绍了一种用于调控心脏内自主神经系统并评估其对基础电生理学、心律失常发生机制及环磷酸腺苷（cAMP）动态影响的实验装置。心脏内自主神经系统的调控可通过机械分离主要含有小鼠神经节的房脂肪垫实现，也可通过全局性或靶向性药理学干预手段进行。将八极电生理导管置入右心房和右心室，并使用心外膜多电极阵列（MEA）进行高分辨率标测，以测定心脏电生理特性及心律失常的发生情况。通过荧光共振能量转移（FRET）成像技术，实时监测心脏不同区域的cAMP水平。采用基于抗体的全心染色方法，结合神经元标记物进行神经形态学研究，以指导在实验中识别和调控心脏内自主神经系统中的特定靶点。 离体 Langendorff 灌流系统可在短时间内实现大量可重复的实验。然而，该系统的部分开放性（例如在MEA测量期间，难以实现恒温控制，应尽量减少此类情况。本方法可实现对离体心脏内心脏自主神经系统进行分析和调节。

图1展示了包含两个多电极阵列（MEAs）的兰格多夫装置图像。实验前，将心内导管置于靠近套管的位置，以便快速、顺利地插入右心房/右心室，并确保在最短时间内开始平衡过程。通过升高腔室的下部（见图1中的箭头），可完全闭合腔室，从而保证温度稳定。
图2 显示不同代表性的心脏染色结果。在 图2A 苏木精和伊红（H&amp;E) 展示了石蜡切片的染色结果。在示例性放大图中（图2B），心房神经节的免疫组织化学染色显示，以副交感神经细胞为主（红色，ChAT阳性），而交感神经细胞较少（绿色，TH阳性）。在 图 2C<...

在此，我们介绍一种用于调控心脏内自主神经系统并评估其对基础电生理学、心律失常发生机制及cAMP动态影响的方案，该方案采用一种 离体 朗根多夫装置

自19世纪末发明以来，朗根多夫离体心脏灌注系统仍是研究广泛生理病理过程的相关工具……

该离体 Langendorff 实验装置的总体目标是分析并调控心脏内自主神经系统，并评估其对去神经心脏基本电生理学、心律失常发生机制以及 cAMP 动态变化的影响。该技术的主要优势在于，它使研究人员能够在去神经心脏中对心脏内神经系统进行分析和调控。尽管该方法可为健康心脏的研究提供见解，但我们已初步获得证据表明，该方法也可用于研究多种类型的心脏结构疾病。首先启动水浴，并将灌注液（含95%氧气和5%二氧化碳的混合气体）放入其中。然后，在连接心脏之前调节泵速，以确保将导管安装到装置时其中无气泡残留。在常规设置中将目标灌注压力设定为80毫米汞柱，并开始记录。使用带有铂电极的电生理导管进行数据记录和刺激，电极表面尺寸为0.5毫米×0.5毫米，电极间距为0.5毫米，并连接指定的数字刺激发生器。然后，将导管放置在心脏连接装置后所处位置的附近。接着，迅速将套管连接至Langendorff装置，并确保套管内无残留气泡。将灌注压力调整至80毫米汞柱，以实现恒压灌注。将导管小心插入右心房和右心室，避免接触或损伤心脏，并用胶带将导管固定在插管上。随后，以预先设定的100毫秒周长开始刺激，进行初始20分钟的平衡期。最后，关闭腔室以维持稳定的温度。首先，通过导管的远端或近端电极施加程序性刺激，刺激强度为心房或心室起搏阈值的两倍，以评估电生理参数。随后，根据Lambeth共识执行程序性期外刺激或短阵快速起搏方案，以评估心室致心律失常性。接下来，将多电极阵列（MEA）放置于心脏的指定区域，并将接地电极连接至心脏的另一部分。将心外膜刺激导管置于靠近MEA的位置，并开始进行持续刺激。最后，在通过检查信号质量和幅度确认电极接触良好后，开始记录数据。使用围绕体视显微镜自行搭建的成像系统，首先将体视显微镜置于心脏前方，并调节至最佳清晰度。用光源激发cAMP传感器，并通过分光镜将发射光分为供体和受体两个通道。使用科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机采集图像。接下来，通过点击“多维采集”按钮开始图像采集，并设置时间序列实验，根据荧光信号的强度选择合适的曝光时间，每10秒采集一次图像。然后，使用前述的FRET Online和FRET Online 2插件将图像拆分为两个通道，选择感兴趣区域，并监测比率变化轨迹。在采集过程中，使用含有不同物质的改良Krebs-Henseleit溶液灌注心脏。然后，在实验结束时，点击“停止”按钮关闭采集，并保存图像序列。最后，使用专用分析软件离线分析FRET数据，该软件可将图像分割为供体和受体通道的两个相同部分，并能在多个感兴趣区域进行FRET分析。在这些整体染色图像中，展示了自主神经系统的部分结构。一个经免疫组织化学染色的心房神经节的典型放大图像显示，以红色标记的副交感神经细胞占主导地位，而绿色标记的交感神经细胞数量较少。在具有代表性的免疫组织化学染色图像中，神经纤

impact-intracardiac-neurons-on-cardiac-electrophysiology

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

心内神经元对体外 Langendorff 系统心脏电生理和心脏交感神经的影响

来源：Jungen, C., 等心脏内神经元对心脏电生理学及心律失常发生的影响 离体 朗根多夫系统 视频实验杂志...

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啮齿类动物心脏中的病毒转基因表达及心脏心律失常风险评估

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健康与缺血状态下双向电学与光电接口 离体 大鼠心脏

学习利用离体Langendorff系统分析心内自主神经系统对心脏电生理、心律失常发生和cAMP动态的影响。该方法为研究结构性心脏病提供了可靠平台。

心内神经元对心脏电生理学及心律失常发生的影响离体朗根多夫系统

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