Name: 从人类获得变性 Tenocyte 的一种协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解从人类变性肌腱细胞分离培养的标准化实验方案，用于研究肌腱病变治疗方法。该方法在标准手术中获取组织，无需额外损伤患者，为肌腱生物学研究提供可靠资源。

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本研究由韩国卫生科技研发计划资助&amp;#38;D项目，由韩国保健产业振兴院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 &amp;#38; 福利部，大韩民国（项目编号：HI16C1559）。

该方案遵循赫尔辛基宣言进行，并已获得CHA盆塘医疗中心机构审查委员会的批准。
1. 从患者体内获取退变的肌腱组织
<ol>
	<li>通过采集病史并结合体格检查结果诊断肱骨外上髁炎：肱骨外上髁附近肌腱起始处有压痛；腕关节抗阻伸展时引发疼痛。</li>
	<li>采用以下纳入标准：年龄超过18岁；患有肱骨外上髁炎病史至少六个月；对非手术治疗无效；自注射皮质类固醇、富血小板血浆或肉毒杆菌毒素以来已过去至少三个月。</li>
	<li>排除以下情况：孕妇；有颈椎病、肘关节关节炎、风湿性疾病、肘部周围手术史或神经卡压综合征病史的患者；拒绝捐献组织的患者。</li>
	<li>手术技术 
	&#8203;注：参见 图124。
	<ol>
		<li>采用异氟烷全身麻醉并行气管插管后，将上肢置于手术台上，绑扎止血带。随后在整个上肢涂抹聚维酮碘溶液，并用无菌手术巾覆盖。</li>
		<li>在肱骨外上髁稍偏前内侧、关节水平近端处，使用15号外科手术刀片做一3–5 cm的切口，暴露肘部外侧。</li>
		<li>肉眼辨认桡侧腕长伸肌（ECRL）与伸肌腱膜的交界处，并在该交界处使用15号外科手术刀片于ECRL与伸肌腱膜之间做一深约2–3 mm的纵行切开。</li>
		<li>将ECRL向前方牵开，使下方病变的桡侧腕长伸肌短头（ECRB）起点直接暴露于视野中。</li>
		<li>通过其特征性的暗灰色外观以及通常呈现水肿和易碎的组织形态，肉眼识别病变的退变组织。</li>
		<li>确认后，使用15号外科手术刀片和微型刀片仔细锐性切除所有退变组织。</li>
		<li>立即将切除的组织（约1 cm3）浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并尽快将周围非腱性组织彻底去除，仅保留腱组织，置入约10 mL PBS中。</li>
		<li>若肱骨外上髁处存在骨性骨赘，则使用咬骨钳去除骨赘，并用骨锉将其表面磨平。在股骨髁外侧前部钻多个孔（直径1.6 mm，约6–8个孔），以增强血供。此步骤为可选。</li>
		<li>使用不可吸收缝线逐层关闭切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>健康对照组腱细胞
	<ol>
		<li>在自体腘绳肌腱或自体髌腱前交叉韧带重建术中获取剩余的健康腱组织，作为后续实验的对照组25。 
		注：本研究中每组使用的样本数量为三个。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织学
<ol>
	<li>在化学通风橱或同等条件下，将约一半收获的组织保存于中性缓冲10%甲醛溶液中。</li>
	<li>将组织包埋于石蜡块（4–5 mL）中，并以冠状面切成4–5 µm厚的切片。</li>
	<li>使用苏木精-伊红染色法（H&amp;#38;E）和pH 2.5的阿辛蓝染色法对对照组和退变肌腱的切片进行染色。按照以下步骤在自动染色机中进行H&amp;#38;E染色。
	<ol>
		<li>使用二甲苯脱蜡（3次，每次5分钟）。</li>
		<li>从梯度乙醇逐级水化至水（100%乙醇，4分钟；100%乙醇，3分钟；95%乙醇，2分钟；70%乙醇，1分钟；水，2分钟）。</li>
		<li>苏木精染色5分钟，随后用清水充分洗涤2分钟。</li>
		<li>用1%酸性乙醇（含1% HCl的70%乙醇）分化3秒，再用清水充分洗涤3分钟。</li>
		<li>将切片浸入0.5%氨水中10秒以中和HCl，随后用清水洗涤3分钟。</li>
		<li>伊红染色5分钟。</li>
		<li>通过乙醇逐级脱水（80%乙醇，30秒；95%乙醇，1分钟；100%乙醇，1分钟；100%乙醇，2分钟）。</li>
		<li>二甲苯透明（3次，分别为2分钟、2分钟和3分钟）。</li>
		<li>加盖玻片封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Bond Polymer Refine Detection试剂盒进行免疫组织化学（IHC）染色，具体操作按照生产商说明书进行，仅作轻微修改。
	<ol>
		<li>使用二甲苯脱蜡后，采用Bond Epitope Retrieval Solution在100 °C下进行抗原修复30分钟。该修复液含有柠檬酸盐缓冲液和表面活性剂（1 L，pH 5.9–6.1）。</li>
		<li>用过氧化氢孵育5分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。</li>
		<li>在室温（21–22 °C）下，用针对血管内皮生长因子（VEGF）（1:200）、腱模蛋白（tenomodulin）（1:200）或mohawk（1:200）的一抗孵育切片15分钟。</li>
		<li>采用非生物素化的聚合物辣根过氧化物酶连接抗体系统进行二抗标记。
		<ol>
			<li>使用含10%（v/v）动物血清的Tris缓冲盐水/0.09% 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮溶液中的二抗兔抗小鼠IgG，以定位小鼠来源的一抗。</li>
			<li>使用含10%（v/v）动物血清的Tris缓冲盐水/0.09%溶液中的聚合物抗兔Poly-HRP-IgG（&#60;25 µg/mL），以定位兔来源的一抗。</li>
			<li>使用稳定剂溶液中的3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物，通过生成棕褐色沉淀显示抗原-抗体复合物。</li>
			<li>用&#60;0.1%苏木精（蓝色）复染，以显示细胞核。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在光学显微镜下观察经H&amp;#38;E染色、阿辛蓝染色以及针对VEGF、tenomodulin和mohawk的IHC染色的切片，并在每张切片的一个高倍视野（400X）下获取代表性显微图像。</li>
</ol>
3. 肌腱细胞培养
<ol>
	<li>组织准备
	<ol>
		<li>使用显微剪刀和镊子彻底去除肌腱样本周围的所有组织。</li>
		<li>用PBS洗涤，并切成小块（约1 mm3或更小）。</li>
		<li>在37 °C条件下，将组织置于30 mL添加了30 mg/mL II型胶原酶的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中消化1小时。</li>
		<li>用100 µm细胞筛过滤细胞。</li>
		<li>加入1 mL胎牛血清（FBS）以终止II型胶原酶的消化作用。</li>
		<li>以196 × g离心5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>将3 × 105个细胞接种至100 mm培养皿中，在含10% FBS和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养1周。</li>
		<li>每三天更换一次培养基，直至细胞融合度达到80%。将健康对照组和退变细胞样本均培养至第四代，用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 免疫细胞化学（ICC）
<ol>
	<li>将200 µL培养的细胞（2 × 105 个细胞）转移至八孔载玻片的各孔中，加入新鲜培养基培养1天，使细胞达到汇合状态。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞，每孔加入500 µL 4%多聚甲醛固定。</li>
	<li>用含0.5% Triton X-100的PBS孵育载玻片10分钟，以通透细胞膜。</li>
	<li>分别用含1%牛血清白蛋白和0.05% TWEEN-20的PBS对mohawk和tenomodulin进行封闭。</li>
	<li>在避光条件下，加入鼠抗mohawk单克隆抗体（1:100稀释）和山羊抗tenomodulin抗体（1:100稀释），4 °C孵育过夜。</li>
	<li>在避光条件下，室温孵育二抗1小时（tenomodulin使用Alexa 555-抗山羊抗体，1:200稀释；mohawk使用Alexa 488-抗小鼠抗体，1:200稀释）。</li>
	<li>每样本加入0.5 µL荧光封片剂封片。</li>
	<li>使用荧光显微镜（400×）进行观察分析。</li>
</ol>
5. 增殖实验
<ol>
	<li>使用水溶性四唑盐（WST-1）检测细胞活力。
	<ol>
		<li>将健康细胞和变性细胞以每孔 2 × 103 个细胞的密度接种至 96 孔板中，分别培养 24、72 和 120 小时。</li>
		<li>孵育结束后，向每孔加入 10 µL 的 10% WST-1 溶液。</li>
		<li>将培养板置于含 5% CO2 的环境中，于 37 °C 孵育 3 小时。</li>
		<li>使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。每个样本在各时间点至少重复读数三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 BrdU 检测法测定细胞 DNA 含量。
	<ol>
		<li>将健康细胞和变性细胞以每孔 2 × 103 个细胞的密度接种至 96 孔板中，分别培养 24、72 和 120 小时。</li>
		<li>孵育结束后，向每孔加入 10 µL 的 10% BrdU 溶液。</li>
		<li>将培养板置于含 5% CO2 的环境中，于 37 °C 孵育 3 小时。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 固定/变性溶液（60–70% 乙醇，0.1–0.5% 氢氧化钠），室温静置 30 分钟。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 配制好的 1× 检测抗体溶液，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>吸去溶液，用 1× 洗涤缓冲液洗涤培养板三次。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 配制好的 1× HRP 标记的二抗溶液，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>吸去溶液，用 1× 洗涤缓冲液洗涤培养板三次。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 的 50% TMB 底物溶液。</li>
		<li>室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>每孔加入 100 µL 终止液。</li>
		<li>使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。 
		注：每个样本在各时间点至少重复读数三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>使用 SPSS 收集并分析数据。</li>
	<li>以均值 ± 均值标准误表示数据。</li>
	<li>采用 Mann Whitney U 检验。</li>
	<li>当 p 值小于 0.05 时（p &#60;0.05），认为差异具有统计学显著性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

既往多项研究报道了使用不同方法（如胶原酶或软骨诱导素注射、跑步机跑动等）建立慢性肌腱病动物模型的方法26,27。尽管大量基于这些动物模型的研究显示出有前景的治疗效果，但在肌腱病研究领域中，使用人类退变型腱细胞进行实验对于重现治疗效果至关重要。本文中，我们建立了一种可稳定获取并培养人类退变型腱细胞的实验方案。所获取的腱组织及培养的腱细胞均表现出退变型腱组织和腱细胞的典型特征7,28。
根据我们的经验，为了成功获取组织，必须充分理解退行性肌腱常伴随的形态学变化，并在手术过程中准确定义该区域。退行性组织通常呈灰色或棕色，组织较薄、脆弱、结构紊乱且质地疏松。在取材前，应严格遵守本方案的纳入与排除标准，并仔细评估患者既往的治疗情况。
组织大小对于成功的细胞培养也非常重要。我们建议采集超过1 cm...

肌腱病是一种在身体多个部位发生的慢性退行性肌肉骨骼疾病。近年来，由于休闲体育活动的参与人数增加以及预期寿命延长，发达国家的肌腱病病例数量显著上升1,2。肌腱病的病因被认为是多因素的，包括缺血、氧自由基损伤、血管收缩与血管舒张神经支配失衡、内部微小撕裂以及神经调节的改变3,4,5,6,7,8。目前大多数肌腱病的治疗方法仅能缓解症状。此外，缺乏组织再生的治疗需要较长的康复时间，且对受损肌腱的修复效果有限，这给临床医生带来了挑战9。
由于现有治疗方案效果不佳，且退行性肌腱缺乏自我修复能力，研究人员开始关注探索替代性治疗策略。近期，多项新研究报道了利用生长因子、基于干细胞的疗法以及基因治疗来增强肌腱病肌腱愈合效果的许多有前景的结果10,11,12。
通过文献综述，我们发现相关研究可根据其分析材料分为两类：动物模型（如大鼠、小鼠或兔）和人体模型。在动物模型方面，目前有两种常用的技术用于建立腱病模型：化学诱导损伤或对模型进行机械性超负荷。然而，每种动物模型在模拟复杂的人类腱病病理方面均存在局限性13,14。
大多数使用人源样本的研究通过组织学方法进行分析或执行了 体外 基于健康人肌腱细胞而非退变肌腱细胞的实验15,16,17,18,19,20,21仅有少数论文报道使用了人退变肌腱细胞，但并未详细描述从人体获取退变肌腱细胞所采用的具体方案22,23在此背景下，需要注意的是，动物模型或健康组织/腱细胞的成功结果未必能够预测人体疗效或有效剂量，因为肌腱退变是一个复杂的过程，其发病机制尚未完全阐明。
总体而言，有必要描述一种从人体组织中获取退变肌腱细胞的标准方案，同时避免对供体造成不良影响。本文介绍了一种获取人源退变肌腱细胞的实验方法。为验证该方案的有效性，对所获取的组织进行了组织学分析。随后，通过免疫细胞化学（ICC）、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）以及细胞活力检测，确认所培养的细胞为退变肌腱细胞。

<table><tbody><tr><td>手术刀</td><td>Kisanbio</td><td>KS-Q0306-15</td><td>15号</td></tr><tr><td>微型刀片</td><td>Beaver</td><td>374769</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>50 mM 抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td>Bio-solution</td><td>BP031</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Rdtech</td><td>C0082</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>MKX (C-5)</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-515878</td><td></td></tr><tr><td>腱调节蛋白（Tenomodulin, N-14）</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-49325</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>BrdU细胞增殖检测试剂盒</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#6813</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs02786624_g1</td><td></td></tr><tr><td>COL3A1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00943809_m1</td><td></td></tr><tr><td>ACTA2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00426835_g1</td><td></td></tr><tr><td>TAC1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00243225_m1</td><td></td></tr><tr><td>TACR1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00185530_m1</td><td></td></tr><tr><td>PTGS2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00153133_m1</td><td></td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999903_m1</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（100 &amp;micro;m）&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8188207</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>尼康Eclipse 50i显微镜&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSA max微孔板读数仪&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96实时荧光定量PCR检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801340</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>90303-2185</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>DAKO</td><td>CS70030-2</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>DAKO</td><td>CS70130-2</td><td></td></tr><tr><td>阿利新蓝</td><td>DAKO</td><td>AR16011-2</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>25165-0430</td><td></td></tr><tr><td>内源性过氧化物酶阻断剂&amp;nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S200380-2</td><td></td></tr><tr><td>加拿大树胶</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>23255-1210</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>FEATHER</td><td>A35</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>SUPERIOR</td><td>1000612</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-7269</td><td></td></tr><tr><td>SPSS软件</td><td>IBM</td><td></td><td>Ver. 18.0</td></tr><tr><td>多功能离心机</td><td>LABOGENE</td><td>1248R</td><td></td></tr></tbody></table>

一种获取人源变性肌腱细胞的实验方案

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

肌腱病是一种因肌腱退变而引发的疼痛性疾病，在发达国家由于体力活动增加和预期寿命延长，其发病率正不断上升。尽管该病日益普遍，但其潜在的发病机制仍不明确，治疗通常以缓解症状为主。近年来，人们研究了多种治疗手段，包括生长因子、干细胞和基因治疗，希望增强退变肌腱的修复能力。然而，大多数相关研究仅在动物模型或健康人源腱细胞上进行。尽管已有部分研究使用了病变腱细胞，但据我们所知，目前尚无描述如何获取人源退变腱细胞的标准化操作流程。本研究旨在建立一种获取人源退变腱细胞的标准方案。首先，在手术过程中从一名患有肱骨外上髁炎的患者身上获取肌腱组织，随后从桡侧腕短伸肌腱中取活检样本，该部位对应于手术时观察到的结构改变。所有获取的肌腱组织均表现为 dull、灰白色、脆性增加且伴有水肿，肉眼即可与健康肌腱明显区分。将腱细胞进行体外培养并用于实验。同时，将一半获取的组织进行组织学分析，结果显示其具有肌腱病的关键组织学特征（血管纤维母细胞发育异常或增生）。进一步通过免疫细胞化学分析证实，所培养的细胞为腱细胞，其中大多数细胞对mohawk和tenomodulin蛋白呈阳性染色。随后通过增殖实验或qRT-PCR，将这些细胞与健康对照组进行比较，以确认其退变特性。退变腱细胞表现出更高的增殖速率，以及与既往报道一致的肌腱病相关基因表达模式。总体而言，该新方案可能为未来肌腱病的研究提供一种有用的工具。

组织学分析显示，从肱骨外上髁炎获取的组织具有肌腱病肌腱的特征。肌腱病退行性肌腱的H&amp;E切片显示胶原束排列紊乱，失去极性，缺乏细密、笔直且紧密排列的平行纤维结构。样本中常见提示退变的组织学征象，如细胞密度增高、细胞核增大且无典型梭形形态。此外，退变肌腱的胶原束经H&amp;E染色后呈较弱的嗜酸性，但经阿利新蓝染色呈阳性，表明蛋白聚糖和糖胺聚糖物质增加。
在所有情况下，与正常的裂隙状血管相比，血管数量增加，并出现占据纤维间嵌入区域的血管聚集。免疫组化染色显示，变性肌腱中的细胞对 VEGF 呈细胞质颗粒状阳性反应，而对照组细胞则呈阴性反应。综上所述，这些结果证实，从肱骨外上髁炎获取的组织为变性组织，适用于变性肌腱细胞的培养（参见 图2).
通过免疫细胞化学（ICC）确认培...

体外 在研究新型疗法对肌腱病疗效时，使用退变的肌腱细胞至关重要。然而，大多数研究仅采用动物模型或健康的肌腱细胞。我们提出以下方案，用于在手术过程中分离人源性退变肌腱细胞。

肌腱病是一种因肌腱退变而引发的疼痛性疾病，随着发达世界中体力活动和老龄化人口的增加，其发病率正不断上升。

该方法有助于解答有关人类退变性腱细胞生物学的关键问题，因为目前仅有少数研究详细描述了人类退变性腱细胞的分离与培养。该技术的主要优势在于，我们无需对患者造成额外损伤即可获得人类退变性腱细胞，因为退变组织是在常规的肱骨外上髁炎手术过程中获取的。本次操作将由我团队三级的Dr.Soo-Hong Han、Minjung Baek和Hyung Kyung Kim进行演示。为获取退变的肌腱细胞组织样本，使用15号手术刀在肱骨外上髁前内侧、关节水平近端处做一长度为3至5厘米的皮肤切口，以暴露肘关节外侧，并在伸肌腱膜界面处肉眼定位桡侧腕长伸肌。使用手术刀在桡侧腕长伸肌与伸肌腱膜界面之间做一分离切口，深度为2至3毫米。将桡侧腕长伸肌向前牵开后，根据病变退变组织特有的暗灰色外观以及通常呈现的水肿性和易碎性特征进行识别，并使用手术刀和微型刀片仔细而锐性地切除全部退变组织。当所有组织均已采集完毕后，按照标准操作规程使用不可吸收缝合材料关闭伤口，并仔细去除约一立方厘米大小的组织样本周围的全部周围组织，修剪完成后立即将洁净的肌腱组织放入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后，在化学通风橱中用中性缓冲的10%福尔马林固定约一半采集的组织，固定时间为12小时。为建立腱细胞培养，将采集的另一半对照组和退变组织样本分别转移至含有新鲜PBS的组织培养皿中，将组织切成一立方毫米或更小的组织块，每组组织加入30毫升DMEM培养基，并添加30毫克/毫升的胶原酶Ⅱ，在37摄氏度条件下消化组织片段1小时。消化结束后，将细胞悬液分别通过 100 微米的细胞筛过滤，并在每管中加入 1 毫升 FBS 以灭活胶原酶。通过离心收集肌腱细胞，并将细胞沉淀重悬于含 10% FBS 和 1% 抗生素-抗真菌溶液的 DMEM 培养基中，浓度为每 10 毫升含 3 × 10⁵ 个细胞。随后，将细胞按每种条件接种至一个 100 平方厘米的培养皿中，在 37°C、5% CO₂ 的培养箱中培养一周，每三天更换一次培养基，直至细胞融合度达到 80%。进行免疫细胞化学分析时，将两个实验组的细胞各10的5次方个，分别转移至含有200微升新鲜培养基的八孔细胞培养腔载玻片的每个孔中，于37°C培养24小时至细胞融合。次日，用PBS洗涤细胞，随后每孔加入500微升4%多聚甲醛固定，再用含0.5% Triton X-100的PBS溶液透化处理10分钟。为阻断非特异性结合，根据实验需要，用含1%牛血清白蛋白和0.05% Tween 20的PBS溶液孵育细胞，然后在4°C避光条件下，加入荧光标记的特异性一抗，4°C孵育过夜。第二天早晨，在避光条件下于室温用适当的二抗孵育细胞一小时，每孔加入0.5微升合适的荧光封片介质封片。然后在荧光显微镜下使用400倍物镜观察样品。对于组织的病理学分析，将经甲醛固定后的对照组和退变肌腱组织样品包埋于4至5毫升石蜡中，并从每个石蜡块获取4至5微米厚的切片。进行苏木精-伊红（H&E）染色时，将样本依次浸入二甲苯中三次，每次五分钟，以完成脱蜡；随后通过梯度乙醇浸润进行水化，并用自来水冲洗两分钟。接着，用苏木精对样本染色五分钟，再用自来水冲洗两分钟。将洗涤后的样本浸入1%盐酸和70%乙醇溶液中三秒钟，随后再用自来水冲洗三分钟。用0.5%氨水浸泡10秒以中和酸，随后再用清水洗涤3分钟。将中和后的样本用伊红标记5分钟，并用梯度乙醇脱水处理H&E染色的样本。经过三次二甲苯浸润后，使用适当的封片剂和盖玻片封固样本。为对组织样本进行免疫组织化学分析，请按照生产商说明书使用Bond聚合物增强检测试剂盒，并作以下微小修改。如所示，经二甲苯脱蜡后，将样本置于Bond抗原修复液中，在100摄氏度下孵育30分钟以进行抗原修复，随后在过氧化氢中孵育5分钟以淬灭内源性过氧化物酶活性。接下来，在室温下用目标一抗对切片标记15分钟。孵育结束后，在室温下用适当的无生物素聚合物辣根过氧化物酶连接二抗系统标记样本，孵育50分钟。然后将切片用合适的封片介质封片，并在光学显微镜下以400倍放大倍数进行成像。H&E分析显示，来自退行性肱骨外上髁炎的组织呈现出排列紊乱的胶原纤维束，极性丧失，并且缺乏细密、笔直、紧密排列的平行纤维结构。事实上，退变组织切片中的胶原束显示阿新蓝染色阳性，表明受损组织中蛋白聚糖和糖胺聚糖含量增加。对退变肌腱的免疫组织化学分析还显示，细胞质内出现颗粒状的血管内皮生长因子阳性反应，而对照组的健康肌腱组织样本中未观察到该反应。通过免疫荧光化学方法可确认两种培养的组织样本细胞均为肌腱细胞，因为大多数培养细胞表达典型的肌腱细胞标志物，如mohawk和tenomodulin蛋白，并呈现细长的形态。值得注意的是，与来自健康对照的肌腱细胞相比，退变的肌腱细胞在培养中也表现出更高的增殖速率，以及多种已知与肌腱病发生相关基因的表达水平升高。总之，这一经过验证的退变肌腱细胞培养方案为未来肌腱生物学研究及新干预措施的测试奠定了基础。

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医学

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