利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

本文的主要贡献在于，我们利用基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI成像质谱），对阿尔茨海默病脑组织中β-淀粉样蛋白病理的精细空间分布特征进行了深入探索。通过在组织切片中引入甲酸预处理的特殊实验方案，我们在技术上实现了进步。在完成MALDI-IMS分析后，生成了分割图谱，并进行了相关计算，以发现与淀粉样斑块及软脑膜血管系统共定位的新型标志蛋白或多肽。

从死后8小时内切除、处理并储存在-80摄氏度的人脑中获取用于成像质谱（IMS）的人类皮质标本。采集阿尔茨海默病（AD）患者及年龄匹配的对照组枕叶皮质的脑组织标本。在冷冻切片机上切片前，首先将导电的氧化铟锡（ITO）涂层显微镜载玻片放入冷冻切片机内。

将解剖脑组织样本从零下80摄氏度升温至零下22摄氏度，置于冷冻切片机内。每次实验均需安装新的 disposable 刀片，并始终尽量使用刀片的洁净部分。

将冷冻的尸检脑组织与少量最佳切割温度包埋剂一同置于切片台上。用于质谱成像和免疫组织化学时，从每个组织样本中切下5至6张切片。当刀片刚开始切割组织时，转动轮子并调整组织块方向，直至整个组织表面完全暴露。

如果切片上出现微小的条痕或撕裂，请在冷冻切片机中等待，直至温度调整自动修复。在打开防卷板前，先数几秒钟，并在下方放置一张纸巾。立即将组织切片转移到载玻片的ITO涂层一侧。

通过将手指放在载玻片非ITO涂层一侧的下方来解冻组织切片。组织将黏附在载玻片上。确保组织尽可能平整，无皱褶。

为清洗组织切片，将样品浸入盛有40至100毫升70%乙醇的玻璃染色缸中30秒，以去除内源性脂质和无机盐。按照文本方案中列出的洗涤顺序清洗样品。然后，在真空条件下干燥样品30分钟。

现在，使用甲酸蒸气处理组织切片，以促进从尸检脑组织中更有效地电离淀粉样蛋白β。具体操作如下：将烘箱预热至60摄氏度，并准备一个含有5毫升100%甲酸的孵育玻璃皿。保持孵育玻璃皿内的空气湿度处于饱和状态。

将组织切片放入孵育玻璃皿中，避免浸入甲酸，处理六分钟。使用胶片扫描仪、凝胶扫描仪或数字显微镜对样品拍摄光学图像。此步骤在室温下进行。

当样本靶标置于仪器内部时，需要对样本的光学图像进行对齐。通常情况下，无法识别基质层下方的组织切片。为了将光学图像与样本对应起来，需制作导向标记，使其在光学图像中以及基质层下方的相机光学系统中均可见。

最简单的方法是在拍摄光学图像之前，先在样品周围标记至少三个修正液点。使用超声波喷雾器喷涂基质时，需将待喷涂的组织从干燥器中取出并放入喷雾室中。确保组织未覆盖传感器窗口。

通过按下“开始”按钮启动制备过程。通常，制备时间约为90分钟。制备过程将通过监测基质层的厚度和湿润度自动调节。

或者，使用自动喷涂仪将基质溶液喷洒在组织表面时，可采用设定为10 psi和每分钟0.15毫升的溶剂泵系统输送基质溶液。基质溶液喷雾的同时将共同输送恒定流量的加热鞘气。利用MALDI-IMS进行高通量、高空间分辨率的成像实验。

进行质谱检测时，使用 MALDI 控制软件和数据分析软件定义组织区域。以正离子线性模式采集谱图，质荷比范围为 2,000 至 20,000，空间分辨率为 20 和 100 微米。制备校准标准品时，将肽段校准标准品和蛋白质校准标准品按 1:4 的比例溶于 CHCA 和 TA30 溶液中，然后稀释 10 倍。

在载玻片的四个不同位置各放置一微升校准标准品。使用分子组织学软件，叠加多个信号图像以分析不同信号的空间相关性，例如不同淀粉样蛋白β肽在老年斑和动脉壁中的共定位情况。在本研究中，3号患者的脑淀粉样血管病（CAA）表型最为显著。

该患者脑组织的MALDI-IMS清晰地显示，淀粉样蛋白β 1-42和淀粉样蛋白β 1-43优先沉积于脑实质中的老年斑内。相比之下，较短的淀粉样蛋白β（如淀粉样蛋白β 1-36至1-41）则优先沉积于软脑膜血管区域。在非病理学对照中未检测到显著信号。

使用组织的相邻冷冻切片通过免疫组织化学进一步验证了淀粉样蛋白β 1-40和淀粉样蛋白β 1-42的分布。抗淀粉样蛋白β 1-40抗体标记了脑淀粉样血管病（CAA），并显示淀粉样蛋白β 1-40优先沉积在软脑膜血管中，这与淀粉样蛋白β 1-42在脑实质中以老年斑形式分布形成明显对比。此处显示的是对3号患者同一组织切片进行二分k均值分析所获得的分割图。

该聚类方法成功识别出脑实质中的斑块样结构以及蛛网膜下腔中的血管结构。值得注意的是，在脑实质中发现了一个小的环形区域，该区域恰好位于脑实质内一条小动脉周围，同时也存在于蛛网膜下腔中。这一点通过这些单个淀粉样β肽的单离子成像得到了验证。

即使使用特异性抗体，同时追踪多种淀粉样蛋白β的范围仍然存在局限性。在此，我们采用前沿的基质辅助激光解吸电离成像质谱技术，展示了淀粉样蛋白β在人脑中的分布情况。我们相信，这项研究将为阿尔茨海默病研究带来突破，因为本报告首次对人死后脑组织中完整的淀粉样蛋白β蛋白谱系进行了表征。

最令人印象深刻的发现是，仅在淀粉样蛋白β的C末端发生单个氨基酸改变，即可使其分布产生显著变化。组织制备步骤对于实现人脑组织中聚集蛋白的有效电离至关重要。分析物与基质的均匀共结晶对于实现高灵敏度且无伪影的成像至关重要。