Name: 矩阵辅助激光去离子成像质谱法显示人脑中的淀粉样β矿床 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解利用基质辅助激光解吸电离成像质谱法检测阿尔茨海默病脑组织中淀粉样β蛋白沉积的技术。该方法通过甲酸预处理提高离子化效率，实现高分辨率空间定位，有助于揭示不同长度肽段的分布特征及其与神经病理的关系。

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本工作部分由创新领域科学研究费补助金（脑蛋白老化与痴呆症控制 26117004；授予 M.I. 和 T.M.）资助。本研究还部分得到了日本医疗研究开发机构（AMED）脑科学战略性研究项目的支持。所有实验均按照 ARRIVE 指南的要求进行。

本研究中的组织样本采集自东京都老年医院，该医院为日本老年人群提供基于社区的医疗服务。研究中使用的脑尸检样本已根据死者亲属的知情同意，登记至老龄化研究脑库（BBAR）。脑库的建立已获得东京都老年医院及老年学研究所伦理委员会的批准。对于所有登记在脑库中的脑组织样本，我们均获得了患者本人或其家属签署的书面知情同意书，同意将其用于医学研究。患者在死亡后2小时内即被转移至低温（4 °C）环境中，以减少脑组织的死后变化。本文所描述的所有方法均经同志社大学以及东京都老年医院和老年学研究所老龄化研究脑库的批准。
1. 质谱成像组织切片的制备
<ol>
	<li>处理人类尸体解剖脑组织标本 
	注意：质谱成像（IMS）的样本制备步骤必须确保组织原始状态的保留，避免污染及死后变化。以下步骤至关重要。
	<ol>
		<li>从死后8小时内切除、处理并储存在-80 °C的人脑中获取用于成像质谱（IMS）的人类皮质样本。采集阿尔茨海默病（AD）患者及年龄匹配对照者枕叶皮质的脑组织样本21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻组织切片的制备
	<ol>
		<li>在冷冻切片机上切取组织切片。将带有导电氧化铟锡（ITO）涂层的显微镜载玻片放入冷冻切片机内21.</li>
		<li>将尸检脑组织样本从 -80 °C 冷冻状态转移至冰冻切片机内，升温至 -22 °C。</li>
		<li>每次实验时，将一把新的 disposable 刀片安装到 cryostat 上。始终尽量使用刀片的洁净部分。</li>
		<li>将冷冻的尸检脑组织连同少量OCT包埋剂（用量以覆盖切片台中央区域为宜；参见 材料表).</li>
		<li>选择切片条件。进行成像质谱（IMS）时，人脑组织切片厚度为10–12 μm。对于IMS和免疫组化（IHC），每个组织样本切取5至6张切片。</li>
		<li>当刀片刚开始切割组织时，转动轮子并对包埋块进行“修面”，直至完全暴露组织。如果切片上出现细小条纹或撕裂，需在冷冻切片机中再等待片刻，待温度调整自动修复问题。在切片下方垫上纸巾，数几秒后再打开防卷板。</li>
		<li>立即将组织切片放置在载玻片的ITO涂层一侧。通过将手指置于载玻片无ITO涂层的一侧下方使组织切片解冻。组织会黏附在载玻片上；确保组织尽可能平整，无皱褶。此步骤在室温下进行。 
		注意：由于人体样本可能含有生物污染物，操作时需佩戴手套、口罩和实验服。当天所有切片完成后，使用实验室擦拭纸和200 mL 100%乙醇清洁冷冻切片机、刷子和样本夹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冲洗组织切片
	<ol>
		<li>将样本浸入 40–100 mL 70% 乙醇中 30 秒，以去除内源性脂质和无机盐。使用玻璃染色缸。</li>
		<li>使用玻璃染色缸，依次用40–100 mL的100%乙醇洗涤30秒，40–100 mL的Carnoy's溶液洗涤3分钟，40–100 mL的100%乙醇洗涤30秒，40–100 mL的0.1%三氟乙酸（TFA）洗涤1分钟，再用40–100 mL的100%乙醇洗涤30秒。 
		注意：Carnoy 溶液是一种固定液，由六份乙醇、三份乙酸和一份氯仿组成。</li>
		<li>在真空条件下干燥30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对组织切片进行甲酸蒸气处理以促进死后脑组织中Aβ蛋白的离子化
	<ol>
		<li>将5 mL 100%甲酸加入用于后续蒸气处理的培养玻璃皿和载玻片中。为获得理想的酸处理效果，此步骤中需保持培养玻璃皿内空气湿度处于饱和状态，并将温度维持在60 °C。将组织切片置于培养玻璃皿中，避免浸入甲酸，处理6分钟。</li>
		<li>使用胶片扫描仪、凝胶扫描仪或数字显微镜对样品进行光学成像， 等等。 在室温下进行此步骤。当样本靶标置于仪器内部时，必须对样本的光学图像进行对齐。通常情况下，无法识别基质层下方的组织切片。 
		注意： 拍摄光学图像最便捷的方法是使用办公扫描仪。建议将图像保存在成像数据存储文件夹中。</li>
		<li>为将光学图像与样品对应，需制作在光学图像中以及相机光学系统下基质层下方均可见的定位标记。最简单的方法是在拍摄光学图像前，在样品周围至少涂抹三个修正液标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基质应用
	<ol>
		<li>基质溶液的制备
		<ol>
			<li>在一支耐有机溶剂的微量离心管中，用50%乙腈（ACN）和0.1%三氟乙酸（TFA）配制10 mg/mL的SA溶液。通过涡旋振荡或短暂超声处理10分钟，充分溶解SA化合物。将溶液于室温下保存，待用。 
			注意： 基质喷涂有三种不同的方法：使用喷枪、超声波喷雾器或自动喷雾器。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用喷雾器喷涂基质
		<ol>
			<li>在恒定的室温（20–23 °C）和湿度（40%–60%）条件下进行操作。为获得最佳喷雾效果需调整的参数包括液滴大小、雾量、喷嘴与组织切片之间的角度和距离，以及实验室的温度和湿度。通过观察显微镜结果来调节这些条件。 
			注意：由于限制因素包括晶体尺寸、基质覆盖的均一性以及分析物的不良迁移/扩散，因此液滴尺寸越小越好。均一性也是检测的关键指标。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用超声波喷雾器喷洒基质
		<ol>
			<li>将待喷镀的组织从干燥器中取出并放入腔室内，确保组织未遮盖传感器窗口。</li>
			<li>开始准备，推动 开始 按钮；通常制备时间约为90分钟。制备过程将通过监测基质层的厚度和湿润度自动调控。制备完成后，取出载玻片，置于干燥器中存放15分钟，然后在MALDI仪器中进行检测。</li>
			<li>用 2–3 mL 的 100% 甲醇清洗喷雾器，直至喷头看起来洁净为止。 
			注意：基质液滴形成的细微雾状物通过重力作用沉降于组织表面。生成的液滴平均直径为20 μm，所有液滴直径均小于50 μm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用自动喷涂仪喷洒基质
		<ol>
			<li>使用自动喷涂仪将基质溶液喷洒至组织表面。基质溶液喷涂的同时，需共同输送恒定的加热鞘气（N2，设定为10 psi和75 °C）。采用溶剂泵系统（设定为10 psi和0.15 mL/min）输送基质溶液。 
			注意：最重要的是，在安全柜中操作，以避免吸入基质气溶胶。控制室温和湿度，以实现均匀的基质结晶。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）
<ol>
	<li>进行超高速质谱分析。
	<ol>
		<li>使用配备10 kHz Nd:YAG（355 nm）激光器的MALDI-IMS进行高通量、高空间分辨率的成像实验。</li>
		<li>进行质谱测量时，使用MALDI控制软件和数据分析软件定义组织区域。</li>
		<li>以正离子线性模式采集质谱数据，质荷比范围为m/z 2,000–20,000，空间分辨率为20和100 µm。</li>
		<li>配制校准标准品：将肽段校准标准品与蛋白质校准标准品按1:4的比例溶解于TA30溶液（乙腈:0.1%三氟乙酸 = 30:70）中的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）中，随后稀释10倍。将1 μL校准标准品点样于载玻片上四个不同位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分子组织学软件（见材料表），叠加多个单张图像以分析不同信号之间的空间相关性，例如不同Aβ肽在老年斑（SPs）和动脉壁中的共定位情况。</li>
</ol>
3. 数据处理
<ol>
	<li>进行光谱校正时，将所有光谱与先前文献中选定的质荷比（m/z）列表对齐21。</li>
	<li>将基线扣除后的MALDI-IMS数据集导入统计分析软件（参见材料表）。</li>
	<li>基于组织学知识勾画感兴趣区域（ROIs）。
	<ol>
		<li>对平均强度、标准差进行单变量分析，揭示具有区分性的m/z标志物（ROC分析）、假设检验以及共定位m/z值的发现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成分割图。
	<ol>
		<li>对大规模数据集进行无监督的多变量分析，以实现空间分割，并进行组分分析以提取潜在趋势。</li>
		<li>根据组织学特征（如实质组织和蛛网膜下腔）选择解剖学感兴趣区域（ROIs）。</li>
		<li>将结构指定为独立的感兴趣区域，并将其与处理后的质谱数据相关联，以鉴定出实现该区域图像分割的相关肽段。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了利用基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI-IMS）对阿尔茨海默病（AD）和脑淀粉样血管病（CAA）患者尸检脑组织中Aβ及其亚型进行可视化分析的详细实验方案与结果。Aβ沉积物的分布特征从Aβ1-42显著转变为具有不同N端和C端变异的形式。Aβ1-41首次通过本实验方案在人脑组织中被鉴定并实现可视化，并进一步通过免疫组化（IHC）得到验证21。考虑到高分辨率（20 μm）成像质谱（IMS）所呈现的Aβ沉积形态必须与免疫组化结果高度一致，因此IMS与IHC在基于沉积物位置、蛋白质组成以及形态学特征来区分Aβ沉积方面具有同等重要的作用。由于本研究中所有实验均在枕叶皮层进行，未来若应用本实验方案对全脑不同区域中各类β-淀粉样蛋白的定位进行研究，将有助于获得更具普适性的结论。
实验方案中的关键步骤是组织制备步骤，以实现对人脑组织中聚集蛋白的有效离子化。需要使用基质层来吸收激光能量，并诱导分析物的脱附和离子化。在此过程中，整个组织切片将被均匀地涂覆上微小晶体。分析物与基质的均匀共结晶对于实现高灵敏度且无伪影的成像至关重要。三种喷涂方法各有优势。手动喷涂是最常用的方法之一。气动喷雾法操作便捷，但需要熟练的操作技巧。由于实验技术的精确性和可重复性至关重要，建议采用本方案中所述的超声喷涂仪和/或自动喷涂仪。使用超声喷涂仪时，因其在封闭腔室内进行喷涂，不受环境湿度和温度的影响。而使用自动喷涂仪则可以获得相对较高的空间分辨率以及良好的可重复性。总体而言，这三种方法所获得的空间分辨率按以下顺序依次提高：1）气动喷涂，2）自动喷涂装置，3）超声喷涂仪。
最重要的是，本方案最初是为了检测和可视化人脑尸检样本中的 Aβ 而设计的。此前已有其他研究者利用现有方法，对基于人源 APP 瑞典型突变构建的 AD 动物模型 APP23 小鼠脑组织中的 Aβ 进行了 MALDI-IMS 可视化分析18,19。然而，先前用于 APP23 小鼠的方案在侧向分辨率和灵敏度方面尚不足以有效可视化 Aβ。早期研究指出，在使用其方案对 APP23 小鼠成像时，组织边界外出现的高 Aβ 信号明显属于伪影18,19。这意味着由于基质萃取步骤的存在，真实老年斑（SPs）与成像结果之间出现所谓的“模糊”现象在 MALDI 成像中难以避免。但在本方案中，这种模糊现象已消失，每个质谱信号均能准确对应脑实质中的单个老年斑。
如图所示，我们首次利用基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）以及自行制备的特异性抗体通过免疫组化（IHC）方法，在阿尔茨海默病（AD）和脑淀粉样血管病（CAA）脑组织中对Aβ1-41进行了示踪21根据Aβ加工模型，Aβ1-38来源于Aβ1-45 通过 Aβ1-42，而Aβ1-41由Aβ1-45经γ-分泌酶逐步切割产生27,28,29,30,31这意味着当前方案支持该模型。至于该技术的局限性，我们必须考虑来自人类尸检脑组织样本的异质性问题。从某种意义上说，最关键的步骤是对具备伦理合规证明的合格尸检脑组织进行评估。针对这些合格的尸检脑组织，采用当前方案结合基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI-IMS），可分别追踪具有多种修饰的复杂分子的全脑分布，以及尚待明确的调控阿尔茨海默病（AD）发病机制的未知因子。此外，在理解老年人脑中多种神经病理改变的整体发病机制时，将MALDI-IMS与神经系统疾病的临床、遗传和病理学观察相结合，有望成为一种标准化的研究方法。
MALDI-IMS 的另一个关键步骤是对获得的数据集进行数据挖掘，这一过程通常十分耗时。手动对每个峰的分布进行数据挖掘时，用户需要逐一浏览每幅图像，寻找可能与分析样本形态相关的分布特征。自动空间分割可作为数据挖掘的第一步，提供数据集的整体概览，并实现显著特征的快速识别。在此方法中，通过统计学方法确定特定区域内光谱之间的相似性，并将相似的光谱归为同一簇。所有像素根据其所属的簇进行颜色编码（图5）。在当前针对阿尔茨海默病（AD）和脑淀粉样血管病（CAA）的研究中，感兴趣区域为实质斑块中 Aβ 沉积的空间分布，以及软脑膜和实质内的血管结构。通过免疫组化（IHC）进一步验证的两个显著峰分别为 Aβ1-40 和 Aβ1-42 的质荷比（m/z）值21。因此，可方便地找出与 Aβ1-40 和 Aβ1-42 共定位的 m/z 值，这些峰已被注释为 N 端和 C 端截短的 Aβ 肽段，以及尚未鉴定的肽段，供后续深入分析。
Weller 及其同事报道，Aβ 在血管壁中积聚，且在动脉周围的沉积多于静脉周围21此外，有研究提出，脑实质排出的Aβ会进入淋巴结，并存在于组织间液（ISF）中。 通过 一种血管周围引流通路22,23,24,25,26当前基于分辨率为20 µm的MALDI-IMS数据集生成分割图的实验方案支持脑内存在血管周围引流通路的可能性图5），这些成分在阿尔茨海默病（AD）的脑淀粉样血管病（CAA）中具有重要贡献21,32此外，我们可以通过计算每个m/z值的相关性，发现与斑块和软脑膜下血管共定位的标志蛋白。在理解老年人脑中多种神经病理整体发病机制的过程中，将基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI-IMS）与神经系统疾病中已建立的临床、遗传和病理观察的免疫组织化学（IHC）数据相结合，作为一种强有力的分析方法，具有重要的应用前景。

为了明确诊断并理解神经退行性疾病的发病机制，对病理沉积物进行精确的分子鉴定至关重要1。在阿尔茨海默病（AD）发展过程中，Aβ在疾病发病前很久即已产生，并在脑实质中形成老年斑（SPs），同时在血管中沉积2,3,4,5,6。尽管Aβ1-42是AD脑组织中老年斑的主要肽段，但在受累的AD脑组织中也已鉴定出其他Aβ变体，例如N端或C端截短或修饰的Aβ肽段7,8,9,10。全面了解人脑中各种Aβ物种的分布情况，尤其是阿尔茨海默病和脑淀粉样血管病（CAA）患者脑中的Aβ谱系11，将有助于科研人员深入理解Aβ的生成、代谢及沉积过程。
作为神经病理学的经典方法，免疫组织化学（IHC）一直是确定Aβ在脑组织中定位的最确凿方法12,13,14,15。通常情况下，当多个表位同时共存时，IHC无法区分不同的分子。相比之下，新兴的基于质谱的蛋白质组学分析是一种极具价值的方法，尤其适用于分析脑组织中那些无法通过抗体区分的多种Aβ亚型16,17。传统的基于质谱的脑组织裂解液和免疫沉淀样品分析难以检测到微量的Aβ肽段，并且会丢失Aβ在脑组织中的分布信息。
在早期研究中，使用阿尔茨海默病的转基因动物模型（如 APP23）已成功实现小鼠脑内 Aβ 沉积的可视化。然而，该过程仍需技术上的改进，以在分辨率和灵敏度方面对成像质谱（IMS）与免疫组织化学（IHC）进行比较18,19,20。阿尔茨海默病的神经病理学研究应在人脑组织上开展，因此我们应用基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）技术对人类尸检脑组织进行分析，以获得全面的蛋白质分布图谱21。为此，我们建立了一种先进质谱技术的实验方案，该方法在快速性、灵敏度和可重复性方面具有优势。

<table><tbody><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>氧化铟锡（ITO）涂层显微镜玻片</td><td>Bruker Daltonics</td><td>#237001</td><td></td></tr><tr><td>刀片（一次性）</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>#117394</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>FSC 22 Blue</td><td></td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>EPSON</td><td>GT-980</td><td></td></tr><tr><td>喷笔</td><td>GSI Creos</td><td>PS274</td><td></td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>MRHOBBY</td><td>Mr.Linear compressor L5</td><td></td></tr><tr><td>超声波喷涂仪</td><td>Bruker Daltonics</td><td>ImagePrep</td><td></td></tr><tr><td>自动喷涂仪</td><td>HTX Technologies</td><td>TM Sprayer</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>超高速MALDI质谱仪</td><td>Bruker Daltonics</td><td>rapifleX MALDI Tissuetyper</td><td></td></tr><tr><td>MALDI控制软件</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexControl 3.8</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexImaging 5.0</td><td></td></tr><tr><td>分子组织学软件</td><td>SCiLS, Bremen, Germany</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>SCiLS, Bremen, Germany</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>芥子酸（Sinapinic acid, SA）</td><td>Nacalai tesque</td><td>30494-91</td><td></td></tr><tr><td>α-氰基-4-羟基肉桂酸（Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid, CHCA）</td><td>Wako</td><td>037-19261</td><td></td></tr><tr><td>校准标准品</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠IgG抗体</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗兔IgG抗体</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亲和素与生物素化辣根过氧化物酶复合物</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kit</td><td></td></tr><tr><td>3,3-二氨基联苯胺（3,3-diaminobenzidine, DAB）</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kit</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基质辅助激光解吸/电离成像质谱法可视化人脑中的淀粉样蛋白β沉积

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

阿尔茨海默病（AD）的神经病理学特征是淀粉样β（Aβ）肽在脑组织中积聚并聚集形成细胞外斑块。这些由40个氨基酸组成的Aβ肽是由淀粉样前体蛋白（APP）经β-和γ-分泌酶切割产生。Aβ不仅沉积于脑实质中，还沉积于软脑膜和脑血管壁，后者被称为脑淀粉样血管病（CAA）。尽管已鉴定出多种Aβ肽，但在AD和CAA病理组织中各种Aβ肽的生成机制及其分布模式尚未完全阐明。本文建立了一种基于基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）的人类尸检脑组织蛋白图谱分析方案。为此，人脑皮层样本取自东京都老年医学研究所脑库。将冷冻切片切割后转移至氧化铟锡（ITO）涂层玻璃载片上。使用MALDI系统采集质谱数据，空间分辨率可达20 µm。通过自动或手动喷雾装置将芥子酸（SA）均匀喷涂于载片表面。得益于当前MALDI-IMS技术的优势，可在无需特异性探针的情况下，获得同一人脑尸检切片中多种Aβ肽的完整数据集。此外，对AD脑组织及重度CAA样本进行高分辨率（20 µm）成像的结果清晰显示，Aβ1-36至Aβ1-41主要沉积于软脑膜血管，而Aβ1-42和Aβ1-43则主要沉积于脑实质中形成老年斑（SP）。结合临床、遗传学和病理学观察，采用MALDI-IMS作为标准方法，有助于深入理解AD、CAA及其他神经系统疾病的病理机制。

分析了伴有脑淀粉样血管病（CAA）的散发性阿尔茨海默病患者（n = 5；平均年龄 = 83.2 岁）以及老年无老年斑（SP O）但伴有 CAA 的受试者（n = 5；平均年龄 = 77.2 岁）（表 1）。在本研究中，患者 #3 的 CAA 表型最为显著。通过基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）对患者 #3 脑组织中 Aβ1-40 和 Aβ1-42 沉积物的分布进行了可视化（图 1）。如图 1所示，在非病理对照脑组织（患者 #9 和 #10）中未检测到显著信号。MALDI-IMS 清晰显示，Aβ1-42 优先沉积于脑实质中形成老年斑（SPs）。相比之下，较短的 Aβ 片段（如 Aβ1-36 至 Aβ1-41）则优先沉积于软脑膜血管区域（图 1）。
使用组织的相邻冷冻切片，通过免疫组化（IHC）进一步验证了Aβ40和Aβ42的分布。抗Aβ40抗体标记了脑血管淀粉样变性（CAA）（图2B中的箭头），这与Aβ42在脑实质中以斑块（SPs）形式分布的情况形成明显对比。对于Aβ1-41，我们是首次在人类脑组织中检测到该片段的研究者，并已开发出特异性抗体，能够将Aβ41与Aβ40和Aβ42区分开来21。
MALDI-IMS 的空间分辨率通常是需要改进的最重要因素。图1 和 图2 展示了分辨率为 100 µm 间距的 MALDI-IMS，可获得相对较大区域的整体分布轮廓21。然而，要精确定义蛛网膜下腔（包括血管结构）中的淀粉样蛋白沉积仍存在困难。为了描绘蛛网膜血管的精细组织结构以及皮层表面的细节，进行了高分辨率 MALDI 成像（40 µm：图3；20 µm：图4 和 图5）。结果表明，MALDI-IMS 清晰地显示了较短的 Aβ 肽段（如 Aβ1-36 至 1-41）分布在动脉壁中，这与免疫组化（IHC）结果相当。
基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI-IMS）展示了在伴有中度脑淀粉样血管病（CAA）的阿尔茨海默病（AD）脑组织中 Aβx-40 和 Aβx-42（x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 和 11pE）的详细分布情况。例如，Aβx-40 亚型的分布模式与 Aβ1-40 相似，而 Aβx-42 亚型的分布模式则与 Aβ1-42 不同。21根据当前方案，通过MALDI-IMS观察到的单个Aβ肽的单离子图像被指认为特定的Aβ亚型。相比之下，所获得的图像数据可采用无监督的多变量统计方法进行分析，以实现对解剖学感兴趣区域的图像分割，进而对未定义的蛋白质进行进一步分析。 图5 显示了对3号患者同一组织切片应用二分k均值分析获得的分割图21。该聚类方法成功识别出实质中的斑块样结构（蓝色） 图5C) 以及蛛网膜下腔中的血管结构（绿色表示 图5C）。有趣的是，在实质中发现一个小的圆形区域，该区域位于实质内一条小动脉周围，同时也位于蛛网膜下腔（紫色） 图5C）。这通过这些单个Aβ肽的单离子成像得到验证 图 5D-5F.
<img alt="脑组织切片中淀粉样蛋白β（Aβ）肽定位的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：阿尔茨海默病/脑淀粉样血管病（AD/CAA）冰冻脑组织切片的基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALDI-IMS）分析。 左侧图显示伴有严重脑淀粉样血管病（CAA）的阿尔茨海默病患者（病例#3）脑组织中多种C端截短的Aβ肽分布情况，右侧图显示对照组患者（所有图像中右侧为病例#9，左侧为病例#10）的结果。在病例#3中，Aβ1-36至Aβ1-41主要沉积于软脑膜血管，而Aβ1-42和Aβ1-43则在脑实质中形成老年斑；而在对照组患者（病例#9和#10）脑组织中未检测到信号。分辨率 = 100 μm。比例尺 = 5 mm。本图经Kakuda等21许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="淀粉样蛋白沉积的荧光显微镜观察；活检分析中的免疫组织化学结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：阿尔茨海默病/CAA 脑组织冰冻切片的 MALDI-IMS 分析，以及阿尔茨海默病脑组织枕叶皮层相邻切片的分析。 （A - C）阿尔茨海默病/CAA 脑组织冰冻切片，以及（D 和 E）阿尔茨海默病脑组织枕叶皮层的相邻切片，采用针对 Aβ40（D： BA27）或 Aβ42（E：抗 Aβ42 多克隆抗体）的抗体进行免疫染色，并重点观察微动脉和脑实质。两项分析均表明，Aβ40 优先沉积于软脑膜血管（图 D 中箭头所示）以及蛛网膜下腔和脑实质中的微动脉，形成脑淀粉样血管病（CAA）。相比之下，Aβ42 主要沉积于老年斑（SPs）中。IMS 分析条件：分辨率为 100 μm。比例尺 = 5 mm（A、B 和 C）以及 500 μm（D 和 E）。本图经 Kakuda 等人许可修改自原文21。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光密度显微镜图像；示意图显示蛋白标志物 I-40/I-42；光谱分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：阿尔茨海默病/脑淀粉样血管病（AD/CAA）冰冻脑组织切片（患者#3）的基质辅助激光解吸电离成像质谱（MALD-IMS）分析，分辨率为40 µm。 在伴有重度脑淀粉样血管病（CAA）的阿尔茨海默病（AD）中，存在多种C端和N端截短及修饰形式的Aβ肽段。Aβ1-36至Aβ1-41主要沉积于软脑膜血管中，而Aβ1-42和Aβ1-43则作为老年斑沉积于脑实质中。比例尺 = 1 mm（A-B），2 mm（左上角）。分辨率 = 40 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示生物样品中红色和绿色荧光的显微镜图像；细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：阿尔茨海默病/CAA 患者冰冻脑组织切片（患者 #3）的 MALDI-IMS 分析，分辨率为 20 µm。 本图展示了伴有严重脑淀粉样血管病（CAA）的阿尔茨海默病（AD）患者（患者 #3）脑组织中多种C端和N端截短及修饰形式的Aβ肽。Aβ1-36 至 Aβ1-41 主要沉积于软脑膜血管中，而 Aβ1-42 和 Aβ1-43 则主要在脑实质中以老年斑形式沉积。比例尺 = 200 μm（a, b, c），1 mm（左上角）。分辨率 = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="实验光谱研究中的光谱分析结果，包含数据聚类图和热图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过 MALDI-IMS 对冷冻的阿尔茨海默病（AD）脑组织切片进行分析所获得的分割图，揭示了假定的老年斑、大的蛛网膜下腔血管结构以及小的实质小动脉。（A）基于 MALDI-IMS 数据的多变量图像分析所获得的分割图。（B）基于二分 k 均值的聚类分析在枕叶皮层中识别出类似斑块和类似血管的结构。聚类及其亚结构和它们之间的关系以节点形式显示（例如，1-0-0）。（C）不同 Aβ 肽的定位模式，分别呈现出类似斑块（蓝色）、蛛网膜下腔血管（绿色）和小动脉（红色）的结构。注意，一些红色聚类也分布在蛛网膜下腔中。这一点通过这些单个 Aβ 肽在 20 µm 分辨率下的单离子图像得到验证：（D）Aβ 1-40，（E）Aβ 1-41，和（F）Aβ 1-42。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>病例</td>
			<td>性别</td>
			<td>死亡年龄</td>
			<td>Braak SP</td>
			<td>CAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>M</td>
			<td>88</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>C</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>M</td>
			<td>70</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>M</td>
			<td>73</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>M</td>
			<td>81</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：伴有CAA的AD病例及老年SP O期受试者的临床与病理数据。 用于成像质谱（IMS）和免疫组织化学（IHC）的人类皮质标本取自东京都老年学研究所脑库。每个脑标本均来自5名阿尔茨海默病（AD）患者和5名年龄匹配的对照个体的枕叶皮质。Aβ单克隆抗体染色所显示的淀粉样蛋白沉积程度根据Braak SP（淀粉样蛋白）分期进行定义。O期时，整个异型皮质几乎无老年斑；C期时，几乎所有异型皮质区域均受累。AD脑组织均处于C期。本表格经Kakuda等人21许可修改。

基于基质辅助激光解吸/电离成像质谱技术（MALDI-IMS）的分子成像可实现对生物样本中多种分析物的同步定位。本文介绍了一种利用MALDI-IMS检测和可视化阿尔茨海默病及脑淀粉样血管病样本脑组织中β淀粉样蛋白的实验方案。

阿尔茨海默病（AD）的神经病理学特征表现为淀粉样蛋白 β（Aβ）肽的积累和聚集形成……

本文的主要贡献在于，我们利用基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI成像质谱），对阿尔茨海默病脑组织中β-淀粉样蛋白病理的精细空间分布特征进行了深入探索。通过在组织切片中引入甲酸预处理的特殊实验方案，我们在技术上实现了进步。在完成MALDI-IMS分析后，生成了分割图谱，并进行了相关计算，以发现与淀粉样斑块及软脑膜血管系统共定位的新型标志蛋白或多肽。从死后8小时内切除、处理并储存在-80摄氏度的人脑中获取用于成像质谱（IMS）的人类皮质标本。采集阿尔茨海默病（AD）患者及年龄匹配的对照组枕叶皮质的脑组织标本。在冷冻切片机上切片前，首先将导电的氧化铟锡（ITO）涂层显微镜载玻片放入冷冻切片机内。将解剖脑组织样本从零下80摄氏度升温至零下22摄氏度，置于冷冻切片机内。每次实验均需安装新的 disposable 刀片，并始终尽量使用刀片的洁净部分。将冷冻的尸检脑组织与少量最佳切割温度包埋剂一同置于切片台上。用于质谱成像和免疫组织化学时，从每个组织样本中切下5至6张切片。当刀片刚开始切割组织时，转动轮子并调整组织块方向，直至整个组织表面完全暴露。如果切片上出现微小的条痕或撕裂，请在冷冻切片机中等待，直至温度调整自动修复。在打开防卷板前，先数几秒钟，并在下方放置一张纸巾。立即将组织切片转移到载玻片的ITO涂层一侧。通过将手指放在载玻片非ITO涂层一侧的下方来解冻组织切片。组织将黏附在载玻片上。确保组织尽可能平整，无皱褶。为清洗组织切片，将样品浸入盛有40至100毫升70%乙醇的玻璃染色缸中30秒，以去除内源性脂质和无机盐。按照文本方案中列出的洗涤顺序清洗样品。然后，在真空条件下干燥样品30分钟。现在，使用甲酸蒸气处理组织切片，以促进从尸检脑组织中更有效地电离淀粉样蛋白β。具体操作如下：将烘箱预热至60摄氏度，并准备一个含有5毫升100%甲酸的孵育玻璃皿。保持孵育玻璃皿内的空气湿度处于饱和状态。将组织切片放入孵育玻璃皿中，避免浸入甲酸，处理六分钟。使用胶片扫描仪、凝胶扫描仪或数字显微镜对样品拍摄光学图像。此步骤在室温下进行。当样本靶标置于仪器内部时，需要对样本的光学图像进行对齐。通常情况下，无法识别基质层下方的组织切片。为了将光学图像与样本对应起来，需制作导向标记，使其在光学图像中以及基质层下方的相机光学系统中均可见。最简单的方法是在拍摄光学图像之前，先在样品周围标记至少三个修正液点。使用超声波喷雾器喷涂基质时，需将待喷涂的组织从干燥器中取出并放入喷雾室中。确保组织未覆盖传感器窗口。通过按下“开始”按钮启动制备过程。通常，制备时间约为90分钟。制备过程将通过监测基质层的厚度和湿润度自动调节。或者，使用自动喷涂仪将基质溶液喷洒在组织表面时，可采用设定为10 psi和每分钟0.15毫升的溶剂泵系统输送基质溶液。基质溶液喷雾的同时将共同输送恒定流量的加热鞘气。利用MALDI-IMS进行高通量、高空间分辨率的成像实验。进行质谱检测时，使用 MALDI 控制软件和数据分析软件定义组织区域。以正离子线性模式采集谱图，质荷比范围为 2,000 至 20,000，空间分辨率为 20 和 100 微米。制备校准标准品时，将肽段校准标准品和蛋白质校准标准品按 1:4 的比例溶于 CHCA 和 TA30 溶液中，然后稀释 10 倍。在载玻片的四个不同位置各放置一微升校准标准品。使用分子组织学软件，叠加多个信号图像以分析不同信号的空间相关性，例如不同淀粉样蛋白β肽在老年斑和动脉壁中的共定位情况。在本研究中，3号患者的脑淀粉样血管病（CAA）表型最为显著。该患者脑组织的MALDI-IMS清晰地显示，淀粉样蛋白β 1-42和淀粉样蛋白β 1-43优先沉积于脑实质中的老年斑内。相比之下，较短的淀粉样蛋白β（如淀粉样蛋白β 1-36至1-41）则优先沉积于软脑膜血管区域。在非病理学对照中未检测到显著信号。使用组织的相邻冷冻切片通过免疫组织化学进一步验证了淀粉样蛋白β 1-40和淀粉样蛋白β 1-42的分布。抗淀粉样蛋白β 1-40抗体标记了脑淀粉样血管病（CAA），并显示淀粉样蛋白β 1-40优先沉积在软脑膜血管中，这与淀粉样蛋白β 1-42在脑实质中以老年斑形式分布形成明显对比。此处显示的是对3号患者同一组织切片进行二分k均值分析所获得的分割图。该聚类方法成功识别出脑实质中的斑块样结构以及蛛网膜下腔中的血管结构。值得注意的是，在脑实质中发现了一个小的环形区域，该区域恰好位于脑实质内一条小动脉周围，同时也存在于蛛网膜下腔中。这一点通过这些单个淀粉样β肽的单离子成像得到了验证。即使使用特异性抗体，同时追踪多种淀粉样蛋白β的范围仍然存在局限性。在此，我们采用前沿的基质辅助激光解吸电离成像质谱技术，展示了淀粉样蛋白β在人脑中的分布情况。我们相信，这项研究将为阿尔茨海默病研究带来突破，因为本报告首次对人死后脑组织中完整的淀粉样蛋白β蛋白谱系进行了表征。最令人印象深刻的发现是，仅在淀粉样蛋白β的C末端发生单个氨基酸改变，即可使其分布产生显著变化。组织制备步骤对于实现人脑组织中聚集蛋白的有效电离至关重要。分析物与基质的均匀共结晶对于实现高灵敏度且无伪影的成像至关重要。

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