膜分馏和 gtpase-关联免疫吸附法检测小 gtpase 预基化和 gtp 结合

小 Rho GTPase 是具有多种细胞功能的超级家庭蛋白质。例如，这些蛋白质参与调节细胞命运、细胞对压力的反应、细胞活力和细胞周期。小罗GTPase蛋白的活性由翻译后修饰调节。

这些修改涉及严格监管其活动。例如，蛋白质预位和GTP键是这些蛋白质最重要的翻译后修饰。我的实验室最近修改并开发了简单的方法来研究这些超家庭蛋白质的翻译后修饰。

为此，我们使用了251个胶质母细胞瘤细胞系，并针对它们使用辛伐他汀，并测量了这些蛋白质的转化后修饰。该方法涉及亚细胞分馏和GTP结合蛋白到这种蛋白质超家庭。为此，我们使用RhoA的本地化，GTP绑定到RhoA来测量这种蛋白质的翻译后修饰。

从37度培养箱中取出细胞。观察显微镜下的细胞以确认汇合。细胞应处于70%至80%的汇合点。

用冷 PBS 清洗细胞一次。加入5毫升EDTA，将细胞放回37度培养箱5分钟。孵育5分钟后，将EDTA与细胞收集到15密耳管中。

将管子放在冰盒中，然后进入离心机。将离心机设置为 1500g，温度为 4 度，然后旋转电池 5 分钟。旋转后，取出超生，并添加一毫升冷PBS。

很好地缝合细胞。将细胞混合物转移到新的标签 1.5 毫升管中。转移后，继续离心机。

将离心机设置为 4 度 1500g，然后旋转 5 分钟。检查颗粒大小。将样品放在冰上。

完全丢弃超生，而不干扰颗粒。添加缓冲区一。通过上下移液，混合良好。

继续声波化。将声波器设置为五个周期，每个周期五秒钟，并重复三次。声波应继续在冰上进行，但视频中未显示，以说明性目的。

继续进入超中心。使用超离心器将细胞同质质分离成细胞质和膜分数。将离心机设置为 10 万克，35 分钟，温度为 4 度。

检查颗粒大小。分离超生。完全收集超糖，小心不要打扰颗粒。

超生是细胞酸分。将超带放在新标记的管子中。将缓冲液二添加到颗粒中。

这是膜分数。通过上下移液，混合良好。继续蛋白质测定和西印样品制备。

使用 15% 凝胶将样品加载到 SDS-PAGE 上。通过可视化分子量标记或使用庞塞奥污渍来确认蛋白质转移。添加用于免疫印迹分析的原抗体。

我们使用 Rac1/2/3、Cdc42 和 RhoA。把培养板带出孵化器。观察显微镜下的细胞以确认汇合。

细胞应为70至80%的汇合。将培养板放在冰上。吸气介质，用冰冷的 PBS pHd 洗涤细胞至 7.2。

吸气 PBS 。将板倾斜在冰上多一分钟，以清除 PBS 的所有残留物。残留PBS对检测产生负面影响。

将细胞酶在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的适当体积的冰冷解液缓冲液中。收获细胞与细胞刮刀一起回味。倾斜此技术的培养板。

将酸盐转移到有标签的冰冷低温管中，并留在冰上。使用涡流彻底混合。保持10微升的利沙酸盐进行蛋白质测定。

捕捉冻结液体氮中剩余的细胞。。将捕捉冷冻冷冻管转移到负 80 冰柜。存储这些示例。

请注意，样品的存储时间不应超过 14 天。通过重复步骤一到八，一个一个，准备细胞从其他培养板中切化。快速工作，切从不将样品留在冰上超过 10 分钟。

切切切切切切测量蛋白质浓度。计算解液缓冲液的体积，使样品之间的蛋白质浓度正常化。

注意:每毫升一毫克通常是最好的，但是，0.3至2毫克每毫升可以检测到。通过将 60 微升的解解缓冲液和 60 微升的绑定缓冲液添加到微管来准备空白控制。通过添加12微升的Rhho控制蛋白、48微升的解解缓冲液和60微升的结合缓冲液来准备一个积极的控制。

把罗亲和力板从袋子里拿出来放在冰上。用100微升冰冷蒸馏水将粉末溶解在井中。把盘子放在冰上。

将冷冻细胞在25摄氏度的水浴中解冻。将计算的冰冷解解缓冲液添加到每个样品中，使蛋白质浓度正常化。将60微升的规范化冰冷样品转移到微管中，并添加60微升的结合缓冲液。

彻底混合，并留在冰上。通过大力轻拂将水从微孔板中完全去除，然后在实验室垫上用五到七个硬水龙头。向重复的井中添加 50 微升的规范化样品、空白控件和正控。

将板放在轨道摇床上，在4摄氏度下放置30分钟。注意:摇床的速度应设置为 300 rpm。通过轻拂清除板中的样品，用 200 微升室温洗涤缓冲液洗涤两次。

每次洗涤后，通过轻拂，然后轻敲，从井中大力取出洗涤缓冲液，并在室温下将盘子放在长凳上。在每个井中加入200微升室温抗原缓冲液，在室温下孵育两分钟。从井中轻拂溶液，用200微升的室温洗涤缓冲液洗涤三次。

在每个井中加入50微升新鲜准备的1至250个抗RHO原抗体。在转速为 300 rpm 时将板放在轨道摇床上 45 分钟，设定为 25 摄氏度。从井中轻拂溶液，在室温下用200微升洗涤缓冲液洗涤三次。

在每个井中加入50微升新鲜准备的1至250个抗RHOA二级抗体。将板放在轨道摇床顶部 45 分钟，转速为 300 rpm，设定为 25 摄氏度。通过混合同等体积的试剂 A 和试剂 B.从每一个井中找出溶液，用 200 微升室温洗涤缓冲液洗涤三次，准备 HRP 检测试剂。

在每个井中加入 50 微升新鲜准备的 HRP 检测试剂。在三到五分钟内读取发光信号，以获得最大信号。使用适当的软件包分析结果。

结果表明，辛伐他汀降低了RhhoA在膜分数中的定位。增加的是细胞分量的积累。有趣的是， 辛伐他汀增加了 Gtp 绑定到 Rhoa. 为什么？

我们预计辛伐他汀会减少这种活性。重要的是，他们测量这种蛋白质的亚细胞定位，并测量GTP结合这种蛋白质，有一个最终评估的小Rho GTPases的活性。