Name: 膜分馏和 gtpase-关联免疫吸附法检测小 gtpase 预基化和 gtp 结合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 了解膜分馏和GTP酶关联免疫吸附法检测小GTP酶预基化与GTP结合的技术。该方法适用于研究Rho GTP酶翻译后修饰机制，为细胞生物学和神经科学研究提供可靠工具。

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Saeid Ghavami 获得了健康科学中心运营拨款、CHRIM 运营拨款以及曼尼托巴研究会新研究者运营拨款的支持。Javad Alizadeh 获得了曼尼托巴研究会研究生奖学金的支持。Shahla Shojaei 获得了健康科学基金会运营拨款以及 MITACS 加速博士后奖学金的支持。Adel Rezaei Moghadam 获得了由 Joseph W. Gordon 持有的加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）运营拨款的支持。Amir A. Zeki 获得了美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所 K08 奖项（1K08HL114882-01A1）的支持。Marek J. Los 感谢 LE STUDIUM 高等研究所（法国中央-卢瓦尔河谷大区）通过其智能卢瓦尔河谷综合计划提供的支持，该计划同时获得玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划资助（项目编号 #665790）。Simone da Silva Rosa 获得了 UMGF 研究生奖学金的支持。

1. 使用膜/胞质分级分离法确定 RhoA 的定位
<ol>
	<li>细胞培养与辛伐他汀处理
	<ol>
		<li>在100 mm培养皿中接种50,000个U251细胞，并在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（高糖，10%胎牛血清[FBS]）中培养。</li>
		<li>当细胞汇合度达到30%时，移除培养基，加入含辛伐他汀的培养基（10 µM辛伐他汀溶于二甲基亚砜[DMSO]中），在37 °C下孵育36小时8仅使用DMSO作为溶剂对照。 
		注意：细胞质和细胞膜组分分离需要 1000 万细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞收集
	<ol>
		<li>从37 °C培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确认细胞汇合度。 
		注意：细胞汇合度应为 70% - 80%。</li>
		<li>吸弃培养基，用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞1次。加入5 mL乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（KCl：400 mg/L，NaCl：6800 mg/L，NaHCO₃：2200 mg/L，NaH2PO4.2O₂：140 mg/L，D-葡萄糖：1,000 mg，EDTA 二钠：373 mg/L）每平板，并将细胞放回37 °C培养箱中孵育5 min。</li>
		<li>孵育5分钟后，将含有细胞的EDTA收集到一个15 mL离心管中，该离心管中含有与EDTA等量的培养基。 
		注意：管中的培养基可中和EDTA，防止对细胞膜的进一步消化。</li>
		<li>将试管放入冰盒中，然后立即进行离心。</li>
		<li>将离心机设置为 1,500 x g 在 4 °C 下离心细胞 5 分钟。</li>
		<li>移除上清液，注意不要扰动沉淀，加入1 mL冷的PBS。充分混匀细胞。</li>
		<li>将细胞混合液（溶液）转移至新的1.5 mL离心管中，于1,500 x g 在 4 °C 下离心细胞 5 分钟。</li>
		<li>检查沉淀物大小（以估算下一步所需缓冲液体积）。将样品置于冰上。彻底弃去上清液，注意不要扰动沉淀物。</li>
		<li>加入预冷的缓冲液 I（10 mM Tris-HCl [pH 7.5]，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA，1 mM 二硫苏糖醇，以及蛋白酶抑制剂混合物），用移液器上下吹打充分混匀样品，随后进行超声处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声处理
	<ol>
		<li>将超声波破碎仪设置为5个循环，每个循环5秒，重复3次。</li>
		<li>在冰上进行超声处理。随后进行超速离心。 
		注意：冰和低温条件可保护蛋白质，使实验结果更加可靠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超速离心
	<ol>
		<li>使用超速离心机将细胞匀浆分离为胞质和膜组分。将离心机转速设定为 100,000 x g 4 °C 下孵育 35 分钟。如图所示 图1，检查沉淀物的大小。 
		注意：膜组分位于管底最下方，其余为其他细胞质组分。</li>
		<li>小心操作，完全收集上清液，避免扰动沉淀。上清液即为胞质组分。将上清液转移至新标记的离心管中。</li>
		<li>向沉淀物（含有膜组分）中加入 300 µL 裂解缓冲液（缓冲液 II）（50 mM Tris-HCl [pH 7.5]、0.15 M NaCl、1 mM 二硫苏糖醇、1% SDS、1 mM EDTA、1 mM EGTA 及蛋白酶抑制剂混合物）。用移液器反复吹打充分混匀。</li>
		<li>进行蛋白质定量及蛋白质印迹（免疫印迹分析）样品制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫印迹法
	<ol>
		<li>在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、0.5 mM PMSF、0.5% Non-ionic detergent-40、100 µM β-甘油磷酸、0.5% 蛋白酶抑制剂混合物）中制备分离组分的细胞蛋白提取物。</li>
		<li>使用Lowry法测定蛋白质浓度8 并计算裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、0.5 mM PMSF、0.5% 非变性去垢剂octylphenoxypolyethoxyethanol、100 µM β-甘油磷酸、0.5% 蛋白酶抑制剂混合物）的体积，以使各样本间的蛋白质浓度保持一致。</li>
		<li>将样品在 90 °C 加热 5 分钟，取 15–20 µL 加样至 15% SDS-PAGE 凝胶中以分离蛋白质。 
		注意：每个样品上样量为 1 µg 蛋白质。根据此量计算所需上样的体积。</li>
		<li>在还原条件下（500 nM 甘氨酸、50 mM Tris-HCl 和 20% 甲醇），于室温（RT）以 100 V 电压将分离的蛋白质转移至尼龙膜上，持续 2 小时。 
		注意：为确认蛋白质转膜成功，可使用丽春红染色或在膜上观察蛋白质分子量标记。</li>
		<li>用含5%脱脂奶粉和1×含0.01%非离子去垢剂的Tris缓冲盐水（TBS/0.01%非离子去垢剂；TBST）在4 °C封闭过夜或室温封闭1小时，以阻断非特异性抗体结合。</li>
		<li>加入一抗进行免疫印迹分析，4 °C 下孵育过夜。 
		注意：本实验中，Rac1/2/3、cdc42、RhoA、GAPDH 和 pan-Cadherin 均以 1:1,000 的比例溶于含 1% 脱脂奶粉的 1×TBST 中。分别使用 pan-Cadherin 和 GAPDH 确认膜组分和胞质组分的纯度。</li>
		<li>用1×TBST洗涤缓冲液洗涤膜3次，每次20分钟。</li>
		<li>用与相应一抗匹配的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔二抗室温孵育膜1小时。</li>
		<li>用增强型化学发光（ECL）检测法显影，每次20分钟，共洗涤3次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用小G蛋白激活检测试剂盒测定RhoA GTP负载量
<ol>
	<li>计数至10,000个细胞/mL，将U251细胞接种于100 mm培养皿中培养。</li>
	<li>当细胞汇合度达到30%时，按照步骤1.1.2所述用辛伐他汀处理细胞。</li>
	<li>将培养皿从培养箱中取出，在显微镜下观察细胞以确认汇合度。确保细胞汇合度为70%–80%。将培养皿置于冰上，吸除培养基，用预冷的PBS（pH 7.2）洗涤细胞3次。</li>
	<li>吸除 PBS。将培养皿倾斜置于冰上额外 1 分钟，以彻底去除残留的 PBS。 
	注意：残留的 PBS 会对本实验产生不利影响。</li>
	<li>在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的700 µL冰浴裂解缓冲液中裂解细胞。 
	注意：700 µL 通常足以用于一个 100 mm 的培养皿。参见 表1 以确定每种培养容器的合适体积。</li>
	<li>使用细胞刮刀收集细胞裂解液。采用此技术时，将培养板倾斜。</li>
	<li>将裂解液转移至预冷并标记好的冻存管中，并置于冰上保存。</li>
	<li>使用涡旋振荡器充分混匀。取10 µL裂解液用于蛋白定量分析，以测定样品中的蛋白浓度。</li>
	<li>将剩余的细胞裂解液在液氮中速冻。 
	注意：在速冻细胞裂解液之前，应预先分装成多个 aliquot，以避免反复冻融，防止 RhoA GTPase 活性丧失。</li>
	<li>将速冻的冻存管转移至 -80 °C 超低温冰箱中，用于储存GTP酶联免疫吸附测定样品。 
	注意：样本存放时间不得超过14天。操作应迅速，样本置于冰上不得超过10分钟。切勿同时处理所有培养皿。</li>
	<li>使用Lowry法测定蛋白质浓度8 并计算裂解缓冲液体积，以使各样品间的蛋白质浓度归一化。 
	注意：最佳浓度通常为 1 mg/mL；然而，0.3 - 2 mg/mL 也可被检测到。</li>
	<li>通过向微量离心管中加入60 µL裂解缓冲液和60 µL结合缓冲液，制备空白对照。 
	注意：空白对照包含除抗原外的所有试剂，用于扣除背景值。</li>
	<li>通过加入12 µL Rho对照蛋白、48 µL裂解缓冲液和60 µL结合缓冲液，制备阳性对照。 
	注意：阳性对照包含所有试剂以及经证实的 Rho-A-GTP 抗原。</li>
	<li>将Rho亲和板从袋中取出并置于冰上。</li>
	<li>将粉末溶于含有100 µL冰冻蒸馏水的孔中。将酶标板置于冰上。</li>
	<li>在设定为 25 °C 的水浴中解冻速冻的细胞裂解物。</li>
	<li>将计算好的冰冻裂解缓冲液体积（来自步骤2.11）加入各样品中，以标准化蛋白浓度。 
	注意：洗涤细胞后（使用真空管吸液器）移除 PBS，以避免影响裂解缓冲液的成分。在 GTPase 活化检测中，为确保样本间的准确比较，应将样本蛋白浓度调整至 0.8–2 mg/mL。 表 2 提供本实验所用缓冲液的详细信息。</li>
	<li>将60 µL经标准化的冰冻样品转移至微量离心管中，加入60 µL结合缓冲液；充分混匀样品，并置于冰上保存。</li>
	<li>用力甩动微孔板以彻底去除其中的水/溶液，随后在实验台垫上用力敲击五至七次。</li>
	<li>将50 µL的标准化样品、空白对照和阳性对照分别以复孔加入各孔中。</li>
	<li>将培养板置于4 °C、300 rpm的摇床中振荡30分钟。 
	注意：振荡步骤非常重要，建议使用300 rpm的轨道式平板摇床。</li>
	<li>轻弹洗去板中的样品，于室温下用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤 2 次。每次洗涤后，通过轻弹并随后轻拍的方式彻底去除孔中的洗涤缓冲液，将酶标板置于室温台面上。</li>
	<li>每孔加入 200 µL 室温抗原呈递缓冲液，室温孵育 2 分钟。</li>
	<li>轻弹去除孔中溶液，于室温用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤孔 3 次。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 新鲜配制的 1/250 稀释抗 RhoA 一抗。</li>
	<li>将培养板置于摇床上，25 °C、300 rpm 振荡孵育45分钟。轻弹移除孔中溶液。</li>
	<li>重复洗涤步骤2次（步骤2.24）。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 新鲜配制的 1/250 稀释抗 RhoA 二抗。</li>
	<li>将培养板置于摇床中，25 °C、300 rpm 条件下振荡孵育45分钟。</li>
	<li>通过等体积混合试剂A和试剂B来配制HRP检测试剂。</li>
	<li>轻弹去除每孔中的溶液，于室温下用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤各孔 3 次。</li>
	<li>每孔加入 50 µL 新鲜配制的 HRP 检测试剂。</li>
	<li>在3至5分钟内读取发光信号以获得最大信号，并使用适当的软件包分析结果。 
	注意：必须在3 - 5分钟内读取数据，以获得最大信号。运行一个 &#34;测试板&#34; 以确认用于细胞裂解液的裂解缓冲液体积适当，使蛋白浓度足以检测RhoA GTPase活性。（测试板是指用于确定蛋白浓度是否处于可接受范围，以及所用裂解缓冲液体积是否合适的细胞培养板。）若处于线性范围内，阳性对照的读数应比空白孔高出4至10倍。若不符合此范围，则应参照制造商说明调整化学发光仪。化学发光仪的设置参数如下 表3.</li>
	<li>在标题为“输入原始数据”的列中输入原始数据 样本, 平均值, 标准差, rep1, rep2, rep3，以及 rep4，用于显示每个样本进行的重复次数。</li>
	<li>下 平均值，输入公式 =average(Xn:Yn) 其中，X = 列标识符 rep1，Y = 列标识符 rep4，其中 n 为当前正在处理的行的行标识符。</li>
	<li>下 标准差，输入公式 =stdev (Xn:Yn) 其中 X = 列标识符 rep1，Y = 列标识符 rep4，其中 n 为当前正在处理的行的行标识符。</li>
	<li>将重复实验数据输入 rep1, rep2, 等等。</li>
	<li>输入数据后，使用单击并拖动的方法来选择 样本, 平均值，以及 标准差.</li>
	<li>然后，在数据分析软件中，选择用于制图的函数，该函数图标为一个内部带有微型柱状图的方块。 
	注意：这将启动图表制作流程，可根据输入的数据设计图表。</li>
	<li>选择 柱状图 以及，对于输入值，指定 平均值 数字。 
	注意：该图表的 平均值 数字首先被确定，然后， 标准差 y轴误差线的对应列已指定。操作方法为：双击图表中的柱状条，选择 Y轴误差 标签，点击 自定义 选项，并在工作表中选择区域以输入位置信息 标准差 数据。在生成所需的图表后，可以观察到需要比较的各组之间的差异。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种精确测定小GTP酶法呢基化和GTP结合的方法，通过检测小GTP酶的亚细胞定位（膜相versus胞质）以及Rho GTP的负载状态来实现。小GTP酶在真核细胞中表达，在细胞增殖、运动性和结构维持中发挥关键作用。法呢基化和GTP结合均参与调控GTP酶的活性，因此，评估这些蛋白法呢基化和GTP结合状态的实验方法是细胞生物学家的重要工具1,8。
根据最近一项研究的结果，Rho 蛋白的 GTP 负载具有细胞类型特异性8，因此在不同细胞类型之间存在差异。此外，Rho 蛋白的亚细胞定位及其法呢基化（GGT）是调控其功能的关键步骤。这一过程还受到主要 GTP 酶的效应蛋白 GEF、GAP 和 GDI 相互作用的进一步调控。
已知辛伐他汀可增加THP-1单核细胞中Rac GTP的负载，能在淀粉样蛋白β刺激存在的情况下降低Rac的异戊二烯化修饰，并减轻...

Rho GTPases 是一组小分子蛋白质（21 - 25 kDa），在进化过程中高度保守，属于 Ras 超家族小 GTPases 中的一个独特亚家族。该超家族的每个亚家族均含有一个共同的 G 结构域核心，参与 GTPase 活性及核苷酸交换。1Rho 家族与其他 Ras 亚家族的区别在于其存在一个 &#34;Rho 插入区&#34; 在5以内th β片层和4th 小GTP酶结构域中的α螺旋2.
根据最新的分类，Rho GTPases 被认为是一类属于 Ras GTPase 超家族的信号传导蛋白3哺乳动物Rho GTP酶根据其特定功能和总体特征共有22个成员4 其中RhoA、Rac1和Cdc42是该家族中研究最为广泛的成员。Rho GTP酶与细胞内信号转导通路相关联 通过 一种依赖于分子开关的严格调控机制 通过 蛋白质翻译后修饰5.
GTP结合与水解是小Rho GTP酶激活/失活循环中的关键机制，并受到调控 通过 GTP酶激活蛋白（GAPs）。GAPs负责GTP的水解反应，并与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）协同作用，后者介导GTP的加载反应。Rho GDP解离抑制因子（GDIs）对小Rho GTP酶提供进一步的调控作用。 通过 与GDP结合的Rho GTPases结合，从而抑制GDP解离，并促进将小型Rho GTPases从活性细胞内膜位点隔离。此外，GDI的异戊二烯化对Rho GTPase蛋白具有进一步调控作用，可调节核苷酸的水解与交换，并控制GDP/GTP循环。1,6,7,8.
GTP结合和Rho GTP酶的异戊二烯化均通过改变这些蛋白质的亲脂性，参与Rho GTP酶在细胞质与细胞膜之间的转运1,9。上述调控因子可与细胞膜的磷脂以及其他调节GDP/GTP交换活性的蛋白相互作用10。此外，GDI（解离抑制因子）可同时抑制GTP水解和GDP/GTP交换。GDI抑制非活性Rho蛋白与GDP的解离，从而阻止其与下游效应分子的相互作用。GDI还调控GTP酶在细胞质与细胞膜之间的循环。Rho GTP酶的活性在很大程度上依赖于其向细胞膜的转位；因此，GDI被视为关键的调控因子，可通过遮蔽GTP酶的疏水区域/结构域将其隔离在细胞质中11,12。
Rho GTP酶在其激活周期的各个阶段实现最佳信号传导和功能，依赖于GTP结合与GTP水解的动态循环。该过程中的任何改变都可能导致Rho GTP酶所调控的细胞功能发生继发性变化，例如细胞极性、增殖、形态发生、胞质分裂、迁移、黏附以及存活13,14。
当前方案为读者提供了一种监测小分子RhoA GTP酶活化的详细方法 通过 对其异戊二烯化及GDP/GTP负载的检测。该方法也可用于检测多种小GTP酶的异戊二烯化和GTP结合情况。GTP酶联免疫吸附测定可用于测量其他类型GTP酶的活化水平，例如Rac1、Rac2、Rac3、H-Ras、K-Ras或N-Ras、Arf以及Rho15以辛伐他汀作为药理学试剂的示例，因其最近被报道参与调控小Rho GTP酶的异戊二烯化及其活性8,9,14,16.

<table><tbody><tr><td>DMEM 高糖</td><td>VWR (加拿大)</td><td>VWRL0101-0500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR (加拿大)</td><td>CA45001-106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>VWR (加拿大)</td><td>97062-806</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸）</td><td>VWR (加拿大)</td><td>CA71007-118</td><td></td></tr><tr><td>EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）</td><td>VWR (加拿大)</td><td>CAAAJ60767-AE</td><td></td></tr><tr><td>DTT（DL-二硫苏糖醇）</td><td>VWR (加拿大)</td><td>CA97061-340</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>VWR (加拿大)</td><td>CABDH9214-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-羟甲基氨基甲烷</td><td>VWR (加拿大)</td><td>CA71009-186</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/Bis 溶液</td><td>Biorad (加拿大)</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Biorad (加拿大)</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma/Aldrich (加拿大)</td><td>P8340-5ML</td><td>1:75 稀释</td></tr><tr><td>Rho-GTPase 抗体试剂盒</td><td>Cell Signaling (加拿大)</td><td>9968</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>泛钙黏蛋白抗体</td><td>Cell Signaling (加拿大)</td><td>4068</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology (美国)</td><td>sc-69778</td><td>1:3000 稀释</td></tr><tr><td>RhoA G-LISA 活化检测试剂盒（发光法）</td><td>Cytoskeleton Inc. (美国)</td><td>BK121</td><td>Cytoskeleton I. G-LISA 活化检测技术指南. 2016.</td></tr><tr><td>RhoA 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2117</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Amersham-Pharmacia Biotech</td><td>RPN2209</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG（全分子）过氧化物酶抗体</td><td>Sigma</td><td>A6154-1ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD5 多功能微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>1612071A</td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>11332473001</td><td>非变性去垢剂，辛基苯氧基聚乙氧基乙醇</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P5726-5ML</td><td>1:75 稀释</td></tr></tbody></table>

利用膜组分分离和gtp酶联免疫吸附测定法检测小gtp酶的异戊二烯化及gtp结合能力

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Rho GTP酶家族属于Ras超家族，在人类中包含约20个成员。Rho GTP酶在调控多种细胞功能中具有重要作用，包括细胞骨架动态、细胞运动、细胞极性、轴突导向、囊泡运输以及细胞周期调控。Rho GTP酶信号通路的改变在多种病理状态下发挥关键调控作用，例如&#160;癌症、中枢神经系统疾病以及免疫系统相关疾病。Rho GTP酶的翻译后修饰（即由甲羟戊酸途径中间产物介导的异戊二烯化）以及GTP结合是影响该蛋白活性的关键因素。本文提供了两种基本且简便的方法，用于检测广泛范围的Rho GTP酶异戊二烯化修饰和GTP结合活性。本文逐步详细阐述了所采用技术操作的具体步骤。

膜分级分离：
采用超速离心法对膜组分和胞质组分进行分离。如图1所示，上清液含有胞质组分，沉淀物含有膜组分。使用辛伐他汀处理U251细胞后，通过免疫印迹检测了胞质和膜组分中RhoA的丰度。膜组分和胞质组分的纯度及上样量控制分别通过pan-Cadherin和GAPDH进行验证。如图2所示，辛伐他汀处理减少了膜结合型RhoA GTP酶的含量，同时增加了其在胞质中的含量。该结果与他汀类药物通过抑制RhoA的异戊二烯化修饰而影响GTP酶转位的已知作用机制一致。辛伐他汀抑制RhoA GTP酶的异戊二烯化，因此未修饰的RhoA无法锚定于细胞质膜，导致其在胞质中浓度升高。
RhoA...

本文介绍了一种研究Rho GTP酶法呢基化及鸟苷-5'-三磷酸（GTP）负载的实验方案。该方案包含两种详细方法，即膜组分分离和GTP酶联免疫吸附测定。本方案可用于检测其他多种小GTP酶的法呢基化状态及GTP结合情况。

利用膜组分分离和GTP酶联免疫吸附测定法检测小GTP酶的异戊二烯化及GTP结合能力

Rho GTP酶家族属于Ras超家族，在人类中包含约20个成员。Rho GTP酶在调控……中具有重要作用。

小Rho GTP酶是一类具有多种细胞功能的超家族蛋白。例如，这些蛋白参与调控细胞命运、细胞对压力的响应、细胞运动性以及细胞周期。小Rho GTP酶蛋白的活性受翻译后修饰的调控。这些修饰参与对其活性的严格调控。例如，蛋白质预酰化和GTP结合是这类蛋白最重要的翻译后修饰。我实验室近期改进并建立了一种简单的方法，用于研究该蛋白超家族的翻译后修饰。为此，我们使用了251种胶质母细胞瘤细胞系，用辛伐他汀进行靶向处理，并检测了这些蛋白质的翻译后修饰。该方法包括亚细胞分级分离以及检测与该蛋白质超家族结合的GTP结合蛋白。为此，我们通过检测RhoA的定位及其与GTP的结合情况，来评估该蛋白的翻译后修饰水平。从37摄氏度的培养箱中取出细胞。在显微镜下观察细胞以确认汇合度。细胞汇合度应达到70%至80%。用预冷的PBS洗涤细胞一次。加入5 mL EDTA，将细胞放回37摄氏度培养箱中孵育5分钟。孵育5分钟后，将含细胞的EDTA收集至15 mL离心管中。将试管放入冰盒中，然后进行离心。将离心机设置为4°C、1500g，离心5分钟。离心结束后，弃去上清液，加入1毫升冷的PBS。充分吹打混匀细胞。将细胞混合液转移至一个新的已标记的1.5毫升离心管中。转移后，立即进行离心处理。将离心机设置为4°C、1500g，离心细胞5分钟。检查沉淀大小。将样品置于冰上。彻底弃去上清液，切勿扰动沉淀。加入缓冲液一，通过反复吹打充分混匀。进行超声处理。将超声仪设置为五个循环，每个循环5秒，重复三次。超声处理应在冰上进行，但为便于说明，视频中未展示此步骤。将样品转移至超速离心机。使用超速离心机将细胞匀浆分离为胞质和膜组分。设置离心机在4°C条件下以100,000 ×g离心35分钟。检查沉淀物的大小。分离上清液。完全收集上清液，注意不要扰动沉淀物。上清液为胞质组分。将上清液转移至新标记的离心管中。向沉淀中加入缓冲液二。此为膜组分。用移液器上下吹打充分混匀。随后进行蛋白质定量及Western blot样品制备。使用15%凝胶进行SDS-PAGE电泳上样。通过观察分子量标记物或使用Ponceau染色来确认蛋白质转膜效果。加入一抗进行免疫印迹分析。我们使用 Rac1/2/3、Cdc42 和 RhoA。将培养板从培养箱中取出，在显微镜下观察细胞以确认汇合度。细胞应达到70%至80%的融合度。将培养板置于冰上，吸除培养基，并用预冷至4 °C、pH值调至7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸除 PBS。将培养板在冰上倾斜放置额外 1 分钟，以彻底去除残留的 PBS。残留的 PBS 会对本实验产生不利影响。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的适量预冷裂解缓冲液中裂解细胞。用细胞刮收集细胞裂解液。进行此操作时，将培养板倾斜。将裂解液转移至预冷的、已标记的冻存管中，并置于冰上。使用涡旋振荡器充分混匀。保留10 µL裂解液用于蛋白质定量分析。将剩余的细胞裂解液在液氮中快速冷冻。将速冻后的冻存管转移至-80 °C冰箱中。保存这些样品。注意，样品保存时间不应超过14天。按照步骤一至八，逐一从其他培养板中制备细胞裂解液。操作需迅速，切勿将样品在冰上放置超过10分钟。切勿同时操作所有培养皿。测定蛋白质浓度。计算裂解缓冲液体积，以使各样品间的蛋白质浓度归一化。注意：通常每毫升一毫克为最佳浓度，但每毫升0.3至2毫克也可被检测到。通过向一个微量离心管中加入60微升裂解缓冲液和60微升结合缓冲液，制备空白对照。通过向一个微量离心管中加入12微升Rho对照蛋白、48微升裂解缓冲液和60微升结合缓冲液，制备阳性对照。将 Rho 亲和板从袋中取出并置于冰上。用 100 微升冰冻蒸馏水溶解各孔中的粉末。保持该板置于冰上。将速冻的细胞裂解液在25摄氏度的水浴中解冻。向每个样品中加入计算好的冰上预冷的裂解缓冲液体积，以标准化蛋白浓度。将60微升标准化的冰上预冷样品转移至微量离心管中，并加入60微升结合缓冲液。充分混匀后置于冰上。用力甩动微孔板以彻底去除孔中液体，随后在实验台垫上用力敲击5至7次。每孔加入50 µL标准化样品、空白对照和阳性对照，均设复孔。将培养板置于4°C的轨道摇床上震荡30分钟。注意：摇床速度应设置为300 rpm。通过轻弹去除板中的样品，并用200 µL室温洗涤缓冲液洗涤两次。每次洗涤后，通过轻弹并随后轻拍的方式彻底去除孔中的洗涤缓冲液，并将板置于室温下的实验台上。向每孔中加入200 µL室温抗原呈递缓冲液，在室温下孵育2分钟。将孔中的溶液轻弹弃去，再用200 µL室温洗涤缓冲液洗涤3次。向每个孔中加入 50 微升新鲜配制的 1:250 稀释的抗 RhoA 一抗。将酶标板置于摇床上，25 摄氏度、300 转/分钟孵育 45 分钟。弃去孔中溶液，用 200 微升洗涤缓冲液在室温下洗涤三次。向每个孔中加入 50 微升新鲜配制的 1:250 稀释的抗 RhoA 二抗。将板置于摇床上，25 摄氏度、300 转/分钟振荡孵育 45 分钟。通过混合等体积的试剂 A 和试剂 B 配制 HRP 检测试剂。弃去每孔中的溶液，用 200 微升室温洗涤缓冲液洗涤三次。每孔加入 50 µL 新鲜配制的 HRP 检测试剂。在 3 至 5 分钟内读取化学发光信号，以获得最大信号值。使用适当的软件分析结果。我们的结果表明，辛伐他汀减少了 RhoA 在膜组分中的定位，而增加了其在胞质组分中的积累。有趣的是，辛伐他汀增加了与 RhoA 结合的 GTP。为什么？我们预期辛伐他汀会降低该活性。他们必须同时检测该蛋白的亚细胞定位以及该蛋白的GTP结合能力，以对小Rho GTP酶的活性做出最终评估。

detection-small-gtpase-prenylation-gtp-binding-using-membrane

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

膜分馏和 gtpase-关联免疫吸附法检测小 gtpase 预基化和 gtp 结合

本文所述方法通过利用一种对激活态GEFs具有高亲和力的突变型RhoA...

利用GST标记的突变型Rho蛋白（GST-RhoA(G17A)）从上皮细胞裂解液中亲和沉淀活性Rho-GEFs

本视频展示了配体检测的差分径向毛细管作用——一种用于系统性高通量筛选细胞内核苷酸第二信使结合蛋白的技术。该技术可实现第二信使直接与细胞裂解液中过表达的目标蛋白结合，从而无需进行蛋白质纯化。...

配体差异径向毛细管作用分析：一种高通量筛选细菌核苷酸第二信使结合蛋白的细胞内靶标蛋白技术

本视频展示了一种用于研究GTP酶结合蛋白伙伴的竞争性结合实验。通过将结合了核苷酸的GTP酶蛋白固定在磁珠上，可研究两种相互作用的蛋白伙伴对GTP酶同一结合位点的竞争性结合，从而评估这些蛋白伙伴的结合亲和力。...

竞争结合实验研究竞争性GTP酶结合蛋白伙伴

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海马神经元培养物中蛋白质棕榈酰化检测的免疫沉淀与酰基-生物素交换（ABE）法

基于肽段的功能基序及其结合伴侣的鉴定

本文描述了一种用于鉴定膜蛋白在体（in...

膜蛋白-SPINE：一种用于鉴定膜蛋白蛋白质相互作用的生化工具 体内

该方案比较了Rho家族GTP酶（包括Rac1）与其结合伴侣之间的相对亲和力。体内，Rac1结合蛋白竞争同一结合界面，该界面的构象由结合的核苷酸决定。由于核苷酸水解速率很高，其在实验上既重要又难以控制。...

使用竞争实验比较GTP酶结合蛋白的亲和力

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

我们以分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的第一个腔内环之间的结合为例，介绍了一种利用去垢剂敏感性检测膜蛋白间相互作用的实验方案。...

膜蛋白间去垢剂敏感性相互作用的检测

本方案重点在于鉴定与肌醇磷酸或磷脂酰肌醇结合的蛋白质。该方法采用亲和层析技术，将生物素标记的肌醇磷酸或磷脂酰肌醇通过链霉亲和素固定于琼脂糖或磁珠上。通过蛋白质印迹（Western...

通过亲和层析联合蛋白质印迹或质谱法鉴定肌醇磷酸或磷脂酰肌醇相互作用蛋白

了解膜分馏和GTP酶关联免疫吸附法检测小GTP酶预基化与GTP结合的技术。该方法适用于研究Rho GTP酶翻译后修饰机制，为细胞生物学和神经科学研究提供可靠工具。

利用膜组分分离和GTP酶联免疫吸附测定法检测小GTP酶的异戊二烯化及GTP结合能力

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