婆罗洲“爆炸蚁”（Formicidae）下颌腺囊腔内容物的分离及其通过气相色谱-质谱法与MetaboliteDetector进行挥发物组分析

该方法有助于解答昆虫代谢组学中的关键问题。通过阐明挥发性物质在与其他生物相互作用中的角色，代谢物谱分析方法可用于研究蚂蚁的化学生态学。本方案的主要优势在于：它包含两个相对独立的部分，原则上可分别单独应用。

首先，对下颌腺腺体及其内容物进行物理分离；其次，对目标生物样品中的挥发性有机成分进行非靶向分析与鉴定。本实验操作将由我实验室优秀的博士生 Michaela Hoenigsberger 进行示范。在解剖蚂蚁之前，于通风橱内，使用擦镜纸和按体积比1:1配制的甲醇与水混合溶液，清洁玻璃培养皿和解剖工具。

将培养皿置于负20摄氏度保存。然后称量含硅胶聚四氟乙烯隔垫及螺口盖的1.5毫升短螺纹小瓶的质量。将小瓶置于冰上保存。

接下来，将一个冷冻的可塑形冰袋放入聚苯乙烯泡沫盒中。然后将培养皿放在冰袋上方，并将一只冷冻的蚂蚁放入培养皿中。现在，使用体视显微镜观察这只蚂蚁。

检查其腹部各室的完整性。蚂蚁的腹部区域必须完整无损。不得使用腹部扁平或体表有硬化上颚腺腺体内容物痕迹的蚂蚁。

现在，从蚂蚁体内分离下颌腺腺体囊的内含物。用镊子夹住并胸和腹柄节，然后轻轻将这些体节拉开。接着，用精细镊子夹住第四背板处的腹部末端。

用另一对镊子夹住第一腹板，轻轻将其剥离并移除。重复此操作，撕下第二和第三腹板，使下颚腺囊的胃部区域大部分暴露出来。在C.Explodens工蚁中，下颚腺囊呈黄色，但在其他物种中，颜色可能从白色、黄色到红色不等。

接下来，使用解剖针轻轻刮取腹部腔室中的成对下颌腺囊泡内的蜡状内容物，将其取出。仅需移除那些能够在不压迫蚂蚁腹部其他腺体和组织结构的前提下可分离的下颌腺囊泡内容物。无需收集下颌腺囊泡内的全部内容物。

现在，用解剖针的尖端轻轻接触下颌腺体储液部分，使其粘附在针尖上，从而将其拾取。然后将腺体内容物转移至预冷的1.5毫升短螺纹离心管中。必要时可沿管壁移动针尖，将腺体内容物涂抹在管壁上。

将收集物保持覆盖并置于冰上，直至可进行分析。在每次解剖之间，使用甲醇和水的混合液重新清洗器械和培养皿。为制备一个分析样品，需合并多只蚂蚁的腺体储器内容物。

在此情况下，合并五只C.explodens工蚁的腺体内容物。作为对照，采集包含位于下颌腺储器附近的杜氏腺（Dufour's gland）的样品。在提取腺体内容物之前，测定分析样品的质量。

然后，按组织质量的1体积加入14体积的冰冻高纯度乙酸乙酯。在低温条件下涡旋振荡混合物5分钟。接着，将样品离心10分钟，并收集上清液。

从五只蚂蚁样品中预计可获得约55至75微升上清液。将每份上清液转移至预冷的1.5毫升短螺纹小瓶中，小瓶内含0.1毫升微型插件，并使用带孔且配有红色橡胶PTFE隔垫的螺帽紧密密封小瓶。为完成一次完整的GCMS测定序列，需准备一个1.5毫升短螺纹小瓶，其中装有保留指数校准混合物，该混合物由商业可得的烷烃标准溶液用己烷稀释而成，每种化合物浓度为8毫克/毫升。

然后，准备另一瓶纯乙酸乙酯作为溶剂空白。在气相色谱仪冷却的自动进样器托盘上，依次加载：第一，溶剂空白；第二，保留指数校准混合物；第三，下颌腺贮库内容物提取物；第四，杜氏腺内容物提取物。将样品连同托盘置于冰上，运输至气相色谱仪。

将样品盘插入已冷却的自动进样器中。对每个样品，取1 µL等分试样注入气相色谱-质谱仪，在适用于目标化合物的色谱柱上进行色谱分离，例如HP-5MS UI色谱柱。

接下来，设置合适的气相色谱参数。例如，使用氦气作为载气，柱流速恒定为每分钟1毫升。采用程序升温：起始温度40摄氏度，保持2分钟，随后以每分钟10摄氏度的升温速率升至330摄氏度。

随后保持七分钟。根据这些参数，将进样口温度设置为270摄氏度。现在，如有需要，调整气相色谱-质谱的分流比。

注射，以便为目标化合物提供足够的峰形和峰强度。将辅助温度设为 350 摄氏度。针对质谱仪。

使用以下参数：质谱源温度为230摄氏度，质谱四极杆温度为150摄氏度，扫描范围从低质量数30到高质量数500，扫描速率约为每秒3次扫描。溶剂空白样品和实验样品的溶剂延迟时间为4.1分钟，保留指数校准混合物的溶剂延迟时间为6.1分钟。

测量完成后，打开气相色谱-质谱（GCMS）数据分析软件，将数据导出为AIA项目文件，保存至便携式存储设备，以便将数据转移至配备64位Linux操作系统的计算机进行分析。数据分析请参照代谢物检测软件使用说明中的文本描述。在野外采集的蚂蚁样品于-20 °C冷冻保存两天，随后转移至-80 °C保存，直至进行分析。

将五只C.explodens工蚁的下颌腺腺体内容物合并，并通过气相色谱-质谱联用技术（GCMS）进行检测。数据分析揭示了数十种推测的腺体内容物化合物。下颌腺腺体内容物提取物中的两种主要代谢物导致色谱柱过载。

因此，同一样品在更高的分流比（50:1）下再次进行了分析。通过检测杜氏腺样品，研究了杜氏腺成分对下颌腺储液腔内容物的交叉污染情况。这些污染物表现出较晚的保留时间，从约29分钟开始出现。

通过将质谱图和保留指数与内部数据库进行比对，鉴定出检测到的下颌腺腺体储存腔内容物中的潜在代谢物。通过这种方法，可确认约10%检测到的代谢物的身份，其中部分代谢物被列为化合物一至五。观看本视频后，您应能充分理解如何通过选择质谱（MS）检测方法，逐一进行代谢物的分离、提取和鉴定。

一旦掌握，若操作得当，同一样品的分离、溶剂萃取及数据采集可在约两小时内完成。数据评估所需时间将根据挥发性有机化合物谱图的复杂程度而有所不同。在进行该实验过程中，必须始终记住从样品采集到分析的整个过程均需保持样品处于低温状态。

此外，在进行该步骤之前，必须确认蚂蚁的腹部在物理结构上保持完整。该方法还可结合代谢物的相对或绝对定量，以回答其他问题，例如代谢成分、不同环境条件或罐装组分的绝对含量。该方案中的提取、检测和数据分析步骤也可便捷地应用于多种生物体系，如其他昆虫、微生物或植物。