闭环惯性微流体在患者源气道分泌物中无标签中性粒细胞富集的应用

本研究以螺旋惯性微流体闭环操作为例, 对临床气道分泌物无标签的中性粒细胞分离方法进行了论证。该方法将扩大临床对各种呼吸道疾病的体外测定。

这种方法可以帮助回答肺部疾病研究中的关键问题，例如肺炎、哮喘、囊性纤维化和慢性阻塞性肺病。该技术的主要优点是从患者气道分泌物中分离和富集患者的中性粒细胞，而不会产生垂直化学干扰。演示该程序的是我实验室的博士生 Kyungyong。

首先，保持 10 比 1 的比例，并将 PDMS 前驱体与基料和固化剂混合。接下来，在微型机械铝模具上加入 30 克 PDMS 混合物。然后在 100 毫米培养皿上再加入 20 克 PDMS 混合物。

为了进行脱气，将模具和培养皿放入真空干燥器中。脱气后，释放真空，将模具和培养皿放入 90 摄氏度的烤箱中一小时。一小时后，将霉菌和培养皿从烤箱中取出，在室温下冷却 10 分钟。

接下来，用刀切出轮廓，并在设备上用两毫米活检打孔。打孔后，固定胶带并将其粘附在设备的通道侧和 PDMS 的厚膜上。用镊子小心地剥开胶带以去除灰尘。

然后开始用空气等离子体处理设备的通道侧和普通 PDMS。然后将通道侧和普通 PDMS 与准备好的普通 PDMS 支撑层粘合。接下来，将芯片放在尺寸为 102 x 76 毫米的载玻片上。

将载玻片放入 70 摄氏度的烤箱中至少 30 分钟，以增加粘合强度。使用 10 毫升注射器在 9 毫升磷酸盐缓冲盐水中收集 1 毫升气道分泌物样本。然后在钝器移液管的帮助下，对粘液样本进行均质化。

接下来，使用 40 微米尼龙细胞过滤器过滤稀释剂并去除大块组织或血凝块。过滤完成后，将样品放在冰上。然后将 50 毫升磷酸盐缓冲盐水加入 0.5 毫升样品稀释剂中，以达到 1， 000 倍稀释样品的最终浓度。

使用流体导向器组装 PDMS 芯片，以便将均匀的流动施加到四个螺旋微通道中的每一个。接下来，使用直径为 1/16 英寸的公鲁尔接头连接到流体导向器的入口、内壁出口和外壁出口。然后将硅胶管连接到样品悬液上。

接下来，将蠕动泵连接到入口管。将外壁出口管放入废液槽中。然后将进样管的末端和内壁出口管放在样品储液槽中。

放置管路后，在样品储液槽中放置一根 50 毫升的试管，里面装满了 5 毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水。然后，为了灌注设备，以大约每分钟 1 毫升的流速开始泵送。将样品放入样品储液槽后，打开蠕动泵并将流速设置为每分钟 4 毫升。

当样品体积达到大约 1 到 2 mL 的所需体积后，停止作并断开管路。由患者气管分泌物组成的临床样品用于微流控解离法，以获得富含 PMN 的细胞群。在微流控解离方法中，获得高度纯化的 CD45、CD66B 和丰富的 PMN 细胞群。

在这里，从两个不同的患者（表示病例 1 和 2）获得的样本进行微流体解离以获得所得的细胞悬液。接下来，在对患者气道分泌物样本进行微流控检测时，从所有 6 个样本中一致地回收了 94% 的 PMN。另一方面，将患者样本进行 DTT 粘液溶解法仅回收 53.5% 的 PMN，样本之间差异很大。

通过微流体和 DTT 粘液溶解方法分离的中性粒细胞用 PMA 处理以触发中性粒细胞弹性蛋白酶释放。有趣的是，接受微流体技术的患者样本显示完整的功能细胞，PMA 刺激增加了弹性蛋白酶的释放。而粘液溶解解离后获得的细胞显示，从研究的 6 个不同的患者样本中，弹性蛋白酶的释放没有显着增加。

这是由于中性粒细胞表面受到化学干扰。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 50 分钟内完成。通过提供从临床气道分泌物中捕获中性粒细胞的解离方案，本研究中提出的方法有望扩大肺炎、哮喘、囊性纤维化和慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病的临床研究范围。

该技术的意义延伸到免疫相关肺部疾病的治疗，例如哮喘和慢性阻塞性肺病，因为所提出的方法提供了一种以无创和无标记方式捕获患者免疫细胞的方法。虽然这种方法可以提供对呼吸研究的见解，但它也可以应用于其他具有具有挑战性的生物识别技术的患者生物流体，例如鼻液、宫颈液和肠液。观看此视频后，您应该对如何使用闭环螺旋惯性微流体将中性粒细胞与患者气道分泌物分离有很好的了解。

不要忘记，处理临床样本可能非常危险。所有实验必须在带有个人防护设备的生物安全柜下进行。